本发明属于中药材含量检测领域，具体涉及一种白树药材中α-高野尻霉素的的含量检测方法。
背景技术：
ɑ-葡萄糖苷酶抑制剂是临床上使用的一类重要的治疗糖尿病的口服药物，现有的ɑ-葡萄糖苷酶抑制剂类的代表性药物有阿卡波糖、伏格列波糖、米格列醇。不同于双胍类、胰岛素增敏剂和促胰岛素分泌剂等口服降糖药物在体内需要经过肝肾代谢而限制了肝肾功能异常的病人的使用，ɑ-葡萄糖苷酶抑制剂能够抑制小肠上皮细胞表面ɑ-糖苷酶的活性，作用靶点在小肠，能够延缓碳水化合物吸收，而不抑制蛋白质和脂肪的吸收，几乎对肝肾无副作用和蓄积作用。其中，由德国拜耳公司开发的拜糖平和日本武田药品开发的倍欣已成为治疗糖尿病的一线药物，并进一步扩大适应症，因此，研发新的ɑ-葡萄糖苷酶抑制剂是非常必要，且具有重要意义。白树，拉丁名为sμregadeglomerμlata(bl.)，属大戟科白树属，乔木，高2-13米；小枝带灰黑色或褐色。叶片革质，宽或狭长椭圆形，或多少倒卵形或到披针形，长5-12厘米，宽3-6厘米，全缘，顶端急尖或钝或圆，稀凹缺，基部渐狭，中脉在两面突起，侧脉每边5-10条；托叶靠近花序的宽三角形，较厚，长约1毫米，宽2毫米，顶端钝，下部的托叶早落，叶柄长3-8毫米(《海南植物志》，陈焕镛主编第二卷第一版1965年，pp177)。中国医药科学院药物研究所在研究中发现：白树水提取物具有很好的ɑ-葡萄糖苷酶抑制活性，并申请了专利“白树提取物、其制备方法及其组合物与用途”，公开号为cn1506106a。中药材的含量直接影响中药产品的药效和安全性，因此建立一种白树药材的含量测定方法对于白树药品的开发利用具有重要的意义。中国专利文献cn102462726a中，
专利名称：为白树总生物碱及多羟基生物碱化合物的提取、分离方法及用途，依次采用阳离子交换树脂提取、阴离子交换树脂提取和羧甲基葡聚糖凝胶c-25分离方法，分别用氨水或者蒸馏水反复洗脱，分离得到17种多羟基生物碱类化合物，再利用核磁共振碳谱和质谱对各个化合物进行鉴别，最终得出化合物对应的含量，利用该种方法作为白树药材含量测定方法，不仅过程繁琐复杂，耗时长，不适宜常规分析，而且提取分离步骤过多，容易出现偏差而出现测定结果不准确、精密度差的问题。由于白树药材中所分离得到的多羟基生物碱类化合物均不存在特征的uv吸收，不能用传统的方法进行检测，目前针对无紫外吸收的生物碱化合物，通常采用蒸发光散射检测器、示差折光检测器等仪器进行检测，但是这些方法的灵敏度和准确度较差，结合白树药材中相似的成分较多，分子式结构相近，采用一般提取分离方法，难以将白树药材中各种成分进行有效分离，因此白树药材不适宜用上述生物碱化合物常规检测仪器进行检测。综上，建立一种快速、准确、方便的白树药材的含量检测方法成为迫切需要解决的技术问题。技术实现要素：为此，本发明所要解决的技术问题在于现有技术中白树药材含量测定方法过程繁琐复杂、耗时长，而且过多的提取分离步骤容易导致测定结果不准确，进而提供一种快速、准确、方便的白树药材的检测方法。为解决上述技术问题，本发明是通过如下技术方案实现的：一种白树药材中α-高野尻霉素的含量检测方法，包括如下步骤，(1)对照品溶液制备：精密称定α-高野尻霉素对照品，加入衍生溶剂和酰氯类衍生试剂进行衍生反应，制得α-高野尻霉素衍生物试液，对α-高野尻霉素衍生物试液稀释定容后，即得对照品溶液；(2)标准曲线的制备：通过高效液相色谱法，测定对照品溶液中的α-高野尻霉素的峰面积，色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，以流动相a为乙腈、流动相b为甲醇和流动相c为水，采用梯度洗脱法，梯度洗脱程序如下：0-10min，a：b：c为31％：35％：34％→31％：45％：24％；10-49min，a：b：c为31％：45％：24％；49-50min，a：b：c为31％：45％：24％→100％：0：0；50-60min，a：b：c为100％：0：0；60-61min，a：b：c为100％：0：0→31％：35％：34％；61-70min，a：b：c为31％：35％：34％，建立α-高野尻霉素衍生物浓度-峰面积标准曲线，得到标准曲线回归方程式；(3)样品的提取：白树药材干燥后粉粹，制得白树粉末，加入纯化水回流提取或者超声提取，得到白树提取液；(4)供试品溶液制备：向所述白树提取液中加入衍生溶剂和酰氯类衍生试剂进行衍生反应，得到样品衍生试液，将样品衍生试液稀释、定容后制得供试品溶液；(5)样品的测定：采用高效液相色谱法，在步骤(2)所述色谱条件下测定供试品溶液中的α-高野尻霉素的峰面积，然后根据步骤(2)中回归方程计算样品中α-高野尻霉素的含量。进一步优选地，所述酰氯类衍生溶剂为苯甲酰氯、甲基苯甲酰氯和对甲氧基甲苯酰氯中的一种。