本发明涉及生物医药领域，具体而言，涉及一种膀胱癌检测试剂盒。
背景技术：
：在泌尿系统肿瘤当中，膀肌癌的发病率高居首位，近年来膀肌癌的发病率有上升趋势。大部分膀肤癌患者确诊时处于分化良好或中等分化的非肌层浸润性膀胧癌，其中约10％的患者最终发展为肌层浸润性膀肤癌或转移性膀肤癌。在保留膀肤的各种手术治疗中，约50％在2a内肿瘤可能复发，约10％～15％的复发肿瘤恶性程度有增加趋势，因此长期随访早期发现肿瘤复发是膀肮肿瘤治疗成功的关键之一。目前，临床上诊断措施主要有尿脱落细胞学检查、膀胱镜检及组织活检。尿脱落细胞学检查特异性高，但敏感性低，尤其易漏检c1级肿瘤(bta90％)。而膀胱镜是有创检查，不能早期诊断且患者依从性差。现阶段，急迫研发出一种能够作为膀胱癌早期诊断又快速定性的一种检测方法，技术实现要素：本发明旨在提供一种膀胱癌检测试剂盒，以实现膀胱癌早期诊断或预后监控的快速定性的检测。为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种膀胱癌检测试剂盒。该膀胱癌检测试剂盒包括抗-nmp22的单克隆抗体和多克隆抗体，单克隆抗体和多克隆抗体是利用人类numa1基因通过多位点抗原序列列阵设计、重组质粒构建、抗原原核表达、抗原蛋白纯化及动物免疫反应和抗体纯化所得到的，其中，多位点抗原序列列阵是通过抗原蛋白结构分析计算及叠瓦式设计获得的能够覆盖numa1抗原决定簇的氨基酸序列。进一步地，多位点抗原序列列阵具有表1中所示的氨基酸序列；表1进一步地，单克隆抗体和多克隆抗体由辣根过氧化酶标记作，抗体浓度为1mg/ml。进一步地，动物免疫反应是免疫balb/c小鼠及新西兰大白兔。进一步地，重组质粒构建时，所采用的引物序列见表2：表2primer名称引物序列(5'to3')c001f(seqidno：31)cgggatccatgtctccagcttctcccatggcoo1r(seqidno：32)ggaattccttctctgtcttcaggtcctggcc002f(seqidno：33)cgggatccatggggaccccactcagtatcacccoo2r(seqidno：34)ggaattcgttgccataatcgggagaacccagc029f(seqidno：35)cgggatccctcgaactcccgacctcagatgatcoo29r(seqidno：36)ggaattccttgatctcaggagttgaaggctgc030f(seqidno：37)cgggatcctgggactacaggcgcccaccacco30r(seqidno：38)ggaattccctgaggtcaggagtttgagacca进一步地，抗-nmp22的单克隆抗体和多克隆抗体包被在多孔板上。进一步地，还包括：人nmp22标准品1～6个、结合抗体、酶标二抗、洗涤液、样本稀释液、显色剂和终止液。进一步地，试剂盒应用于采用双抗夹心多位点elisa检测方法。进一步地，当采用双抗夹心多位点elisa检测方法时，其中，单克隆抗体和多克隆抗体作为包被抗体，包被浓度为2μg/ml。应用本发明的技术方案，多位点抗原序列列阵通过抗原蛋白结构分析计算及叠瓦式设计获得的能够覆盖numa1抗原决定簇的氨基酸序列，极大地提高抗体制备的成功率及膀胱癌检测试剂盒的灵敏度和特异性。附图说明构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：图1示出了实施例1中多位点抗原序列列阵设计及anti-nmp22检测图示意图；图2示出了实施例1的nmp22蛋白elisa标准曲线图；图3示出了实施例1中膀胱癌尿液nmp22检测与其他检测比较图；图4示出了实施例1的nmp22尿蛋白浓度检测图；以及图5示出了实施例1的膀胱癌尿检样品预处理前后及nmp22尿蛋白纯度比较。具体实施方式需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。根据本发明一种典型的实施方式，提供一种膀胱癌检测试剂盒，包括抗-nmp22的单克隆抗体和多克隆抗体，单克隆抗体和多克隆抗体是利用人类numa1基因(entrezgene:4926)通过多位点抗原序列列阵设计、重组质粒构建、抗原原核表达、抗原蛋白纯化及动物免疫反应和抗体纯化所得到的，其中，多位点抗原序列列阵是通过抗原蛋白结构分析计算及叠瓦式设计获得的能够覆盖numa1抗原决定簇的氨基酸序列。抗原蛋白结构是三维的，就像是一个线团，抗原决定簇就是线团上的一个点，而与其临近的氨基酸序列是靠结构分析、计算出来的，不是简单的线性“叠瓦式设计”，因为，二维线性结构的相邻序列，在有活性的蛋白三维结构中，可能并不相邻，有时会相距甚远，基于上述限定，本领域技术人员能够理解并完成多位点抗原序列列阵的设计。应用本发明的技术方案，多位点抗原序列列阵通过抗原蛋白结构分析计算及叠瓦式设计获得且覆盖numa1抗原决定簇的氨基酸序列，极大地提高抗体制备的成功率及膀胱癌检测试剂盒的灵敏度和特异性。