本发明属于生物医药
技术领域：
，具体涉及一种评价RANKL靶点化合物体外检测的工具及方法。
背景技术：
：恶性肿瘤骨转移或称转移性骨病(MetastaticBoneDiseases，MBD)是晚期肿瘤的常见疾病，是指原发于某器官的恶性肿瘤通过血液循环或淋巴系统转移到骨骼。恶性肿瘤骨转移常导致严重的骨骼病变，可大大降低肿瘤患者的生活质量，严重者会导致病情急剧恶化甚至死亡，极大地影响了患者生存期限的延长。因此，在控制原发疾病的同时，积极预防和治疗SREs(骨转移骨相关事件)在恶性肿瘤骨转移的治疗中也具有重要的临床意义。临床前研究已发现，骨转移发生是多种蛋白相互作用、涉及多条通路的复杂系统。OPG/RANKL/RANK系统是涉及破骨细胞形成、功能和存活的关键分子，RANK和其配体RANKL为重要的骨代谢调节剂。破骨细胞及其前体细胞表达的RANK与RANKL结合后，可刺激破骨细胞的形成、活化、黏附和存活，最终导致骨吸收增加。在生物治疗药物的开发过程中，基于细胞水平的生物活性检测手段是必要的，而这种检测手段还需满足以下条件：首先，该方法的实验机理与药物的体内发生作用的机理应尽可能一致，这样才能真实反应出药物在体内的疗效；其次，该方法必须能通过方法学验证，这样才能保证检测结果的真实性、准确性和可靠性；最后，该方法应尽量简单。破骨细胞的前体细胞，会在细胞表面表达RANK，RANK会被它的配体RANKL激活，进而在胞浆内招募TRAF6，激活NF-κB信号通路，加速破骨细胞前体细胞的成熟，分化成为破骨细胞。根据该原理设计细胞生物学实验，可以用来检测RANKL蛋白的生物学活性，进而检测以RANKL为靶点的单抗药物的生物学活性。传统的用于测活的细胞为RAW264.7细胞(单核巨噬细胞系)。该单核细胞在体外环境中、RANKL存在的条件下可分化为多核的破骨样细胞，并分泌表达抗酒石酸酸性磷酸酶(Tartrate-ResistantAcidPhosphatase,TRAP)。TRAP酶活性是破骨细胞的重要标志，它的活性与破骨细胞活性呈正相关。但是该传统方法实验周期较长，操作繁琐，方法准确度和精密度较差，难以保证检测结果的稳定性和可靠性。技术实现要素：本发明针对以上存在的问题与不足，提供一种在治疗性RANKL靶点化合物开发过程中，在细胞水平评价药物体外生物学活性的报告基因检测方法。该方法能够满足方法验证过程中对专属性、准确性、精密度以及耐用性等方面的要求。与传统生物学活性评价方法相比，报告基因活性测定法具有操作简便、试验周期短、方法准确度和精密度较好，检测结果稳定和可靠等优点。为此，本发明公开了一种评价RANKL靶点化合物体外生物学活性的检测工具和方法，包括检测工具细胞的制备和检测方法的开发。本发明涉及一种用于检测RANKL靶点化合物生物学活性的工具细胞，所述细胞为稳定表达RANKL和NF-κB融合荧光素酶的HEK293细胞。所述细胞经过多次传代或条件变化，但表达水平仍然保持稳定。所述工具细胞的制备过程为在HEK293细胞中转入表达RANK和NF-κB融合荧光素酶的质粒，转入的两个基因可在同一个质粒上或位于两个不同质粒，所述质粒还含有编码对抗抗性药物的基因，转染后的细胞加入相对应的抗性药物进行筛选，筛选获得单克隆细胞。本发明所述RANKL靶点化合物选自针对RANKL靶点的单克隆抗体或其中和抗体、Fc融合蛋白、小分子化合物之一或其组合，优选为抗RANKL单抗。所述RANK基因为野生型或突变型基因，序列优选为SEQIDNo.1。所述NF-κB融合荧光素酶为全长或部分NF-κB基因融合的荧光素酶，所述荧光素酶为野生型或酶活增强的突变型，酶活增强的突变荧光素酶基因相应增强了信号放大效果，序列优选为SEQIDNo.2。所述转染方法选自电穿孔转染法、脂质体转染法或钙离子转染法。所述抗性药物选自G418、HygromycinB、Puromycin之一或其组合。所述单克隆细胞筛选方法为有限稀释法。本发明还涉及一种RANKL靶点化合物生物学活性的检测方法，所述方法包括如下步骤：(1)分别制备RANKL靶点化合物对照品溶液和供试品溶液，设置稀释浓度梯度；(2)培养稳定表达RANKL和NF-κB融合荧光素酶的HEK293细胞后，加入RANKL溶液，再加入步骤(1)中制备的对照品溶液和供试品溶液处理细胞；(3)用发光法萤光素酶检测试剂盒检测RANKL靶点化合物处理后细胞内所述荧光素酶水平变化，用酶标仪读取相对应的化学发光单位；(4)以稀释倍数或药物浓度为横坐标，以相对化学发光单位为纵坐标，得到RANKL靶点化合物的剂量效应曲线并计算供试品的生物学活性。