进一步优选地，所述衍生溶剂为无水吡啶、四氢呋喃、n，n-二甲基甲酰胺中的一种。进一步优选地，在所述步骤(1)和所述步骤(4)中，还包括加入二氯甲烷或者氯仿的步骤。进一步优选地，步骤(1)中，α-高野尻霉素对照品、衍生溶剂、酰氯类衍生试剂和二氯甲烷的用量比为：(3-12mg)：(1-2ml)：(0.3-1ml)：(0.5-1.5ml)。进一步优选地，步骤(4)中，白树药材、衍生溶剂、酰氯类衍生试剂和二氯甲烷的用量之比为(0.5-2g)：(1-2ml)：(0.3-1ml)：(0.5-1.5ml)。进一步优选地，步骤(3)中，白树粉末加纯化水提取后，先将提取液离心除杂，然后取上清液进行冷冻干燥处理，所述冷冻干燥的时间为6-24小时。进一步优选地，步骤(3)中，每1ml纯化水中加入0.05-0.5g的酶粉，所述酶粉为纤维素酶、木质素降解酶或者两者的混合物。进一步优选地，所述酶粉为纤维素酶和木质素降解酶的混合物，所述纤维素酶和木质素酶的质量比为1:1-1:2。进一步优选地，所述步骤(1)和所述步骤(4)的衍生反应中，反应条件为50-60℃水浴加热，反应时间为30-40min。本发明技术方案，具有如下优点：1、本发明提供的白树药材中α-高野尻霉素的的检测方法，该方法中的α-高野尻霉素具有较强的ɑ-葡萄糖苷酶抑制活性，本发明创新性地采用α-高野尻霉素作为白树药材含量测定的指标，采用柱前衍生化将α-高野尻霉素衍生为可紫外吸收的产物再通过高效液相色谱仪测定α-高野尻霉素的含量。2、本发明提供的白树药材中α-高野尻霉素的的检测方法，白树药材中含有多种生物碱活性物质，目前对于生物碱化合物通常针对化合物中的n原子进行衍生，以水作为溶剂，采用芴甲氧羰基氯作为衍生试剂，但是研究中发现由于α-高野尻霉素的结构中除了杂环上的n原子外，其余五个碳原子上均连接有oh或者ch2oh，造成n原子空间位阻较大，利用传统的生物碱衍生化方法效果较差、检测到的白树药材含量结果偏低，本发明通过使用衍生化试剂苯甲酰氯对α-高野尻霉素中的oh进行衍生化反应，显著提高α-高野尻霉素的反应活性，缩短α-高野尻霉素衍生化反应时间，提高衍生化反应效果，该种衍生化方法与高效液相色谱联用能够快速、准确、方便的检出白树药材中α-高野尻霉素的含量，作为白树药材含量测定的指标，有助于白树药品的开发；3、本发明提供的白树药材中α-高野尻霉素的的检测方法，本发明通过在衍生试剂中加入溶剂二氯甲烷或者氯仿，能够提高衍生反应活性，从而加快反应速度；4、本发明提供的白树药材中α-高野尻霉素的的检测方法，研究中发现苯甲酰氯衍生后的α-高野尻霉素易水解不稳定，而且水解后生成的杂质与衍生物有类似的紫外吸收，干扰测定结果，本发明通过预先将白树药材的提取物进行冷冻干燥以除去水分，加入无水吡啶作为反应溶剂，进行衍生化反应，提高衍生反应稳定性；并且通过控制冷冻干燥时间为6-24小时，在保证水分除去的情况下，能够改善因冷冻时间过长影响衍生物稳定性而造成含量测定结果偏低的情况，提高测定结果的准确性；5、本发明提供的白树药材中α-高野尻霉素的的检测方法，通过在提取溶剂纯化水中加入酶粉，有利于提取过程中对药材细胞的破壁，细胞内各类成分均呈释放状态，缩短提取时间，并且通过采用木质素降解酶和纤维素酶的混合物作为酶粉加入纯化水中，既能够利用木质素降解酶可以降解白树中的木质素，又利用纤维素酶降解白树中的纤维素，两者协同促进白树中活性成分的释放，进一步提高提取效率，相对于单纯的水超声提取，加入酶制剂后提取50min内，提取率显著提高；6、本发明提供的白树药材中α-高野尻霉素的的检测方法，研究中发现衍生过程中采用持续涡旋或者电磁搅拌虽然能够在一定程度上加快衍生反应，但是衍生反应过程不稳定，多次测定含量的rsd值偏高，因此，本发明采用50-60℃水浴条件来加速反应速度，提高反应效果，衍生反应过程稳定，rsd值满足分析测定要求。附图说明为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中：图1为实验例1项2.3中对照品溶液、供试品溶液与空白样品溶液的色谱图，其中，a为对照品溶液；b为供试品溶液；c为空白样品溶液；图2为实验例1项2.4中制备的α-高野尻霉素衍生物浓度-峰面积标准曲线；图3为实验例1中不同品牌的色谱柱对应的供试品溶液的色谱图；其中，色谱图a-d分别对应表8中的色谱柱1-4。具体实施方式下述实施例用于进一步说明本发明但不限于本发明。实验例1：一、柱前衍生法测定α-高野尻霉素含量的方法学考察1仪器与试药utimate3000高效液相色谱仪(美国戴安)；冷冻干燥机(上海争巧科学仪器有限公司)；离心机(上海卢湘仪离心机仪器有限公司)；超声仪(上海科导超声仪器有限公司)。