优选的，多位点抗原序列列阵具有表1中所示的氨基酸序列；表1上述抗原抗体制备的成功率很高。优选的，单克隆抗体的质量比例为1b9：5f6：6d2＝2:1:3，此配比得到的单克隆抗体可提高检测灵敏度。根据本发明一种典型的实施方式，单克隆抗体和/或多克隆抗体由辣根过氧化酶标记作，抗体浓度为1mg/ml。优选的，动物免疫反应是免疫balb/c小鼠及新西兰大白兔。优选的，重组质粒构建时，所采用的引物序列见表2。表2优选的，抗-nmp22的单克隆抗体和多克隆抗体包被在多孔板上，方便后续的检测操作。根据本发明一种典型的实施方式，试剂盒还包括：人nmp22标准品1～6个、结合抗体、酶标二抗、洗涤液、样本稀释液、显色剂和终止液。根据本发明一种典型的实施方式，试剂盒应用于采用双抗夹心多位点elisa检测方法。优选的，当采用双抗夹心多位点elisa检测方法时，其中，单克隆抗体和/或多克隆抗体作为包被抗体，包被浓度为2μg/ml。在本发明一种典型的实施方式中，构建重组质粒pet30a-nmp22，pgex-6p-1-nmp22，以大肠杆菌bl21为表达宿主，进行蛋白表达纯化，得到his/gst原核表达蛋白，然后免疫balb/c小鼠及新西兰大白兔，得到抗-nmp22的单、多克隆抗体。在本发明一种典型的实施方式中，本发明可以采用独特的计算机数据自动采集分析系统，例如本发明可以使用bio-rad680microplatereader与计算机相连接，实现检测数据的自动采集、分析及检测报告的自动打印输出，方便了在医院检验科的医务人员使用及普及。下面将结合实施例进一步说明本发明的有益效果。实施例1本实施例试剂盒包括：(1)包被有抗人nmp22单克隆抗体的多孔板，(2)人nmp22标准品1-6个，(3)结合抗体(多克隆抗体，作为检测抗体)，(4)酶标二抗，(5)洗涤液，(6)样本稀释液，(7)显色剂a液，(8)显色剂b液，(9)终止液。本实施例中采用试剂或分离柱等的品牌及型号如下：ni柱：康为世纪生物科技有限公司，货号3013jgst柱：康为世纪生物科技有限公司，货号cw0190s弗氏完全佐剂/弗氏不完全佐剂：sigma，货号f5881/f5506proteina柱：thermo，货号20333试剂盒中抗体具体通过以下步骤获得：i.多位点抗原序列设计：实践证明，仅仅使用抗原设计软件来预测抗原决定簇(antigenicepitope)是远远不够的。如果抗原设计不精确或出错，将浪费大量的时间和金钱。为确保抗体的灵敏度和特异性，本发明采用多位点抗原序列列阵设计，制备用于临床检测或作为抗体药物的抗体。膀胱癌检测试剂盒中使用的针对nmp22抗体的抗原，多位点抗原序列设计序列表如下表1所示。表1抗原序列编号氨基酸序列seu-aa-001(seqidno：1)mtlhatrgaallswvseu-aa-002(seqidno：2)aallswvnslhvadpseu-aa-003(seqidno：3)slhvadpveavlqlqseu-aa-004(seqidno：4)eavlqlqdcsifikiseu-aa-005(seqidno：5)csifikiidrihgteseu-aa-006(seqidno：6)drihgteegqqilkqseu-aa-007(seqidno：7)gqqilkqpvserldfseu-aa-008(seqidno：8)vserldfvcsflqknseu-aa-009(seqidno：9)csflqknrkhpsspeseu-aa-010(seqidno：10)khpsspeclvsaqkvseu-aa-011(seqidno：11)lvsaqkvlegselelseu-aa-012(seqidno：12)egselelakmtmlllseu-aa-013(seqidno：13)kmtmlllyhstmsskseu-aa-014(seqidno：14)hstmssksprdweqfseu-aa-015(seqidno：15)prdweqfeykiqaelseu-aa-016(seqidno：16)ykiqaelavilkfvlseu-aa-017(seqidno：17)vilkfvldhedglnlseu-aa-018(seqidno：18)hedglnlnedlenflseu-aa-019(seqidno：19)edlenflqkapvpstseu-aa-020(seqidno：20)kapvpstcsstfpeeseu-aa-021(seqidno：21)sstfpeelsppshqaseu-aa-022(seqidno：22)sppshqakreirfleseu-aa-023(seqidno：23)reirflelqkvasssseu-aa-024(seqidno：24)qkvassssgnnflsgseu-aa-025(seqidno：25)gnnflsgspaspmgdseu-aa-026(seqidno：26)paspmgdilqtpqfqseu-aa-027(seqidno：27)lqtpqfqmrrlkkqlseu-aa-028(seqidno：28)rrlkkqladersnrdseu-aa-029(seqidno：29)kkqladersnrdeleseu-aa-030(seqidno：30)kqladersnrdelel多位点抗原序列设计及anti-nmp22检测示意图如图1所示。