一种测定食品中爱德万甜的方法与流程

本发明涉及了一种测定食品中甜味剂爱德万甜的方法，具体说是基于液液（固）萃取-液相色谱-串联质谱法测定食品中爱德万甜的方法，属于面向食品监测
技术领域：
，主要涉及风味发酵乳、冷冻饮品、糖果、茶饮料、咖啡饮料、植物饮料、果冻、加工水果等，具体涉及基于液液（固）萃取-液相色谱-串联质谱正离子模式测定方法。
背景技术：
：爱德万甜（advantame，n-〔n-〔3-（3-羟基-4-甲氧基苯基）丙基-l-a-天冬氨酰〕-l-苯丙氨酸-1-甲酯〕）是一种20000倍甜度的超高倍甜味剂，是阿斯巴甜的衍生产品，其化学结构与纽甜类似，水溶性好、耐热温度高，适于高温加工产品。由于爱德万甜具有和阿斯巴甜相似的感官味道，特别是在高浓度下具有显著的甜味，而苦味和酸味感非常轻微。因此，爱德万甜可替代糖类(蔗糖、葡萄糖、果糖等)，从而降低食品中的热量。同时可以用于替换现有的应用于食品工业中的高倍甜味剂，是一种多用途、低能量的新型甜味剂。2014年5月21日，美国fda发布最终法规，修订食品添加剂条例，批准高倍甜味剂advantame作为非营养甜味剂和增味剂用于除肉类及家禽之外的食品中。同年5月15日，欧盟发布法规（eu）no497/2014，修订关于食品添加剂的法规（ec）no1333/2008和（eu）no231/2012附件中有关advantame作为甜味剂使用的规定。此外，澳大利亚和新西兰食品标准局、日本厚生劳动省等允许爱德万甜作为甜味剂使用，根据联合国粮农组织/世界卫生组织食品添加剂联合专家委员会评估结果，该物质的每日允许摄入量不超过5mg/kg·bw。2017年10月30日国家卫生计生委员会正式将爱德万甜作为新型食品添加剂批准使用。尽管我国已批准允许使用爱德万甜，但目前尚未出台相关的食品中爱德万甜检测标准，而国内外针对爱德万甜检测的相关文献极为少见，主要是针对毒理学相关研究。对于食品中爱德万甜检测方法仅见关于饮料中的文献报道，主要为液相色谱法。由于爱德万甜不同于其他的甜味剂，为超高倍甜味剂，在食品中添加使用量少，相对于液相色谱法，液相色谱-串联质谱法具有高灵敏度和准确度，为了保证新型食品添加剂爱德万甜在食品中的健康使用，适时开展食品中爱德万甜的液相色谱-串联质谱法检测的方法开发尤为必要。技术实现要素：本发明的目的是基于上述现有技术状况而提供了一种快速、简便、高效，测定食品中爱德万甜的方法。本发明的一种测定食品中爱德万甜的方法，步骤如下：（1）液液或液固萃取/超声辅助提取：称取2.0g食品样品，加入提取溶剂进行萃取，涡旋振荡30s，在20-25℃下进行超声辅助提取后，10000r/min离心5min，取上层清液1ml；其中不含乳样品过微孔滤膜，待分析；含乳样品，进行液液分配净化，在1ml上层清液中添加净化溶剂，涡旋振荡30s，10000r/min离心1min后，取下层清液，过微孔滤膜，待分析；（2）标准系列工作溶液配制：首先，准确称取爱德万甜0.01g，精确至0.0001g，甲醇溶解并定容至10ml容量瓶中，制成1.0mg/ml标准储备液，然后用甲醇稀释至1.0mg/l的标准中间液；分别吸取标准中间液，用提取液将其稀释为含爱德万甜0.15ng/ml、0.3ng/ml、0.6ng/ml、1.0ng/ml、2.0ng/ml、5.0ng/ml的标准系列工作溶液；（3）定性定量分析：将标准系列工作溶液和待分析液进入液相色谱-串联质谱仪（lc-ms/ms），采用多反应监测（mrm）模式监测，外标法定量。所述步骤⑴中所述的提取溶剂为20%-30%乙腈，体积为10ml；所述的净化溶剂为正己烷，使用量1~2ml；所述的微孔滤膜为0.22μm有机膜。所述的步骤（3）中lc-ms/ms的色谱条件为：色谱柱：agilentporoshell120ecc18反相柱，色谱柱规格4.6mm×50mm，2.7μm；流动相：a相：水，b相：乙腈；梯度洗脱时间：14min；梯度洗脱程序：0→0.5min，75%a相；0.5→5min，75%→20%a相；5→8min，20%a相；8→11min，20%→75%a相；11→14min，75%a相；流速：0.3ml/min；进样量：2~10µl；色谱柱温度：25~35ºc。所述的步骤（3）中lc-ms/ms的质谱条件为：离子源：电喷雾离子源；扫描方式：正离子扫描(esi+)；检测方式：多反应监测(mrm)；离子化电压(is)：5000~5500v；雾化气(gas1):50-60psi；辅助气(gas2):50-60psi；气帘气压力(cur)：30~35psi；雾化温度(tem)：500-600℃。