α-高野尻霉素对照品(中国医学科学院药物研究所自制)，乙腈和甲醇为色谱纯，水为超纯水，无水吡啶和苯甲酰氯为超干级，其余试剂均为分析纯。2方法与结果2.1对照品溶液、供试品溶液与空白样品溶液的制备2.1.1对照品溶液的制备精密称取α-高野尻霉素对照品约3mg，依次加入无水吡啶1.5ml、苯甲酰氯0.5ml和氯仿1.0ml，密闭，60℃水浴反应40min，放置室温，衍生物转移至50ml容量瓶中，甲醇定容，再精密移取2ml至25ml容量中，甲醇定容，混均即得。2.1.2供试品溶液的制备(1)白树药材干燥后，粉粹至过50目筛网，分别精密称取白树粉末0.5010g，0.4997g，0.5003g，置于三个具塞锥形瓶中，分别精密加入纯化水25ml，称重，超声30分钟，得到提取液，再次称定重量，用纯化水补足超声后减少的重量，摇匀，在转速5000/min的条件下离心10分钟，精密移取上清液1ml，置于20ml玻璃瓶中，冷冻干燥6小时，得到待测样品；(2)将所得的待测样品中加入无水吡啶1.5ml溶解，再依次加入苯甲酰氯0.5ml和二氯甲烷1.0ml，密封，60℃水浴反应40min，将反应后溶液加入甲醇定容至25ml，摇匀，用0.45μm滤膜滤过，取续滤液，即得。2.1.3空白样品溶液制备按照2.1.2所列供试品溶液的制备方法，制备不含所述白树药材的空白样品溶液。2.2色谱条件用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；色谱柱：agilentextendc18(4.6mm×250mm，5μm)，二级管阵列检测器(检测波长230nm)；流动相：乙睛-甲醇-水；流速：1.2ml/min，进样量10μl。梯度洗脱如下：表1梯度洗脱条件表时间/min甲醇/％乙腈/％水/％03135341031452449314524501000060100006131353470313534理论板数(按α-高野尻霉素)应不低于3000。2.3系统适用性试验按项2.1所列试验方法分别制备对照品溶液、供试品溶液与空白样品溶液，分别精密量取对照品溶液10μl、供试品溶液10μl和空白样品溶液10μl，注入液相色谱仪，在项2.2所列的色谱条件下测定，记录色谱图，计算各峰分离度、理论塔板数，判断空白样品溶液是否对测定峰无干扰。如图1所示，在此色谱条件下，空白样品溶液在α-高野尻霉素信号峰位置无干扰峰出现，供试品溶液中α-高野尻霉素信号峰与相邻色谱峰直接分离度为1.56，说明α-高野尻霉素峰与其他杂质峰分离较好，α-高野尻霉素信号峰理论塔板数高于15000、对称因子大于0.9，说明该色谱条件专属性强。2.4线性关系考察取α-hnj对照品约5.937mg，精密称定，加入无水吡啶1.5ml使完全溶解后，再依次加入苯甲酰氯0.5ml和二氯甲烷1.0ml，密封，60℃水浴反应40min，将反应后溶液加甲醇制成每1ml含18.9μg高野尻霉素对照品母液，摇匀，用微孔滤膜(0.45μm)滤过，取续滤液，即得对照品母液。取对照品母液，分别精密移取0.2ml、0.5ml、1.0ml、2.0ml、3ml、5ml至10ml容量瓶中，加入甲醇定容稀释，制成一系列浓度由低到高的对照品衍生溶液，在项2.2所列色谱条件下分别测定对照品衍生溶液和2.1.1制备的对照品溶液的峰面积，结果见表2。以对照品浓度(μg/ml)为横坐标，峰面积积分值(aμm)为纵坐标，绘制标准曲线，结果见图2。α-高野尻霉素回归方程y＝1.972x+0.0862，相关系数r＝0.9999，表明α-高野尻霉素在0.378μg～18.76μg/ml范围内呈良好的线性关系。表2α-高野尻霉素线性关系考察表编号进样量(μg/ml)α-高野尻霉素峰面积(aμm)10.3780.762220.9451.936131.893.988143.787.580255.6711.166469.4518.6445718.7637.12572.5精密度试验精密量取项2.1所制得的对照品溶液，连续重复进样6针，按项2.1所列色谱条件测定峰面积，记录α-高野尻霉素峰面积，并计算峰面积的rsd％值，结果表明仪器精密度良好，rsd为0.6％，符合分析方法的要求，结果见表3。表3α-高野尻霉素峰精密度试验结果2.6稳定性试验取同一批供试品溶液，分别在制备后0h、24h、36h、48h，100h进样，按项2.2所列色谱条件进行分析，结果见表4。α-高野尻霉素在0～100h内峰面积的rsd为2.0％，结果表明，样品放置100h内稳定。表4α-高野尻霉素峰稳定性试验结果2.7重复性试验取同一批白树药材，按项2.1所列方法平行制备6份供试品溶液，按2.2项下色谱条件依次进样测定，计算α-高野尻霉素含量，结果见表5。