一种CST1化学发光检测试剂盒及其检测方法与流程

本发明属于免疫诊断领域，涉及一种cst1化学发光检测试剂盒，还涉及利用该试剂盒的检测方法。
背景技术：
半胱氨酸蛋白酶抑制剂sn(cst1)是人类半胱氨酸蛋白酶抑制剂家族成员，由cst1基因编码的含141个氨基酸的蛋白质，分子量为16.4kda。cst1分子中含有两个二硫键，为典型的分泌蛋白，分布于体液和分泌物中，如眼泪、唾液、血清、血浆等。随着对肿瘤发病机理研究的不断深入，发现cst1作为组织蛋白酶是半胱氨酸蛋白酶的内源性抑制剂家族成员之一，在肿瘤的发生、发展、浸润和转移过程中起着非常重要的作用。研究结果显示，半胱氨酸蛋白酶抑制剂家族成员在不同肿瘤中的表达水平有所上升，例如cystatinc在卵巢癌和头颈部癌症中的表达有不同水平的上升，cystatina在非小细胞肺癌中的表达水平有所增加。据报道cst1能够用于食管癌、肺癌、乳腺癌中均有异常表达。cst1的定量检测具有重要的临床意义。目前样本中cst1的检测方法主要为酶联免疫法，酶联免疫法存在着操作繁琐、检测时间长、自动化程度低、受人为因素影响较大等诸多弊端；且现有cst1检测体系中多采用多克隆抗体；抗体特异性差，不能区分cst1高度同源家族蛋白，由于其抗体本身效价或特异性的原因，也使得其对cst1检测的临床效用受到局限，降低了样本检测的特异性，同时也对灵敏度产生一定的影响。技术实现要素：有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种cst1化学发光检测试剂盒；本发明的目的之二在于提供利用所述的cst1化学发光检测试剂盒的检测方法。为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：1.一种cst1化学发光检测试剂盒，包括包被有捕获抗体的化学发光板、辣根过氧化物酶标记的检测抗体、底物液以及洗涤浓缩液，所述捕获抗体为杂交瘤细胞株4g2分泌的单克隆抗体，所述检测抗体为杂交瘤细胞株4e7分泌的单克隆抗体，所述杂交瘤细胞株4g2保藏号为cgmccno.15199，杂交瘤细胞株4e7保藏号为cgmccno.15198。优选的，所述洗涤浓缩液为含有吐温20的磷酸盐缓冲液，所述吐温20的体积分数为0.5-3％，洗涤浓缩液的ph为7.0-7.8。优选的，所述化学发光板上捕获抗体的包被量为100μl，浓度为1-5μg/ml。优选的，所述辣根过氧化物酶标记的检测抗体用量为100μl，浓度为1-500ng/ml。更优选的，还包括校准品，所述校准品为cst1蛋白溶液。本发明中，所述化学发光底物液为所述化学发光底物液为含辣根过氧化物酶发光底物的溶液。2、利用所述的cst1化学发光检测试剂盒的检测方法，包括以下步骤：(1)取出试剂盒和血清样品，18～25℃平衡15-30min，并稀释洗涤浓缩液至工作浓度；(2)取出包被有捕获抗体的化学发光板，每孔加入100μl校准品和血清样品，37℃孵育60min；(3)甩干孔内混合物，用洗涤液注满各孔，静置20秒，甩干孔内液体，重复5次，最后拍干；(4)每孔分别加入辣根过氧化物酶标记的检测抗体100μl，37℃孵育60min；(5)甩干孔内混合物，用洗涤液注满各孔，静置20秒，甩干孔内液体，重复5次，最后拍干；(6)每孔加入化学发光底物100μl，反应并测定各孔发光强度；(7)根据校准品浓度与光强度绘制校准曲线，样本光强度在校准曲线上相对应的浓度值即为待测样品的测定浓度。本发明的有益效果在于：(1)本发明采用的捕获抗体和检测抗体均为特异性单克隆抗体，较多克隆抗体和其它单克隆抗体相比，试剂盒的灵敏度和特异性均有很大程度的的改善；(2)本发明试剂盒线性范围达到6.25～1600u/ml，最低检测限可达3u/ml。本试剂盒检测食管癌样本，在特异性85％时，灵敏度可达到80％。cst1定量检测试剂盒能够用于食管癌的早期诊断、治疗过程中的疗效评估以及治疗后的转移复发监控。附图说明为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：图1为重组cst1蛋白sds-page电泳图。