a)定性分析：利用lc-ms/ms法测定试样和建立标准工作曲线，若试样中检出的色谱峰的保留时间与相应标准物质色谱峰的保留时间一致，允许偏差小于±2.5%；试样中各组分定性离子的相对丰度与浓度接近的混合标准工作溶液中对应的定性离子的相对丰度进行比较，偏差不超过表1规定的范围，则可判定样品中存在对应的待测物。表1定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差相对离子丰度＞50%＞20%至50%＞10%至20%≦10%允许的最大偏差±20%±25%±30%±50%b）定量分析：利用lc-ms/ms法测定混合标准系列工作溶液，得到相应的标准溶液的色谱峰面积，以混合标准工作液的浓度为横坐标，以色谱峰的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线；再以相同条件测定待测样品，得到待测样品的色谱峰面积，根据标准曲线得到待测液中各组分的浓度。试样中各待测组分的响应值应在标准曲线的线性响应范围内，如果含量超出范围，则重新取样分析，然后用乙腈稀释到适当浓度后分析。⑸结果计算：计算公式：……………………………………(1)式（1）中：x—样品中待测组分的含量，单位为微克每千克（μg/kg）；c—从标准曲线中读出的测定液中各待测组分的浓度，单位为微克每升（μg/l）；m—试样称取的质量，单位为克（g）；v—试样溶液定容体积，单位为毫升（ml）。本发明所述标准储备液可在-18℃下避光存放6个月。本发明所述混合标准系列工作液临用时配制。本发明所述液相色谱-串联质谱法测试条件如下：所述的lc-ms/ms的色谱条件如下：色谱柱：agilentporoshell120ecc18反相柱，色谱柱规格4.6mm×50mm，2.7μm；流动相：a相：水，b相：乙腈；梯度洗脱时间：14min；梯度洗脱程序：0→0.5min，75%a相；0.5→5min，75%→20%a相；5→8min，20%a相；8→11min，20%→75%a相；11→14min，75%a相；流速：0.3ml/min；进样量：2µl；色谱柱温度：30ºc。所述的lc-ms/ms的质谱条件如下：离子源：电喷雾离子源；扫描方式：正离子扫描(esi+)；检测方式：多反应监测(mrm)；离子化电压(is)：5500v；雾化气(gas1):50psi辅助气(gas2):50psi气帘气压力(cur)：35psi；雾化温度(tem)：550℃；定性离子对、定量离子对及其他质谱参数见表2。表2爱德万甜的定性离子对、定量离子对和质谱分析参数*：定量离子本发明的有益效果在于，基于液液（固）萃取-液相色谱-串联质谱正离子模式建立的食品中爱德万甜的检测方法，样品经水和乙腈进行溶剂提取后，再辅以超声提取，不含乳样品经微孔滤膜过滤后，在梯度条件下进行串联质谱分析；而含乳样品提取液经正己烷液液分配净化后，在梯度条件下进行串联质谱分析。化合物的平均回收率在85.6%-110.2%之间，检出限：当称样量为2g时，检出限为0.3μg/kg，定量限为1.0μg/kg。本发明具有前处理简单、样品及溶剂使用量少、基质干扰小、分析速度快、灵敏度高和重现性好等优点，能适用于大批量样品的快速检测，满足日常检测工作的需要。附图说明图1为本发明实施例爱德万甜的二级质谱图，即定性和定量离子选择图；图2为本发明实施例发酵乳中爱德万甜的多反应监测（mrm）色谱图，即爱德万甜高效液相色谱-串联质谱mrm色谱图。具体实施方式为使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合附图及以下实施例进一步阐释本发明的技术方案，但不作为对本发明保护范围的限制。实施例1⑴液液萃取：称取2.0g样品，置于20ml聚丙烯离心管中，加入5ml20%乙腈溶液，涡旋振荡30s，超声处理5min，8000r/min离心5min后，将上层清液转移到10ml容量瓶中。用20%乙腈溶液定容，不含乳样品过滤膜（0.22μm，有机相），待分析；含乳样品，待净化。⑵液固萃取：称取2.0g样品，置于20ml聚丙烯离心管中，加入5ml20%乙腈溶液，涡旋振荡30s，超声处理5min，8000r/min离心5min后，将上层清液转移到10ml容量瓶中。