α-高野尻霉素含量含量的rsd为2.0％，表明该方法的重复性良好。表5α-高野尻霉素重复性试验结果2.8回收率试验取已知含量的同一批白树药材6份，每份约0.25g，采用加样回收，分别按下表精密加入一定量的α-高野尻霉素对照品溶液，按项2.1.2供试品溶液的制备方法及项2.2所列色谱条件进行测定，计算回收率。回收率测定结果见表6。表明本法的回收率符合规定，方法可行。表6α-高野尻霉素回收率测定结果2.9样品含量的测定分别对同一批次的白树药材按项2.1所列的供试品溶液的制备处理白树药材，按照项2.2所列的色谱条件进样测定，得出峰面积，代入项2.4所得的标准曲线关系式中，计算出α-高野尻霉素的含量，每个样品测定三次，结果见表7。表7白树样品含量测定结果根据现有的试验结果，目前暂定白树中α-高野尻霉素(c6h13no4)的重量百分数不得少于0.1％。二、工艺条件的单因素考察1、不同品牌的色谱柱的考察(1)取白树药材干燥后，粉粹至过50目筛网，分别精密称取白树粉末0.4998g，置于具塞锥形瓶中，加入纯化水25ml，称重，超声30分钟，得到提取液，再次称定重量，用纯化水补足超声后减少的重量，摇匀，在转速5000/min的条件下离心10分钟，精密移取上清液1ml，置于20ml玻璃瓶中，冷冻干燥6小时，得到待测样品；(2)供试品溶液的制备：将所得的待测样品中加入无水吡啶1.5ml溶解，再依次加入苯甲酰氯0.5ml和二氯甲烷1.0ml，密封，60℃水浴反应40min，将反应后溶液加入甲醇定容至25ml，摇匀，用0.45μm滤膜滤过，取续滤液，即得；(3)样品的测定：与实施例1中项2.3所列方法的区别在于，分别使用下表8中不同的色谱柱进样步骤(2)制得的供试品溶液，记录各个色谱图，其他均一致，结果如图3所示，agilentextendc18色谱柱分离所得的峰形对称，分离效果好，因此选用该型号色谱柱。表8实验中采用的色谱柱编号规格填料柱号色谱柱1250×4.6mmthermodionexbondedsilicac185μm1色谱柱2250×4.6mmwatersxbridgec185μm2色谱柱3250×4.6mmagilentextendc185μm3色谱柱4250×4.6mmagilenzorbaxsb-c185μm42、提取液体积的考察一种白树药材中α-高野尻霉素的含量检测方法，包括如下步骤，(1)对照品溶液的制备：精密称定α-高野尻霉素对照品5.937mg，加入无水吡啶1.5ml使其完全溶解后，再依次加入苯甲酰氯0.5ml和二氯甲烷1.0ml，密封，60℃水浴反应40min，将反应后溶液加入甲醇定容至25ml，精密量取2ml，加甲醇定容至25ml，制成每1ml含18.9μg的α-高野尻霉素对照品母液，摇匀，用0.45μm滤膜滤过，取续滤液，即得；(2)标准曲线的制备：取步骤(1)制备的对照品溶液，分别精密移取0.2ml、0.5ml、1.0ml、2.0ml、3ml、5ml至10ml容量瓶中，加入甲醇定容稀释，制成一系列浓度由低到高的对照品衍生溶液，在项2.2所列色谱条件下分别测定对照品衍生溶液和对照品溶液的峰面积，以对照品浓度(μg/ml)为横坐标，峰面积积分值(aμm)为纵坐标，绘制标准曲线；(3)样品的提取：白树药材干燥后，粉粹至过50目筛网，分别精密称取白树粉末0.5003g，0.4996g，0.5002g，0.5004g，分别置于四个具塞锥形瓶中，分别精密加入纯化水15ml、25ml、50ml和75ml，称重，超声30分钟，得到提取液，再次称定重量，用纯化水补足超声后减少的重量，摇匀，在转速5000/min的条件下离心10分钟，精密移取上清液1ml，置于20ml玻璃瓶中，冷冻干燥6小时，得到待测样品；(4)供试品溶液的制备：将所得的待测样品中加入无水吡啶1.5ml溶解，再依次加入苯甲酰氯0.5ml和二氯甲烷1.0ml，密封，60℃水浴反应40min，将反应后溶液加入甲醇定容至25ml，摇匀，用0.45μm滤膜滤过，取续滤液，即得；(5)样品的测定：精密移取供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，在项2.2所列的色谱条件下测定，记录峰面积，代入步骤(2)所得的α-高野尻霉素浓度与峰面积的关系式中，计算白树药材中α-高野尻霉素的含量，结果见表9所示。表9不同体积的提取溶剂的考察结果表a-高野尻霉素为强极性化合物，选用纯化水为提取溶剂，如表9所示，随着提取溶剂用量的增加，测得的α-高野尻霉素含量增加，说明α-高野尻霉素的提取程度提高，当提取溶剂增加到25ml时，继续提高提取溶剂的量，α-高野尻霉素的含量没有明显增加，因此，选择提取溶剂的量为每0.5g白树药粉对应25ml的纯化水。