图2为4g2和4e7抗体sds-page电泳图。图3为cst1截断蛋白免疫印迹wb检测结果。图4是cst1校准曲线，其中，y轴代表发光值对数值，x轴代表cst1校准品的浓度对数值。图5是cst1化学发光检测试剂盒检测食管癌的roc曲线。生物保藏本发明中杂交瘤细胞株4g2和4e7，于2017年12月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，杂交瘤细胞株4g2保藏号为cgmccno.15199，杂交瘤细胞株4e7保藏号为cgmccno.15198，分类命名为杂交瘤细胞株4g2和杂交瘤细胞株4e7。具体实施方式以下结合具体实施例对本发明做进一步详细说明，应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。实施例1、cst1的重组蛋白表达和纯化从食管癌癌组织提取rna后经随机引物rt-pcr得到的cdna为模板，设计引物进行cst1基因的克隆，引物具体为：cst1-f：5’-cccaagcttgccaccatggcccagtatctgagtacc-3’)(seqidno.1)；cst1-r：5’-ggattcttgacacctggatttcac-3’(seqidno.2)。扩增的cst1基因插入到含有6×his标签的pcdna3.1载体上，得cst1-pcdna3.1。然后将cst1-pcdna3.1转化至dh5α，挑取阳性克隆并大量培养后，用高纯度质粒提取试剂盒提取重组质粒cst1-pcdna3.1。重组质粒转入293t细胞中，并同时转染pcdna3.1空载体作为阴性对照，分别在含10％胎牛血清的dmem培养基在37℃、5％co2条件下培养72h，收集上清，利用0.22μm滤膜过滤上清液。将所得500ml滤液进行非变性条件下的ni-nta亲和层析，平衡缓冲液为50mmpbs、10mm咪唑、150mmnacl，ph7.6。上样完毕后，清洗10ml；用50mmpbs250mm咪唑、150mmnacl，ph7.6洗脱，收集洗脱液。利用3kd超滤管浓缩蛋白溶液，将蛋白保存于ph7.450mmpbs缓冲液中，-80℃保存。纯化的蛋白进行sds-page电泳纯度鉴定，分子量大小在15kd左右，灰度分析表明蛋白纯度达到95％以上，见图1。实施例2、cst1单克隆抗体杂交瘤细胞株的制备小鼠免疫：用cst1蛋白免疫3批balb/c小鼠，每次3只。每只小鼠每次免疫50μg抗原。首次免疫cst1抗原与弗氏完全佐剂1:1混合，随后cst1与弗氏不完全完全佐剂1:1混合，每隔两周免疫一次，共免疫3次，第三次免疫十天后断尾采血，检测血清效价。杂交瘤细胞融合：检测小鼠血清效价达到1:100000后用cst1抗原(不含佐剂)腹腔加强免疫(30μg)，3天后无菌取免疫小鼠的脾细胞与sp2/0小鼠骨髓瘤细胞大约按4:1比例混合在50ml离心管，用培养基洗涤两次后弃上清，然后加入1ml预热50％peg-1450作用1min后，水浴中缓缓摇动90s，立即缓慢滴加37℃预热的无血清dmem培养基15ml，37℃水浴5min，然后补加无血清dmem培养基至40ml，1000rpm/mim离心10min弃上清，加40ml预热的hat培养基，轻吹打混匀，转移至已铺饲养细胞的96孔培养板中，每孔100μl，置培养箱中培养。鉴定细胞上清，对阳性杂交瘤进行3次克隆筛选，得到分泌特异单克隆抗体的杂交瘤细胞4株，分别为4g2、4e7和4f7。实施例3、cst1单克隆抗体制备、纯化、效价检测及特异性分析单抗腹水制备：将筛选的4种杂交瘤细胞株分别在培养基中培养至90％密度，收集细胞，将细胞稀释至3×106个/ml。10-12周balb/c小鼠适应性饲养一周后，腹腔注射免疫抑制剂液体石蜡，0.5ml/只，7d后腹部接种稳定分泌抗体、状态较好的杂交瘤细胞，约(1-2)-106/只，7-10d后，待小鼠腹部膨胀，抽取腹水，合并收集腹水上清。抗体纯化：收集小鼠腹水，用0.45μm的滤器过滤溶液，加入终浓度为50％的硫酸铵固体，4℃搅拌均匀后，静置1h，12000rpm收集沉淀，并用50mmpbs溶液重溶沉淀。