本发明涉及药物的检测方法，特别涉及一种薏苡仁药材、提取物及其制剂甘油三酯类成分一测多评测定方法。
背景技术：
薏苡[coixlacryma-jobil.var.ma-yuen(roman.)stapf]，属禾本科薏苡属植物，以去壳种仁入药，药材名称为“薏苡仁”。薏苡仁始载于《神农本草经》，既是常用的大宗药材，也是生活中常见的食材。薏苡仁作为药物应用具有抗肿瘤、降血糖、降血脂、提高免疫力和镇痛等功效，目前以薏苡仁甘油酯为主效成分的康莱特注射液已经上市。
薏苡仁提取物：
薏苡仁油的提取方法有传统的有机溶剂提取法及强化提取法。薏苡仁油也可以采用超临界萃取技术萃取。
康莱特注射液即以注射用薏苡仁油为原料，其辅料为大豆磷脂(供注射用)、甘油(供注射用)。
现有技术中主要针对康莱特注射液中的部分成分进行检测，无法同时检测多种成分。
为保证产品质量，采用多种成分进行质量控制的模式越来越广泛，本发明为此进行了研究，得到一种薏苡仁药材、提取物及其制剂中7种甘油三酯类成分的含量测定方法。
本发明的有益效果在于：用易得的三油酸甘油酯为对照品，同时测定7种甘油三酯类成分，节约成本，提高效率；分离度提高：美国药典峰3与a分离度1.235；本发明最佳实施方式峰3与a分离度1.702；与现有技术相比，分离效果更好，更能体现薏苡仁药材、提取物及制剂的检测质量，更好地控制薏苡仁药材、提取物及制剂的质量。
技术实现要素：
本发明提供一种薏苡仁药材、提取物及其制剂中7种甘油三酯类成分的一测多评方法。
本发明所述方法，包括以下步骤：
1、对照品溶液的制备
以三油酸甘油酯作为对照品，配制成已知浓度的对照品溶液；
2、供试品溶液的制备
取药物，加入溶剂提取，提取后滤过，得到续滤液，
3、测定法
将对照品溶液与供试品溶液注入高效液相色谱仪，得到色谱图，根据色谱图，以三油酸甘油酯对照品的峰面积为对照，分别计算三亚油酸甘油酯，1,2-二亚油酸-3-棕榈酸甘油酯，1,2-二亚油酸-3-油酸甘油酯，1-棕榈酸-2-油酸-3-亚油酸甘油酯，1,2-二油酸-3-亚油酸甘油酯，1,2-二油酸-3-棕榈酸甘油酯的含量。
其中，所述高效液相色谱仪设定的色谱条件如下
采用agilentporoshell120ec-c8色谱柱(3×100mm，2.7μm)，以甲醇-乙腈(95:5或90:10)为流动相等度洗脱，
柱温：25(或20,30)℃，
流速为0.3(或0.4，0.5)ml/min，
蒸发光散射检测器检测。
理论塔板数按三油酸甘油酯峰计算应不低于5000。
本发明所述药物是指薏苡仁药材、薏苡仁提取物，含有薏苡仁提取物的药物制剂，根据检测需要可以采用常规方法将药物研磨成粉末后提取即可，提取物和药物制剂如果是液体状态，则直接进行提取。
本发明优选的测定方法如下：
1、对照品溶液的制备
取三油酸甘油酯对照品适量，精密称定，加二氯甲烷-甲醇(1:9，v/v)，制成每1ml含80μg的溶液，即得。
2、供试品溶液的制备
取药物适量，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，密塞，称定重量，超声处理(功率300w，频率40khz)30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
3、测定法
分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5μl，注入液相色谱仪，测定，以三油酸甘油酯对照品的峰面积为对照，分别计算三亚油酸甘油酯，1,2-二亚油酸-3-棕榈酸甘油酯，1,2-二亚油酸-3-油酸甘油酯，1-棕榈酸-2-油酸-3-亚油酸甘油酯，1,2-二油酸-3-亚油酸甘油酯，1,2-二油酸-3-棕榈酸甘油酯的含量。
甘油三酯类成分对照品信息
本发明的检测方法是经过筛选获得的，筛选过程如下：
1、专属性：与阴性、空白比较无干扰
2、准确度：
分别按照外标法(esm)和一测多评法(ssdmc)计算高、中、低三个浓度组下各待测成分的回收率。
外标法测定的加样回收率(％)
一测多评法测定的加样回收率(％)
结果显示，两种算法测得的7种待测成分回收率均在95～105％内，且各组测定结果间的rsd值基本小于3％，符合要求，说明本方法准确度较好。
3、精密度：
重复性考察
按照前述供试品溶液制备方法和色谱条件进行分析，记录各待测成分色谱峰面积，分别按照外标法(esm)和一测多评法(ssdmc)计算各待测成分含量。
结果显示，两种算法测得的7种成分含量的rsd值均小于3％，符合要求，说明一测多评法与外标法测定在重复性上无明显区别。
中间精密度考察(不同分析时间)
按照前述对照品和供试品溶液的制备方法，平行制备三份供试品溶液，分三天进行分析测试，记录色谱峰峰面积，分别采用外标法(esm)和一测多评法(ssdmc)计算各待测成分含量(％)。
在两种算法下，7种待测成分在各自九组实验中所测得含量的rsd值均小于3％，符合要求，说明一测多评法与外标法测定在不同分析时间的中间精密度上无明显区别。
中间精密度考察(不同分析人员)
按照上述对照品和供试品溶液的制备方法，分别由三名不同分析人员，各平行制备三份供试品溶液，按本章确定的色谱条件分析，记录色谱峰峰面积，分别采用外标法(esm)和一测多评法(ssdmc)计算各待测成分含量(％)。