3、超声时间的考察一种白树药材中α-高野尻霉素的含量检测方法，包括如下步骤，(1)对照品溶液的制备：精密称定α-高野尻霉素对照品5.935mg，加入无水吡啶1.5ml使其完全溶解后，再依次加入苯甲酰氯0.5ml和氯仿1.0ml，密封，60℃水浴反应40min，将反应后溶液加入甲醇定容至25ml，精密量取2ml，加甲醇定容至25ml，制成每1ml含18.9μg的α-高野尻霉素对照品母液，摇匀，用0.45μm滤膜滤过，取续滤液，即得；(2)标准曲线的制备：取步骤(1)制备的对照品溶液，分别精密移取0.2ml、0.5ml、1.0ml、2.0ml、3ml、5ml至10ml容量瓶中，加入甲醇定容稀释，制成一系列浓度由低到高的对照品衍生溶液，在项2.2所列色谱条件下分别测定对照品衍生溶液和对照品溶液的峰面积，以对照品浓度(μg/ml)为横坐标，峰面积积分值(aμm)为纵坐标，绘制标准曲线；(3)样品的提取：白树药材干燥后，粉粹至过50目筛网，分别精密称取白树粉末0.4996g，0.4996g，0.5005g，0.5002g，分别置于四个具塞锥形瓶中，分别精密加入纯化水25ml，称重，分别超声20分钟、30分钟、45分钟和60分钟，得到提取液，再次称定重量，用纯化水补足超声后减少的重量，摇匀，在转速5000/min的条件下离心10分钟，精密移取上清液1ml，置于20ml玻璃瓶中，冷冻干燥6小时，得到待测样品；(4)供试品溶液的制备：将所得的待测样品中加入无水吡啶1.5ml溶解，再依次加入苯甲酰氯0.5ml和氯仿1.0ml，密封，60℃水浴反应40min，将反应后溶液加入甲醇定容至25ml，摇匀，用0.45μm滤膜滤过，取续滤液，即得；(5)样品的测定：精密移取供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，在项2.2所列的色谱条件下测定，记录峰面积，代入步骤(2)所得的α-高野尻霉素浓度与峰面积的关系式中，计算白树药材中α-高野尻霉素的含量，结果见表10所示。表10不同超声时间的考察结果表如表10所示，随着超声时间的增加，α-高野尻霉素含量开始略有增加，说明提取越完全，当超声时间增加到30min时，继续增加超声时间，α-高野尻霉素的含量没有明显增加，因此，选择超声时间为30min。4、提取次数的考察一种白树药材中α-高野尻霉素的含量检测方法，包括如下步骤，(1)对照品溶液的制备：精密称定α-高野尻霉素对照品5.933mg，加入无水吡啶1.5ml使其完全溶解后，再依次加入苯甲酰氯0.5ml和二氯甲烷1.0ml，密封，60℃水浴反应40min，将反应后溶液加入甲醇定容至25ml，精密量取2ml，加甲醇定容至25ml，制成每1ml含18.9μg的α-高野尻霉素对照品母液，摇匀，用0.45μm滤膜滤过，取续滤液，即得；(2)标准曲线的制备：取步骤(1)制备的对照品溶液，分别精密移取0.2ml、0.5ml、1.0ml、2.0ml、3ml、5ml至10ml容量瓶中，加入甲醇定容稀释，制成一系列浓度由低到高的对照品衍生溶液，在项2.2所列色谱条件下分别测定对照品衍生溶液和对照品溶液的峰面积，以对照品浓度(μg/ml)为横坐标，峰面积积分值(aμm)为纵坐标，绘制标准曲线；(3)样品的提取：白树药材干燥后，粉粹至过50目筛网，分别精密称取白树粉末0.5005g，置于具塞锥形瓶中，精密加入纯化水25ml，称重，超声30分钟，得到提取液，再次称定重量，用纯化水补足超声后减少的重量，摇匀，在转速5000/min的条件下离心10分钟，精密移取上清液1ml，置于20ml玻璃瓶中，冷冻干燥6小时，得到待测样品a；将上清液倒出得出残渣，向残渣中精密加入纯化水25ml，称重，超声30分钟，得到提取液，再次称定重量，用纯化水补足超声后减少的重量，摇匀，在转速5000/min的条件下离心10分钟，精密移取上清液1ml，置于20ml玻璃瓶中，冷冻干燥6小时，得到待测样品b；继续将上清液倒出得出残渣，向残渣中精密加入纯化水25ml，称重，超声30分钟，得到提取液，再次称定重量，用纯化水补足超声后减少的重量，摇匀，在转速5000/min的条件下离心10分钟，精密移取上清液1ml，置于20ml玻璃瓶中，冷冻干燥6小时，得到待测样品c；(4)供试品溶液的制备：在待测样品a、b、c中分别加入无水吡啶1.5ml溶解，再依次加入苯甲酰氯0.5ml和二氯甲烷1.0ml，密封，60℃水浴反应40min，将反应后溶液加入甲醇定容至25ml，摇匀，用0.45μm滤膜滤过，取续滤液，即得；(5)样品的测定：分别精密移取上述三份供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，在项2.2所列的色谱条件下测定，记录峰面积，代入步骤(2)所得的α-高野尻霉素浓度与峰面积的关系式中，计算白树药材中α-高野尻霉素的含量，结果见表11所示。