将得到的粗纯化抗体以1ml/min流速上样到proteina-sepharose亲和层析柱中，用5个柱体积的结合缓冲液(50mmpbs，ph7.0)清洗，然后用0.1m甘氨酸-盐酸溶液ph2.7洗脱抗体(每个收集管预先加入1mph9.0tris缓冲液中和)，得到目的抗体，并用50mmpbs溶液透析3次。将透析后的抗体进行10％sds-page电泳，结果显示，3种抗体在55kd与25kd处有条带，灰度分析纯度均大于90％，4g2和4e7抗体sds-page见图2所示。单克隆抗体效价检测：以1μg/ml的重组cst1蛋白的碳酸盐缓冲液(ph9.5)，100μl体积4℃过夜包被微孔板，梯度稀释各个抗体(1：1000，1：2000，1：4000，1：64000、1:128000)，加入羊抗鼠igg-hrp(50ng/ml)，确定纯化后单克隆抗体效价(s/n>2.1)，4g2、4e7和4f7单克隆抗体效价均为1：128000。单克隆抗体特异性分析：分别以1μg/ml的cst1、cst4和cst3蛋白的cbs缓冲液100μl体积4℃过夜包被微孔板，将各个抗体倍比稀释(500ng/ml、250ng/ml、125ng/ml、62.5ng/ml、31.25ng/ml、15.625ng/ml、7.8125ng/ml和0ng/ml)后加入到微孔反应板，然后加入羊抗鼠igg-hrp(50ng/ml)，结果如表1所示。结果确定4g2特异性识别cst1蛋白，4e7和4f7与cst1和cst4蛋白均可反应，故4g2可作为试剂盒的捕获抗体用于特异性识别cst1。表1、单克隆抗体特异性分析实施例4、cst1单克隆抗体配对验证以3μg/ml4g2抗体包被微孔反应板，加入100μl不同浓度(6.25-1600u/ml)的cst1校准品，37℃孵育60min，洗涤后分别加入100μl浓度为100ng/ml的hpr标记的4e7抗体和4f7抗体，并于37℃孵育60min，洗涤后加入底物于酶标仪测定其吸光度，结果如表2所示。从结果上看，4g2与4e7配对更佳，灵敏度和吸光度更高。表2.cst1单克隆抗体配对结果校准品u/ml4e74f700.0540.059500.1550.0571000.2570.0622000.4570.1244000.8020.2338001.3050.45316001.9630.819实施例5、cst1单克隆抗体表位鉴定重组截断cst1蛋白构建表达：根据cst1蛋白序列，设计了n、m、c端的序列以及cst1全长蛋白(记为cst1-f)，连接表达载体pet30a，并转入表达菌株bl21(de3)中。在lb培养基中，iptg0.1mmol/l25℃条件下过夜诱导cst1截断重组蛋白可溶性表达。原核重组表达经6×his标签亲和纯化，纯化后的蛋白进行sds-page电泳，纯度均在90％以上。cst-n片段(21-47)：wspkeedriipggiynadlndewvqra(seqidno.3)；cst-m片段(48-93)：lhfaiseynkatkddyyrrplrvlrarqqtvggvnyffdvevgrti(seqidno.4)；cst-c片段(112-141)：lqkkqlcsfeiyevpwenrrslvksrcqes(seqidno.5)cst-f片段(21-141)：wspkeedriipggiynadlndewvqralhfaiseynkatkddyyrrplrvlrarqqtvggvnyffdvevgrtictksqpnldtcafheqpelqkkqlcsfeiyevpwenrrslvksrcqes(seqidno.6)蛋白免疫印迹法wb确认抗体识别表位：重组蛋白cst1-n/m/c、cst1全长4种蛋白取5μg上样，进行15％sds-page电泳。电泳完成后，150v恒压条件下，蛋白转入0.45pgmpvdf。转膜完成后利用含5％bsa的pbst溶液37℃封闭两小时。分别用5μg/ml的抗体(4g2/4e7)溶液37℃孵育1小时。孵育完成后，加入50ng/ml的兔抗鼠igg-hrp孵育1小时。