用20%乙腈溶液定容，其中不含乳样品过滤膜（0.22μm，有机相），待分析；含乳样品，待净化。⑶对待净化的样品液液分配净化：在1ml上层清液中添加2ml正己烷，涡旋振荡30s，10000r/min离心1min后，取下层清液，过微孔滤膜，待分析。⑷标准系列工作溶液：首先，准确称取爱德万甜0.01g（精确至0.0001g），用甲醇溶解并定容，得1.0mg/ml标准储备液，再用甲醇稀释至1.0mg/l混合标准中间液；分别准确吸取标准中间液适量，用提取液将其稀释为含爱德万甜0.15ng/ml、0.3ng/ml、0.6ng/ml、1.0ng/ml、2.0ng/ml、5.0ng/ml的标准系列工作溶液。⑸定性定量分析：将标准系列工作溶液和待分析液进入液相色谱-串联质谱仪（lc-ms/ms），采用多反应监测（mrm）模式监测，外标法定量。定性定量分析具体测试条件如下：lc-ms/ms色谱条件：色谱柱采用agilentporoshell120ecc18柱（4.6mm×50mm，2.7μm）色谱柱。流动相为：a相为水，b相为乙腈；梯度洗脱程序：0→0.5min，75%a相；0.5→5min，75%→20%a相；5→8min，20%a相；8→11min，20%→75%a相；11→13min，75%a相。流速为0.3ml/min；进样量为2µl；色谱柱温度为30ºc。lc-ms/ms的质谱条件：离子源为电喷雾离子源；扫描方式为正离子扫描(esi+)；检测方式为多反应监测(mrm)；离子化电压(is)为5500v；雾化气(gas1)为50psi；辅助气(gas2)为50psi；气帘气压力(cur)为35psi；雾化温度(tem)为500℃。本发明在进行色谱柱的选择时，分别选用了watershsst3柱（2.1mm×100mm，2.5μm）、agilentporoshell120ecc18柱（4.6mm×50mm，2.7μm）、agilentxdbc18柱（4.6mm×50mm，1.8μm）、kinetexxbc18柱（3.0mm×150mm，2.6μm）和watersbehc18柱（2.1mm×50mm，1.7μm）五种不同柱填料和不同封端色谱柱。结果表明，在本研究中设定的流动相梯度条件下，爱德万甜在五种色谱柱上都有很好的色谱保留行为，综合考虑各待测化合物的峰形、响应、分离度及商品价格，最终选取agilentporoshell120ecc18柱（4.6mm×50mm，2.7μm）色谱柱。本发明在进行流动相的选择时，考察了甲醇/水体系和乙腈/水体系，并在此基础上进行酸性改性剂的比较，在流动相中添加0.1%甲酸、0.2%甲酸、0.1%乙酸、0.2%乙酸。结果表明在无酸条件下，乙腈/水体系，经梯度洗脱能够实现爱德万甜最优的基线分离和最优的质谱信号采集。本发明在提取溶剂的选择时，因所涉及的化合物都易溶于甲醇、乙腈等极性有机试剂，故在样品提取过程中首先选用实验室常用的甲醇、乙腈、甲醇/水、乙腈/水作为提取溶剂。实验结果表明甲醇、乙腈以及20%~30%的甲醇/水和20%~30%的乙腈/水对爱德万甜的提取效率都能够达到85%以上，为了节省有机溶剂的使用量并考虑到乙腈对含乳样品蛋白沉淀作用显著，为达到较好的净化效果，本发明确定20%乙腈作为提取溶剂。本发明实施例中，爱德万甜购自sigma公司（美国），试剂纯度都大于99.0%。⑹结果与分析a)在选定的色谱和质谱条件下，根据所确定系列浓度的标准溶液，以目标物的浓度为横坐标（x），色谱峰的峰面积为纵坐标（y），进行回归分析，结果见表3，由表3可见，爱德万甜在0.05-40μg/l范围内，具有良好的线性，相关系数r＞0.997。根据国际纯粹和应用化学联合会(iupac)对检出限的定义，稀释并检测系列混合标准溶液，计算信噪比（s/n），以s/n=3为检出限（lod），以s/n=10为定量限（loq）。向不含目标物质的空白样品中定量添加混合标准溶液，经处理后进行检测，爱德万甜的lod为1μg/kg，方法的loq为3.5μg/kg。表3爱德万甜的线性方程、相关系数、线性范围（n=6）、检出限和定量限b)选取不含爱的万甜的不同食品样品，按照三个浓度水平进行添加回收率和精密度试验，每个水平做6个平行，按照方法规定的操作步骤进行测定，考察方法的平均回收率，见表4。结果表明爱德万甜加标平均回收率介于85.6%-110.2%，相对标准偏差（rsd）介于1.5%~4.8%，均满足残留分析要求。表4不同食品中爱德万甜的加标回收率及精密度(n=6)当前第1页12