所述梯度稀释是2～5倍稀释。所述萤光素酶检测试剂盒为LuciferaseAssaySystem。本发明能够快速、准确、高效的针对RANKL靶位治疗药物的生物学活性检测。该方法专属性好、特异性强、准确度高、操作简单快速，活性测定范围达到50％～150％；准确度在80.0％～120.0％范围内，重复性、日间精密度RSD均小于20％。若用此方法检测抗药物中和抗体，还具有血清耐受度高等特点。此外，本发明不需要昂贵的仪器和复杂的操作，完全能够满足其在检测以RANKL为靶位的单克隆抗体药物生物学活性检测及中和抗体检测。本发明中生物材料保藏信息如下，保藏单位名称：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏单位地址：中国武汉武汉大学保藏日期：2018.7.1保藏编号：CCTCCNO:C2018157分类命名：人胚肾293转染细胞HEK293-RANK&NF-κB-RE-luc附图说明图1针对RANKL靶位单克隆抗体生物学活性检测专属性评价具体实施方式以下结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅做示范只用。实施例1工具细胞构建中抗性药物浓度筛选将HEK293细胞(购自ATCC)铺于24孔板，细胞生长至融合度为90％时，消化细胞，取50％的细胞与不同浓度梯度的HygromycinB(20μg/ml、25μg/ml、40μg/ml、75μg/ml)和G418(200μg/ml、400μg/ml、600μg/ml、800μg/ml)混合，铺于24孔板。培养1～2周，以使细胞全部死亡所用最低HygromycinB和G418浓度为抗性筛选浓度。期间当板内细胞生长融合度达到90％左右时，按1：4的比例传代。结果表明抗性筛选药物G418、HygromycinB浓度分别为：800μg/ml、25μg/ml。实施例2工具细胞构建的构建将空白HEK293细胞传至T75瓶培养至融合度达到90％以上，收集细胞，按一定比例同时加入质粒A(自行构建)和质粒B(购自Promega公司)，250V电击30ms，24小时后将培养基换成新鲜的DMEM培养基(含10％FBS)。细胞密度在转染72小时后达到90％，以1:1的比例接种于新的T25瓶中，换成选择含有HygromycinB和G418培养基进行筛选，筛选一段时间，得到稳定性转染细胞系后，使用有限稀释法挑取单克隆细胞并进行扩增。向备选单克隆细胞株中加入RANKL刺激，检测响应值，选择符合要求的单克隆细胞株，即背景值及S/N高的克隆株，为工具细胞。质粒A构建过程：将合成或者PCR扩增得到的人RANK开放读码框DNA序列通过双酶切连接至真核表达质粒中。质粒B构建过程：将合成或者PCR扩增得到的人NF-κB响应元件串联荧光素酶报告基因DNA序列通过双酶切连接至真核表达质粒中。实施例3专属性评价实验以针对RANKL靶点的单克隆抗体药物(TK006，具体制备方法参考CN103232539B)、针对VEGF靶点的单克隆抗体药物(TK001，具体制备方法参考CN101935349B)、药物辅料溶液为材料，采用上述检测方法步骤进行检测，结果如图1，该方法用于anti-VEGF单抗、药物辅料缓冲盐溶液时，无法对结果进行四参数拟合，图中anti-RANKL单抗的检测结果则能够绘制出完整的量效曲线，同时满足拟合系数R2＞0.98，复孔CV％＜20％。该实验结果表明，本发明所述方法具有良好的专属性。实施例4准确度评价实验TK006工作参考品(企业内部用于TK006生物学活性测定的活性标准品)由江苏泰康生物医药有限公司生产并经过严格检测(具体制备方法参加实施例3)，制备了不同聚体含量的样品，以这些样品为材料，采用上述检测方法检测不同聚体含量样品的活性。随后以参考品为材料，制备了相对活性为50％、70％、100％、130％、150％的待测样品，采用上述检测方法检测这些样品的活性。如表1及表2所示，数据采集及分析由MolecularDeveices公司开发的SoftMaxPro7.0.2软件完成，采集的信号与药物浓度进行四参数拟合，四参数方程见图1，曲线拟合常数R2均满足大于0.98，所有浓度点中复孔RLU值的CV％满足小于20％，通过计算，方法能够检测出随着聚体含量的增高，工作参考品的活性有所下降。