清洗完成后，加入dab显色液进行显色。cst1全长蛋白作为阳性对照，cst1-n/m/c片段位置棕色沉淀物质，则表明抗体识别该目的片段。结果显示，4g2抗体识别cst1蛋白的c段，4e7抗体识别cst1蛋白m段，见图3。实施例6、hrp标记的检测抗体制备取50μl5mg/ml的检测抗体4e7，加入150μl0.05m、ph9.3的碳酸盐缓冲液，混匀，然后加入1μl1mg/ml的辣根过氧化物酶混匀，室温下避光反应，1-2h后取出，用50kd的超滤管处理，超滤过程中首先分别用纯净水及pbs缓冲液进行处理，最后加入得到的hrp标记的检测抗体溶液，收集离心管中的液体至保存管，得到hrp标记的4e7抗体溶液，，分装保存于4℃备用。实施例7、cst1化学发光检测方法以化学发光仪为检测工具，以方法学模式为双抗夹心法，即取出试剂盒和血清样品，室温(18～25℃)平衡15-30min，并稀释洗涤浓缩液(吐温20的体积分数为0.5-3％磷酸盐缓冲液，ph为7.0-7.8)至工作浓度。然后取出包被有4g2抗体的化学发光板，包被液为100μl浓度为1-5μg/ml的4g2抗体溶液，每孔加入100μl校准品和血清样品，37℃孵育60min。甩干孔内混合物，用洗涤液注满各孔，静置20秒，甩干孔内液体，重复5次，最后拍干。之后每孔分别加入hrp标记的4e7抗体100μl至终浓度为1-500ng/ml，37℃孵育60min。甩干孔内混合物，用洗涤液注满各孔，静置20秒，甩干孔内液体，重复5次，最后拍干。然后每孔加入化学发光底物100μl(化学发光底物外购自北京科跃中楷生物技术有限公司，产品货号dw-013，具体为辣根过氧化物酶(hrp)发光底物，分a液和b液两瓶，a液主要成分为鲁米诺(luminol)及发光增强剂，b液主要成分为过氧化物及增强剂，使用时混合)，反应并测定各孔发光强度。从校准曲线计算出被测样品的cst1含量。校准曲线线性范围6.25～1600u/ml，图4为cst1校准曲线，其中y轴代表发光值对数值，x轴代表cst1校准品的浓度对数值。实施例8、cst1化学发光检测试剂盒性能评价(1)灵敏度检测：参照clsiep17-a文件推荐实验方案，计算cst1化学发光检测试剂盒的灵敏度，结果为cst1的灵敏度为1.5u/ml。(2)线性检测：cst1蛋白对浓度为0u/ml、6u/ml、20u/ml、60u/ml、200u/ml、600u/ml、1800u/ml校准品做线性分析，计算线性相关系数，r>0.99，线性范围为6-1800u/ml。(3)精密度测定：取浓度为25u/ml和200u/ml两个浓度cst1样品，每个浓度各做10个平行，用三批试剂盒进行检测，计算试剂盒批内及批间差，结果表明该试剂盒批内及批间差均小于5％。(4)干扰性实验：取混合血清分别添加干扰物，包括胆红素、血红蛋白、抗坏血酸、甘油酯，添加比例为1:20，分别测定混合血清及添加了各种干扰物后混合血清的检测值。按照《wst416-2013干扰实验指南》进行评价。结果表明，干扰性均达到了文件标准，可用与临床实验室cst1的准确评估。实施例9、cst1化学发光检测试剂盒分析灵敏度对比实验分别用化学发光检测方法和传统的酶联免疫吸附法对浓度为0u/ml的样本稀释液进行检测，重复测定20次，得出20次测量结果的rlu值(相对发光值)，计算其平均值(m)和标准差(sd)，得出m+2sd，将该发光值代入校准曲线计算得到相应的浓度值。采用化学发光检测方法得到的浓度值为3u/ml，相对于传统的酶联免疫吸附法分析灵敏度30u/ml，提高了约10倍。分析灵敏度的提升不仅因为方法学的改进，也源于特异性抗体的选用。实施例10、cst1化学发光检测试剂盒临床应用从医院收集食管癌血清样本100例，正常人血清样本100例。按照实施例7中的过程进行检测，检测所得结果如表3所示，统计学指标如表4所示，cst1的auc如表5所示。图5显示了依据检测结果绘制的roc曲线。表3.试剂盒测定cst1的统计结果血清样本例数cst1阳性cst1阴性正常人1001089食管癌1006931表4.试剂盒测定cst1的统计学指标样本例数(食管癌和nc)检测参考值敏感性特异性200例>101u/ml80％85％表5.cst1的auc标志物auc95％cicst10.8630.801～0.964如表3、表4和表5中数据显示，依据约登指数，确定cst1的cutoff值为101u/ml，在此条件下，特异性为85％，cst1的灵敏度为80％；cst1的roc曲线下面积为0.863，现有试剂盒的曲线下面积为0.854，灵敏度为78％，特异性为85.1％。因此，本发明试剂盒的临床效用较现有专利有了较大改善。综上所述，本发明的试剂盒可用于定量检测临床样本的cst1含量，对于其方法学和原材料抗体的发明和创新有助于试剂盒灵敏度的改善，从而更好的发挥该标志物在临床上的应用，使其用于测cst1蛋白过量表达或诊断以cst1蛋白异常表达为表征的疾病的产品的应用。最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。序列表<110>上海良润生物医药科技有限公司<120>一种cst1化学发光检测试剂盒及其检测方法<160>6<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>36<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1cccaagcttgccaccatggcccagtatctgagtacc36<210>2<211>24<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2ggattcttgacacctggatttcac24<210>3<211>27<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>3trpserprolysglugluaspargileileproglyglyiletyrasn151015alaaspleuasnaspglutrpvalglnargala2025<210>4<211>46<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>4leuhisphealaileserglutyrasnlysalathrlysaspasptyr151015tyrargargproleuargvalleuargalaargglnglnthrvalgly202530glyvalasntyrphepheaspvalgluvalglyargthrile354045<210>5<211>30<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>5leuglnlyslysglnleucysserphegluiletyrgluvalprotrp151015gluasnargargserleuvallysserargcysglngluser202530<210>6<211>121<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>6trpserprolysglugluaspargileileproglyglyiletyrasn151015alaaspleuasnaspglutrpvalglnargalaleuhisphealaile202530serglutyrasnlysalathrlysaspasptyrtyrargargproleu354045argvalleuargalaargglnglnthrvalglyglyvalasntyrphe505560pheaspvalgluvalglyargthrilecysthrlysserglnproasn65707580leuaspthrcysalaphehisgluglnprogluleuglnlyslysgln859095leucysserphegluiletyrgluvalprotrpgluasnargargser100105110leuvallysserargcysglngluser115120当前第1页12