表11不同提取次数含量考察结果如表11所示，白树药粉在提取第2、3次均未测出a-高野尻霉素含量，说明提取1次即可提取完全，因此确定提取次数为1次。实施例1：(提取过程中不加酶)一种白树药材中α-高野尻霉素的含量检测方法，包括如下步骤，(1)对照品溶液的制备：精密称定α-高野尻霉素对照品5.932mg，加入无水吡啶1ml使其完全溶解后，再依次加入苯甲酰氯0.3ml和二氯甲烷1.0ml，密封，60℃水浴反应40min，将反应后溶液加入甲醇定容至25ml，精密量取2ml，加甲醇定容至25ml，制成每1ml含18.9μg的α-高野尻霉素对照品母液，摇匀，用0.45μm滤膜滤过，取续滤液，即得；(2)标准曲线的制备：取步骤(1)制备的对照品溶液，分别精密移取0.2ml、0.5ml、1.0ml、2.0ml、3ml、5ml至10ml容量瓶中，加入甲醇定容稀释，制成一系列浓度由低到高的对照品衍生溶液，在项2.2所列色谱条件下分别测定对照品衍生溶液和对照品溶液的峰面积，以对照品浓度(μg/ml)为横坐标，峰面积积分值(aμm)为纵坐标，绘制标准曲线，得到峰面积和α-高野尻霉素浓度关系式；(3)样品的提取：白树药材干燥后，粉粹至过60目筛网，精密称定白树粉末1.004g，置于具塞锥形瓶中，加入纯化水50ml，称重，超声30分钟，提取温度45℃，得到提取液，再次称定重量，用纯化水补足超声后减少的重量，摇匀，在转速5000/min的条件下离心10分钟，精密移取上清液1ml，置于20ml玻璃瓶中，冷冻干燥6小时，得到待测样品；(4)供试品溶液的制备：将所得的待测样品中加入无水吡啶1.5ml溶解，再依次加入苯甲酰氯0.5ml和二氯甲烷1.0ml，密封，60℃水浴反应40min，将反应后溶液加入甲醇定容至25ml，摇匀，用0.45μm滤膜滤过，取续滤液，即得；(5)样品的测定：精密移取供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，在项2.2所列的色谱条件下测定，记录峰面积，代入步骤(2)所得的α-高野尻霉素浓度与峰面积的关系式中，计算白树药材中α-高野尻霉素的含量，结果见表12所示。实施例2：(提取过程中加0.05g酶)一种白树药材中α-高野尻霉素的含量检测方法，包括如下步骤，(1)对照品溶液的制备：精密称定α-高野尻霉素对照品11.861mg，加入无水吡啶1.5ml使其完全溶解后，再依次加入苯甲酰氯0.5ml和氯仿1.5ml，密封，50℃水浴反应40min，将反应后溶液加入甲醇定容至50ml，精密量取2ml，加甲醇定容至25ml，制成每1ml含18.9μg的α-高野尻霉素对照品母液，摇匀，用0.45μm滤膜滤过，取续滤液，即得；(2)标准曲线的制备：取步骤(1)制备的对照品溶液，分别精密移取0.2ml、0.5ml、1.0ml、2.0ml、3ml、5ml至10ml容量瓶中，加入甲醇定容稀释，制成一系列浓度由低到高的对照品衍生溶液，在项2.2所列色谱条件下分别测定对照品衍生溶液和对照品溶液的峰面积，以对照品浓度(μg/ml)为横坐标，峰面积积分值(aμm)为纵坐标，绘制标准曲线，得到峰面积和α-高野尻霉素浓度关系式；(3)样品的提取：采用与实施例1同一批白树药材相同条件下干燥后，粉粹至过65目筛网，精密称定白树粉末1.9994g，置于具塞锥形瓶中，精密加入纯化水100ml，再向具塞锥形瓶中加入0.05g酶粉(0.02g纤维素酶+0.03g木质素酶)后混合均匀，其中所述纤维素酶活力为2万μ/g，所述木质素酶活力为5万μ/g，称重，提取温度35℃，超声50分钟，得到提取液，再次称定重量，用纯化水补足超声后减少的重量，摇匀，在转速4500/min的条件下离心20分钟，精密移取上清液1ml，置于20ml玻璃瓶中，冷冻干燥8小时，得到待测样品；(4)供试品溶液的制备：将所得的待测样品中加入无水吡啶1.5ml溶解，再依次加入苯甲酰氯0.5ml和氯仿1.5ml，密封，50℃水浴反应40min，将反应后溶液加入甲醇定容至50ml，摇匀，用0.45μm滤膜滤过，取续滤液，即得；(5)样品的测定：精密移取供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，在项2.2所列的色谱条件下测定，记录峰面积，代入步骤(2)所得的α-高野尻霉素浓度与峰面积的关系式中，计算白树药材中α-高野尻霉素的含量，结果见表12所示。实施例3：(提取过程中加0.3g酶)一种白树药材中α-高野尻霉素的含量检测方法，包括如下步骤，(1)对照品溶液的制备：精密称定α-高野尻霉素对照品2.970mg，加入四氢呋喃1ml使其完全溶解后，再依次加入对甲氧基甲苯酰氯1ml和氯仿1ml，密封，50℃水浴反应30min，将反应后溶液加入甲醇定容至25ml，精密量取4ml，加甲醇定容至25ml，制成每1ml含18.9μg的α-高野尻霉素对照品母液，摇匀，用0.45μm滤膜滤过，取续滤液，即得；(2)标准曲线的制备：取步骤(1)制备的对照品溶液，分别精密移取0.2ml、0.5ml、1.0ml、2.0ml、3ml、5ml至10ml容量瓶中，加入甲醇定容稀释，制成一系列浓度由低到高的对照品衍生溶液，在项2.2所列色谱条件下分别测定对照品衍生溶液和对照品溶液的峰面积，以对照品浓度(μg/ml)为横坐标，峰面积积分值(aμm)为纵坐标，绘制标准曲线，得到峰面积和α-高野尻霉素浓度关系式；(3)样品的提取：采用与实施例1同一批白树药材相同条件下干燥后，粉粹至过50目筛网，精密称定白树粉末0.9994g，置于具塞锥形瓶中，精密加入纯化水50ml，再向具塞锥形瓶中加入0.3g酶粉(0.1g纤维素酶+0.2g木质素酶)后混合均匀，其中所述纤维素酶活力为2万μ/g，所述木质素酶活力为5万μ/g，称重，超声30分钟，提取温度50℃，得到提取液，再次称定重量，用纯化水补足超声后减少的重量，摇匀，在转速4000/min的条件下离心15分钟，精密移取上清液2ml，置于20ml玻璃瓶中，冷冻干燥24小时，得到待测样品；(4)供试品溶液的制备：将所得的待测样品中加入无水吡啶1ml溶解，再依次加入苯甲酰氯1ml和氯仿1ml，密封，50℃水浴反应30min，将反应后溶液加入甲醇定容至25ml，摇匀，用0.45μm滤膜滤过，取续滤液，即得；(5)样品的测定：精密移取供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，在项2.2所列的色谱条件下测定，记录峰面积，代入步骤(2)所得的α-高野尻霉素浓度与峰面积的关系式中，计算白树药材中α-高野尻霉素的含量，结果见表12所示。实施例4：(提取过程中加0.5g酶粉)一种白树药材中α-高野尻霉素的含量检测方法，包括如下步骤，(1)对照品溶液的制备：精密称定α-高野尻霉素对照品5.937mg，加入无水吡啶1ml使其完全溶解后，再依次加入甲基苯甲酰氯0.5ml和氯仿0.5ml，密封，55℃水浴反应35min，将反应后溶液加入甲醇定容至25ml，精密量取2ml，加甲醇定容至25ml，制成每1ml含18.9μg的α-高野尻霉素对照品母液，摇匀，用0.45μm滤膜滤过，取续滤液，即得；(2)标准曲线的制备：取步骤(1)制备的对照品溶液，分别精密移取0.2ml、0.5ml、1.0ml、2.0ml、3ml、5ml至10ml容量瓶中，加入甲醇定容稀释，制成一系列浓度由低到高的对照品衍生溶液，在项2.2所列色谱条件下分别测定对照品衍生溶液和对照品溶液的峰面积，以对照品浓度(μg/ml)为横坐标，峰面积积分值(aμm)为纵坐标，绘制标准曲线，得到峰面积和α-高野尻霉素浓度关系式；(3)样品的提取：采用与实施例1同一批白树药材相同条件下干燥后，粉粹至过65目筛网，精密称定白树粉末0.5004g，置于具塞锥形瓶中，精密加入纯化水25ml，再向具塞锥形瓶中加入0.5g酶粉(0.2g纤维素酶+0.3g木质素酶的酶粉)后混合均匀，其中所述纤维素酶活力为2万μ/g，所述木质素酶活力为5万μ/g，称重，超声45分钟，提取温度50℃，得到提取液，再次称定重量，用纯化水补足超声后减少的重量，摇匀，在转速5000/min的条件下离心15分钟，精密移取上清液1ml，置于20ml玻璃瓶中，冷冻干燥12小时，得到待测样品；(4)供试品溶液的制备：将所得的待测样品中加入无水吡啶1ml溶解，再依次加入苯甲酰氯0.5ml和氯仿0.5ml，密封，55℃水浴反应35min，将反应后溶液加入甲醇定容至25ml，摇匀，用0.45μm滤膜滤过，取续滤液，即得；(5)样品的测定：精密移取供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，在项2.2所列的色谱条件下测定，记录峰面积，代入步骤(2)所得的α-高野尻霉素浓度与峰面积的关系式中，计算白树药材中α-高野尻霉素的含量，结果见表12所示。对比例1：(n原子衍生化)。一种白树药材中α-高野尻霉素的含量检测方法，包括如下步骤，(1)对照品溶液的制备：精密称取α-高野尻霉素对照品9.88mg，置50ml量瓶中，用50％甲醇溶解并稀释至刻度。