2.抗原的制备将目的基因构建到质粒pet30a和pgex-6p-1上，并以大肠杆菌bl21为宿主进行蛋白表达，将菌体经超声破碎后经ni柱(康为世纪生物科技有限公司，货号3013j)或gst柱(康为世纪生物科技有限公司，货号cw0190s)进行纯化，得到his/gst标签的原核表达蛋白，即为抗原。3.抗体的制备a.多克隆抗体制备流程1)免疫动物制备抗血清取抗原与等体积弗氏完全佐剂(sigma，货号f5881)或弗氏不完全佐剂(sigma，货号f5506)充分乳化后免疫新西兰大白兔，每次剂量为100ug/ml，分10点皮内注射，共免疫3～4次，末次免疫第7天后取耳静脉血测定抗体效价。2)测定抗体效价用elisa法测定，结果显示抗体效价达1:100000以上。3)取血及分离血清颈动脉放血，收集血清。b.单克隆抗体制备流程1)免疫动物制备抗血清选取6～8周龄balb/c小鼠，抗原与佐剂1:1混匀，剂量为100ug/只。每隔两周进行一次免疫，共免疫3次，第三次免疫9天后断尾采血，分离血清进行抗体效价分析。2)抗体效价分析取产生抗体效价最高的小鼠的脾细胞与瘤细胞结合，得到可稳定分泌抗nmp22蛋白的杂交瘤细胞；收集、纯化杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体，即为抗nmp22蛋白的单克隆抗体。抗体采用proteina柱(thermo，货号20333)进行纯化，具体步骤如下：(1)将proteina柱上下旋钮拧下，添加10倍柱体积(30ml)的1×pbs以5ml/min的速度洗涤柱子，洗液用小烧杯盛放；(2)用5ml注射器吸取适量样品，使用0.45um滤器进行过滤于干净10ml离心管内(标记为a)，再加入等量pbs进行稀释；(3)使用一次性刻度吸管吸取a管中的样品过proteina柱，速度为5ml/min，流穿用10ml离心管接取(标记为b)；(4)使用一次性刻度吸管吸取b管中的样品过proteina柱，速度为5ml/min，流穿用a管接取；(5)重复步骤3一次；(6)用5ml注射器吸取5mlpbs洗涤柱子，洗液用小烧杯盛放，重复三次；(7)将8个1.5ml离心管依次编号为1～8号，使用1ml移液器向管中添加500ul1mtris；使用一次性刻度吸管吸取6ml0.1m柠檬酸于柱子中，洗脱抗体，用1～8号管接取洗脱液，从第一滴开始。每管接至1.25ml，混匀，存放于4℃内。纯化的抗体蛋白采用bca法进行浓度测定，步骤如下：(1)配制bca标样，具体见表2。表2(2)样品稀释将蛋白样品分别稀释20、40、80倍；(3)配制工作液根据要检测的样品量配制合适体积的工作液，按a液：b液：c液＝25:25:1配制；(4)加样每孔加入125ul样品和125ul工作液；(5)读值将酶标板放入60℃恒温中孵育15min，在od450nm读值；(6)计算结果根据标准曲线(nmp22蛋白elisa标准曲线见图3)和稀释倍数计算出样品的浓度。材料：样本为人的尿液采用本发明试剂盒的具体检测步骤(1)将试剂盒从4℃冰箱取出，平衡至室温。(2)加入待检样本及标准品100ul/孔，均为双孔，同时设空白孔，用封口膜封好，37℃孵育60min，洗涤5次，拍干。(3)在各孔内加入结合抗体，100ul/孔，37℃孵育30min，洗涤5次，拍干。(4)再加入标记有辣根过氧化物酶的抗人igg抗体，100ul/孔，37℃孵育30min，洗涤5次，拍干。(5)加入显色剂a液100ul/孔，混匀，37℃孵育15min.(6)加终止液50ul/孔终止反应，用酶标仪测定各孔的450nm处的吸光度值。结果判定：od比值＝待测标本孔的od值-空白孔的od值，通过人nmp22elisa检测标准曲线(见图2)计算结果。膀胱镜检结合nmp22检测的方式将能更准确地检测膀胱癌，其准确率分别为：90.8/95.1/99.1(见图3，其中，a代表膀胱检查，b代表膀胱检查+尿液分析，c代表膀胱检查+nmp22检测)。膀胱癌细胞内的尿nmp22含量至少比正常细胞高25倍，在细胞凋亡时nmp22会裂解成大小不等的片段或以复合体的形式释放到尿液中，膀胱癌患者、膀胱良性肿瘤和正常人的尿液nmp22含量见图4.膀胱癌尿液nmp22检测与其他检测的结果如表3所示。表3检测灵敏度(％)特异性(％)细胞学检测5096nmp22检测7076bta检测5183fdp检测6675由于尿液中nmp22的含量极低，即使膀胱癌患者尿nmp22浓度水平为非癌对照组的20～80倍，但仍然难以用常规elisa方法测出。本发明可以使用亲和磁珠(affinitymagneticbeads)对膀胱癌尿检样品进行预处理(见图5)，使尿检样品中的检测蛋白得到100～500倍的浓缩，大大提高了诊断的灵敏度，同时具有快速、简便的特点。