该实验结果表明，本方法能够灵敏地检测出样品的质量的变化，从而更好地指征样品质量。四参数拟合方程：y＝(A-D)/(1+(x/C)^B)+D表1表2表1针对RANKL靶位单克隆抗体生物学活性检测准确度评价结果汇总表(不同聚体)聚体含量％相对活性％Control100.0％2.292.8％4.390.8％6.787.9％9.386.4％表2针对RANKL靶位单克隆抗体生物学活性检测准确度评价结果汇总表(不同活性)实施例5精密度评价实验以工作参考品及待测样品为材料，对本发明所述的精密度进行评价。首先由一名实验人员采用上述检测方法步骤选取1个待测样品进行生物学活性检测，平行实验6次，考察方法的重复性，然后由2名实验人员在2天时间内用上述检测方法步骤各完成3次平行实验，考察方法的中间精密度。如表3，采用上述检测方法，由1位实验员连续进行6次平行实验，结果所拟合的四参数方程，曲线拟合常数R2均满足大于0.98，所有浓度点中复孔RLU值的CV％满足小于20％，且所有结果的偏差小于10％，说明本发明方法重复性高。如表4，采用上述检测方法，由2位实验员在至少2天时间，各进行3次平行实验，结果所拟合的四参数方程，曲线拟合常数R2均满足大于0.98，所有浓度点中复孔RLU值的CV％满足小于20％，且不同实验员所得到的结果的偏差小于10％，说明本发明方法中间精密度高。表3针对RANKL靶位单克隆抗体生物学活性检测重复性评价结果汇总表表4针对RANKL靶位单克隆抗体生物学活性检测中间精密度评价结果汇总表实施例6细胞传代稳定性评价实验以工作参考品为材料，选择不同细胞代次(3、4、7、11、21)的工具细胞，采用上述检测方法步骤，进行生物学活性检测，收集不同代次下细胞对RANKL刺激产生的量效曲线的EC50作为评价细胞是否可用的依据。结果如表5所示，结果说明细胞经过21次传代后对检测结果无明显影响。表5针对RANKL靶位单克隆抗体药物细胞生物学活性检测稳定性(细胞代次)评价结果汇总表实施例7耐用性评价实验以工作参考品和待测样品为材料，采用不同的孵育时间和显色时间以及不同的细胞数量，利用上述检测方法对同一待测样品进行检测。表6针对RANKL靶位单克隆抗体药物细胞生物学活性检测耐用性(细胞数量)评价结果汇总表表7针对RANKL靶位单克隆抗体药物细胞生物学活性检测耐用性(孵育及显色时间)评价结果汇总表综上所述，本发明构建了一种工具细胞，并建立了一种针对RANKL靶位治疗药物的生物学活性检测方法，利用该工具细胞和方法可快速，高效，大批量进行针对RANKL靶位生物治疗药物的生物学活性检测操作，通过对方法专属性，准确度，精密度及耐用性等方面的验证证实该方法稳定性强，适用性好，能够满足针对RANKL靶位治疗药物的生物学活性检测。从原理上来说，本方法也可用于临床前及临床试验采集的血清/血浆样本中抗药物中和抗体的检测，因为试验周期短，应具有较高的血清/血浆基质耐受度。本发明的范围不受所述具体实施方案的限制，所述实施方案只作为阐明本发明的各个方面的单个例子，本发明范围还包括功能等同的方法和组分。实际上，除了本文所述的内容外，本领域技术人员参照上文的描述和附图可以容易的掌握对本发明的多种改进。所述改进也落入所附权利要求书的范围内。上文提及的每篇参考文献皆全文列入本文作为参考。序列表<110>江苏泰康生物医药有限公司<120>一种评价RANKL靶点化合物生物学活性的体外检测工具和方法<160>2<170>SIPOSequenceListing1.0<210>1<211>1851<212>DNA<213>Homosapiens<400>1atggccccgcgcgcccggcggcgccgcccgctgttcgcgctgctgctgctctgcgcgctg60ctcgcccggctgcaggtggctttgcagatcgctcctccatgtaccagtgagaagcattat120gagcatctgggacggtgctgtaacaaatgtgaaccaggaaagtacatgtcttctaaatgc180actactacctctgacagtgtatgtctgccctgtggcccggatgaatacttggatagctgg240aatgaagaagataaatgcttgctgcataaagtttgtgatacaggcaaggccctggtggcc300gtggtcgccggcaacagcacgaccccccggcgctgcgcgtgcacggctgggtaccactgg360agccaggactgcgagtgctgccgccgcaacaccgagtgcgcgccgggcctgggcgcccag420cacccgttgcagctcaacaaggacacagtgtgcaaaccttgccttgcaggctacttctct480gatgccttttcctccacggacaaatgcagaccctggaccaactgtaccttccttggaaag540agagtagaacatcatgggacagagaaatccgatgcggtttgcagttcttctctgccagct600agaaaaccaccaaatgaaccccatgtttacttgcccggtttaataattctgcttctcttc660gcgtctgtggccctggtggctgccatcatctttggcgtttgctataggaaaaaagggaaa720gcactcacagctaatttgtggcactggatcaatgaggcttgtggccgcctaagtggagat780aaggagtcctcaggtgacagttgtgtcagtacacacacggcaaactttggtcagcaggga840gcatgtgaaggtgtcttactgctgactctggaggagaagacatttccagaagatatgtgc900tacccagatcaaggtggtgtctgtcagggcacatgtgtaggaggtggtccctacgcacaa960ggcgaagatgccaggatgctctcattggtcagcaagaccgagatagaggaagacagcttc1020agacagatgcccacagaagatgaatacatggacaggccctcccagcccacagaccagtta1080ctgttcctcactgagcctggaagcaaatccacacctcctttctctgaacccctggaggtg1140ggggagaatgacagtttaagccagtgcttcacggggacacagagcacagtgggttcagaa1200agctgcaactgcactgagcccctgtgcaggactgattggactcccatgtcctctgaaaac1260tacttgcaaaaagaggtggacagtggccattgcccgcactgggcagccagccccagcccc1320aactgggcagatgtctgcacaggctgccggaaccctcctggggaggactgtgaacccctc1380gtgggttccccaaaacgtggacccttgccccagtgcgcctatggcatgggccttccccct1440gaagaagaagccagcaggacggaggccagagaccagcccgaggatggggctgatgggagg1500ctcccaagctcagcgagggcaggtgccgggtctggaagctcccctggtggccagtcccct1560gcatctggaaatgtgactggaaacagtaactccacgttcatctccagcgggcaggtgatg1620aacttcaagggcgacatcatcgtggtctacgtcagccagacctcgcaggagggcgcggcg1680gcggctgcggagcccatgggccgcccggtgcaggaggagaccctggcgcgccgagactcc1740ttcgcggggaacggcccgcgcttcccggacccgtgcggcggccccgaggggctgcgggag1800ccggagaaggcctcgaggccggtgcaggagcaaggcggggccaaggcttga1851<210>2<211>1923<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<400>2gggaatttccggggactttccgggaatttccggggactttccgggaagggccagatctgg60cctcggcggccaagcttagacactagagggtatataatggaagctcgacttccagcttgg120caatccggtactgttggtaaagccaccatggaagatgccaaaaacattaagaagggccca180gcgccattctacccactcgaagacgggaccgccggcgagcagctgcacaaagccatgaag240cgctacgccctggtgcccggcaccatcgcctttaccgacgcacatatcgaggtggacatt300acctacgccgagtacttcgagatgagcgttcggctggcagaagctatgaagcgctatggg360ctgaatacaaaccatcggatcgtggtgtgcagcgagaatagcttgcagttcttcatgccc420gtgttgggtgccctgttcatcggtgtggctgtggccccagctaacgacatctacaacgag480cgcgagctgctgaacagcatgggcatcagccagcccaccgtcgtattcgtgagcaagaaa540gggctgcaaaagatcctcaacgtgcaaaagaagctaccgatcatacaaaagatcatcatc600atggatagcaagaccgactaccagggcttccaaagcatgtacaccttcgtgacttcccat660ttgccacccggcttcaacgagtacgacttcgtgcccgagagcttcgaccgggacaaaacc720atcgccctgatcatgaacagtagtggcagtaccggattgcccaagggcgtagccctaccg780caccgcaccgcttgtgtccgattcagtcatgcccgcgaccccatcttcggcaaccagatc840atccccgacaccgctatcctcagcgtggtgccatttcaccacggcttcggcatgttcacc900acgctgggctacttgatctgcggctttcgggtcgtgctcatgtaccgcttcgaggaggag960ctattcttgcgcagcttgcaagactataagattcaatctgccctgctggtgcccacacta1020gagagcttcttcgctaagagcactctcatcgacaagtacgacctaagcaacttgcacgag1080atcgccagcggcggggcgccgctcagcaaggaggtaggtgaggccgtggccaaacgcttc1140cacctaccaggcatccgccagggctacggcctgacagaaacaaccagcgccattctgatc1200acccccgaaggggacgacaagcctggcgcagtaggcaaggtggtgcccttcttcgaggct1260aaggtggtggacttggacaccggtaagacactgggtgtgaaccagcgcggcgagctgtgc1320gtccgtggccccatgatcatgagcggctacgttaacaaccccgaggctacaaacgctctc1380atcgacaaggacggctggctgcacagcggcgacatcgcctactgggacgaggacgagcac1440ttcttcatcgtggaccggctgaagagcctgatcaaatacaagggctaccaggtagcccca1500gccgaactggagagcatcctgctgcaacaccccaacatcttcgacgccggggtcgccggc1560ctgcccgacgacgatgccggcgagctgcccgccgcagtcgtcgtgctggaacacggtaaa1620accatgaccgagaaggagatcgtggactatgtggccagccaggttacaaccgccaagaag1680ctgcgcggtggtgttgtgttcgtggacgaggtgcctaaaggactgaccggcaagttggac1740gcccgcaagatccgcgagattctcattaaggccaagaagggcggcaagatcgccgtgaat1800tctcacggcttccctcccgaggtggaggagcaggccgccggcaccctgcccatgagctgc1860gcccaggagagcggcatggatagacaccctgctgcttgcgccagcgccaggatcaacgtc1920taa1923当前第1页1 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