精密吸取上述溶液1.0ml，置25ml量瓶中，加入0.4mol/l的硼酸-氯化钾缓冲液(ph＝8.5)1ml，再加入10mmol/l的fmoc-cl乙腈溶液2ml，室温下超声处理30min，加0.1％的醋酸溶液至刻度，摇匀，即得；(2)标准曲线的制备：分别精密吸取上述对照品溶液2、4、8、10、20、30、40μl，注入液相色谱仪，测定，以峰面积为纵坐标，进样量为横坐标作线性回归，其线性方程为y＝2.361x-0.4658，r＝0.995，线性范围为0.0158～0.3162μg；(3)供试品溶液的制备：采用与实施例1同一批白树药材相同条件下干燥后，粉粹至过65目筛网，精密称定白树粉末1.002g，加入50ml0.05mol/l盐酸溶液超声30min，提取液离心10min(转速为5000r/min)，取上清液转移至25ml量瓶中，加0.05mol/l盐酸稀释至刻度。精密量取上述溶液1ml，置10ml量瓶中，加入0.4mol/l的硼酸-氯化钾缓冲液(ph＝8.5)1ml，再加入10mmol/l的fmoc-cl乙腈溶液2ml室温下超声处理(功率250w频率53khz)30min，加0.1％的醋酸溶液至刻度，摇匀，即得；(4)样品的测定：精密移取供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，测定，记录峰面积，代入步骤(2)所得的α-高野尻霉素浓度与峰面积的关系式中，计算白树药材中α-高野尻霉素的含量，结果见表12所示。对比例2：(未加入二氯甲烷)一种白树药材中α-高野尻霉素的含量检测方法，包括如下步骤，(1)对照品溶液的制备：与实施例1中对照品溶液的制备中所列方法的区别在于，在衍生反应过程中未加入二氯甲烷，其他均一致；(2)α-高野尻霉素衍生物浓度-峰面积标准曲线的制备：同实施例1中标准曲线的制备中所列方法；(3)样品的提取：同实施例1中样品的提取中所列方法；(4)供试品溶液的制备：与实施例1中供试品溶液的制备中所列方法的区别在于，在衍生反应过程中未加入二氯甲烷，其他均一致；(5)样品的测定：同实施例1中所列方法，结果见表12所示。对比例3：(无水甲醇代替二氯甲烷)一种白树药材中α-高野尻霉素的含量检测方法，包括如下步骤，(1)对照品溶液的制备：与实施例1中对照品溶液的制备所列方法的区别在于，在衍生反应过程中加入1.0ml无水甲醇代替二氯甲烷，其他均一致；(2)α-高野尻霉素衍生物浓度-峰面积标准曲线的制备：同实施例1中标准曲线的制备所列方法；(3)样品的提取：同实施例1中样品的提取中所列方法；(4)供试品溶液的制备：与实施例1中供试品溶液的制备中所列方法的区别在于，在衍生反应过程中加入1.0ml无水甲醇代替二氯甲烷，其他均一致；(5)样品的测定：同实施例1中所列方法，结果如表12所示。对比例4：(无水乙醇代替二氯甲烷)一种白树药材中α-高野尻霉素的含量检测方法，包括如下步骤，(1)对照品溶液的制备：与实施例1中对照品溶液的制备所列方法的区别在于，在衍生反应过程中加入1.0ml无水乙醇代替二氯甲烷，其他均一致；(2)α-高野尻霉素衍生物浓度-峰面积标准曲线的制备：同实施例1中标准曲线的制备所列方法；(3)样品的提取：同实施例1中样品的提取中所列方法；(4)供试品溶液的制备：与实施例1中供试品溶液的制备中所列方法的区别在于，在衍生反应过程中加入1.0ml无水乙醇代替二氯甲烷，其他均一致；(5)样品的测定：同实施例1中所列方法；结果如表12所示。对比例5：(无水丙酮代替二氯甲烷)一种白树药材中α-高野尻霉素的含量检测方法，包括如下步骤，(1)对照品溶液的制备：与实施例1中对照品溶液的制备的区别在于，在衍生反应过程中加入1.0ml无水丙酮代替二氯甲烷，其他均一致；(2)α-高野尻霉素衍生物浓度-峰面积标准曲线的制备：同实施例1中标准曲线的制备中所列方法；(3)样品的提取：同实施例1中样品的提取中所列方法；(4)供试品溶液的制备：与实施例1中供试品溶液的制备中所列方法的区别在于，在衍生反应过程中加入1.0ml无水丙酮代替二氯甲烷，其他均一致；(5)样品的测定：同实施例1中所列方法；结果如表12所示。评价例表12实施例1-4和对比例1-4中所测定的α-高野尻霉素含量结果表(1)由实施例1和实施例2-4对比可知，相对于单纯的水超声提取来说，每1ml纯化水中加入0.05-0.5g的酶粉后再超声提取，α-高野尻霉素含量测定平均值提高，说明酶粉的加入能够促进α-高野尻霉素的释放，显著提高白树药材中α-高野尻霉素的提取率。(2)对比例1-4与实施例1相比，同一批白树药材测得的α-高野尻霉素平均含量显著降低，说明二氯甲烷的加入能够促进α-高野尻霉素衍生化反应，提高衍生化效果；而且，相比于对比例2中的无水甲醇、对比例3中的无水乙醇和对比例4中的无水丙酮，实施例1中的二氯甲烷能够更好地促进α-高野尻霉素衍生化反应，提高衍生化效果。显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。当前第1页12