本发明同时筛选出多个抗原位点，并结合蛋白质分析及抗原设计软件来预测抗原决定簇(序列及设计思想如上所述)，大大提高抗了体制备的成功率及本发明膀胱癌检测试剂盒的灵敏度和特异性。事实上，在目前国内人工和生物材料相对便宜的情况下，时间成本显得由为突出。本发明抗体制作的成功率将达到98％，且制备时间周期最短。本发明的膀胱癌尿检测试剂盒可检测到样品中约0.1iu/ml的nmp22。以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。序列表<110>河北翰林生物科技有限公司<120>膀胱癌检测试剂盒<130>2017-sjzsy-12<141>2018-01-16<160>38<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>15<212>prt<213>homosapiens<400>1metthrleuhisalathrargglyalaalaleuleusertrpval151015<210>2<211>15<212>prt<213>homosapiens<400>2alaalaleuleusertrpvalasnserleuhisvalalaasppro151015<210>3<211>15<212>prt<213>homosapiens<400>3serleuhisvalalaaspprovalglualavalleuglnleugln151015<210>4<211>15<212>prt<213>homosapiens<400>4glualavalleuglnleuglnaspcysserilepheilelysile151015<210>5<211>15<212>prt<213>homosapiens<400>5cysserilepheilelysileileaspargilehisglythrglu151015<210>6<211>15<212>prt<213>homosapiens<400>6aspargilehisglythrglugluglyglnglnileleulysgln151015<210>7<211>15<212>prt<213>homosapiens<400>7glyglnglnileleulysglnprovalsergluargleuaspphe151015<210>8<211>15<212>prt<213>homosapiens<400>8valsergluargleuaspphevalcysserpheleuglnlysasn151015<210>9<211>15<212>prt<213>homosapiens<400>9cysserpheleuglnlysasnarglyshisproserserproglu151015<210>10<211>15<212>prt<213>homosapiens<400>10lyshisproserserproglucysleuvalseralaglnlysval151015<210>11<211>15<212>prt<213>homosapiens<400>11leuvalseralaglnlysvalleugluglysergluleugluleu151015<210>12<211>15<212>prt<213>homosapiens<400>12gluglysergluleugluleualalysmetthrmetleuleuleu151015<210>13<211>15<212>prt<213>homosapiens<400>13lysmetthrmetleuleuleutyrhisserthrmetserserlys151015<210>14<211>15<212>prt<213>homosapiens<400>14hisserthrmetserserlysserproargasptrpgluglnphe151015<210>15<211>15<212>prt<213>homosapiens<400>15proargasptrpgluglnpheglutyrlysileglnalagluleu151015<210>16<211>15<212>prt<213>homosapiens<400>16tyrlysileglnalagluleualavalileleulysphevalleu151015<210>17<211>15<212>prt<213>homosapiens<400>17valileleulysphevalleuasphisgluaspglyleuasnleu151015<210>18<211>15<212>prt<213>homosapiens<400>18hisgluaspglyleuasnleuasngluaspleugluasnpheleu151015<210>19<211>15<212>prt<213>homosapiens<400>19gluaspleugluasnpheleuglnlysalaprovalproserthr151015<210>20<211>15<212>prt<213>homosapiens<400>20lysalaprovalproserthrcysserserthrpheprogluglu151015<210>21<211>15<212>prt<213>homosapiens<400>21serserthrpheproglugluleuserproproserhisglnala151015<210>22<211>15<212>prt<213>homosapiens<400>22serproproserhisglnalalysarggluileargpheleuglu151015<210>23<211>15<212>prt<213>homosapiens<400>23arggluileargpheleugluleuglnlysvalalaserserser151015<210>24<211>15<212>prt<213>homosapiens<400>24glnlysvalalaserserserserglyasnasnpheleusergly151015<210>25<211>15<212>prt<213>homosapiens<400>25glyasnasnpheleuserglyserproalaserprometglyasp151015<210>26<211>15<212>prt<213>homosapiens<400>26proalaserprometglyaspileleuglnthrproglnphegln151015<210>27<211>15<212>prt<213>homosapiens<400>27leuglnthrproglnpheglnmetargargleulyslysglnleu151015<210>28<211>15<212>prt<213>homosapiens<400>28argargleulyslysglnleualaaspgluargserasnargasp151015<210>29<211>15<212>prt<213>homosapiens<400>29lyslysglnleualaaspgluargserasnargaspgluleuglu151015<210>30<211>15<212>prt<213>homosapiens<400>30lysglnleualaaspgluargserasnargaspgluleugluleu151015<210>31<211>30<212>dna<213>artificialsequence<220><221>primer_bind<222>(1)..(30)<223>重组质粒构建引物<400>31cgggatccatgtctccagcttctcccatgg30<210>32<211>30<212>dna<213>artificialsequence<220><221>primer_bind<222>(1)..(30)<223>重组质粒构建引物<400>32ggaattccttctctgtcttcaggtcctggc30<210>33<211>32<212>dna<213>artificialsequence<220><221>protein_bind<222>(1)..(32)<223>重组质粒构建引物<400>33cgggatccatggggaccccactcagtatcacc32<210>34<211>31<212>dna<213>artificialsequence<220><221>primer_bind<222>(1)..(31)<223>重组质粒构建引物<400>34ggaattcgttgccataatcgggagaacccag31<210>35<211>32<212>dna<213>artificialsequence<220><221>primer_bind<222>(1)..(32)<223>重组质粒构建引物<400>35cgggatccctcgaactcccgacctcagatgat32<210>36<211>31<212>dna<213>artificialsequence<220><221>primer_bind<222>(1)..(31)<223>重组质粒构建引物<400>36ggaattccttgatctcaggagttgaaggctg31<210>37<211>30<212>dna<213>artificialsequence<220><221>primer_bind<222>(1)..(30)<223>重组质粒构建引物<400>37cgggatcctgggactacaggcgcccaccac30<210>38<211>31<212>dna<213>artificialsequence<220><221>primer_bind<222>(1)..(31)<223>重组质粒构建引物<400>38ggaattccctgaggtcaggagtttgagacca31当前第1页12