结果显示，两种算法测得的7种成分含量的rsd值均小于3％，符合要求，说明一测多评法与外标法测定在不同分析人员的中间精密度上无明显区别。
4、稳定性考察：
按照本发明对照品和供试品溶液的制备方法，制备一份供试品溶液和一份混标溶液，分别于室温储存0h、2h、4h、6h、8h、10h、12h、24h、48h后，按上述的色谱条件进行分析，记录各待测成分色谱峰面积，分别按照外标法(esm)和一测多评法(ssdmc)计算待测成分含量(％)。
结果显示，在0h～48h内两种算法测得的7种成分测定含量的rsd值均小于3％，符合要求，说明样品在48h内较稳定。
5、耐用性考察：
按照上述对照品和供试品溶液的制备方法，制备样品，并按上述确定的色谱条件进行分析，通过a-m各实验条件的细微改变，记录各待测成分色谱峰峰面积、理论塔板数、分离度、拖尾因子。
耐用性考察的不同实验条件
结果显示，在色谱分离条件流动相比例、流速、柱温、进样体积及检测器漂移管温度、检测器压力等发生轻微改变的情况下，重复进样的峰面积rsd值基本小于3％，仪器的响应较为稳定。
所有色谱峰的理论塔板数均大于5000，当流速为0.4ml/min时(j)的理论塔板数最低，主要原因为poroshell120ec-c8色谱柱的最佳流速是0.3ml/min，提示应用该方法时应根据色谱柱选择合适的流速。
流动相为100％甲醇(f)时分离度相对较差，其它条件的轻微改变分离度均大于1.5。
在色谱条件微调的情况下，拖尾因子基本在0.94～1.06之间，符合要求。综上，该方法的耐用性能满足含量测定要求。
采用本发明的方法，用待测成分色谱峰与三油酸甘油酯色谱峰的相对保留时间确定六个峰的峰位。其相对保留时间应在规定值的±5％范围内。相对保留时间见下表：
本发明优选的是测定药物制剂粉末中的7种有效成分的含量，并进行质量控制，所述药物制剂粉末即康莱特注射液经过真空干燥后得到的粉末，根据本发明制定的标准，采用本发明的方法测定，按干燥品计算，以三油酸甘油酯计，康莱特注射液经过真空干燥后得到的粉末中含三亚油酸甘油酯，1,2-二亚油酸-3-棕榈酸甘油酯，1,2-二亚油酸-3-油酸甘油酯，1-棕榈酸-2-油酸-3-亚油酸甘油酯，1,2-二油酸-3-亚油酸甘油酯，1,2-二油酸-3-棕榈酸甘油酯和三油酸甘油酯的总量不得少于粉末总重量的3.5％。
以下通过实验数据说明本发明和现有方法的差异和所取得的有益效果：
其中，
现有方法1是《中国药典》2015版
现有方法2是《美国药典》40版
附图说明
图1薏苡仁油hplc-elsd分析典型色谱图
图2注射剂hplc-elsd分析典型色谱图
具体实施方式：
以下通过实施例进一步说明本发明。
实施例1
薏苡仁饮片的含量测定方法：
色谱条件与系统适用性试验采用agilentporoshell120ec-c8色谱柱(3×100mm，2.7μm)，以甲醇-乙腈(95:5)为流动相等度洗脱，柱温：20℃，流速为0.3ml/min，蒸发光散射检测器检测。理论塔板数按三油酸甘油酯峰计算应不低于5000。
对照品溶液的制备取三油酸甘油酯对照品适量，精密称定，加二氯甲烷-甲醇(1:9，v/v)，制成每1ml含80μg的溶液，即得。
供试品溶液的制备取本品粉末(过65目筛)约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，密塞，称定重量，超声处理(功率300w，频率40khz)30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5μl，注入液相色谱仪，测定，以三油酸甘油酯对照品的峰面积为对照，分别计算三亚油酸甘油酯，1,2-二亚油酸-3-棕榈酸甘油酯，1,2-二亚油酸-3-油酸甘油酯，1-棕榈酸-2-油酸-3-亚油酸甘油酯，1,2-二油酸-3-亚油酸甘油酯，1,2-二油酸-3-棕榈酸甘油酯的含量，用待测成分色谱峰与三油酸甘油酯色谱峰的相对保留时间确定以上六个峰的峰位。其相对保留时间应在规定值的±5％范围内，即得。本品按干燥品计算，以三油酸甘油酯计，含三亚油酸甘油酯，1,2-二亚油酸-3-棕榈酸甘油酯，1,2-二亚油酸-3-油酸甘油酯，1-棕榈酸-2-油酸-3-亚油酸甘油酯，1,2-二油酸-3-亚油酸甘油酯，1,2-二油酸-3-棕榈酸甘油酯和三油酸甘油酯的总量不得少于5.0％。
实施例2
薏苡仁提取物的含量测定方法：
薏苡仁油样品制备：取薏苡仁油50mg，精密称定，置50ml容量瓶中，加二氯甲烷-甲醇(1:9，v/v)制成每1ml含1mg的溶液，摇匀，即得。
对照品溶液的制备：取甘油三油酸酯(ooo)对照品适量，精密称定，加二氯甲烷-甲醇(1:9，v/v)，制成每1ml含80μg的溶液，摇匀，即得。
色谱条件：色谱柱：agilentporoshell120ec-c8(3×100mm，2.7μm)，柱温：30℃；以甲醇-乙腈(9:1)为流动相等度洗脱，流速为0.3ml/min，进样量为5μl，蒸发光散射检测器(elsd-ltii)检测参数：温度45℃，增益值11，过滤值10。
测定法：分别精密吸取供试品溶液5μl，对照品溶液5μl和10μl，注入液相色谱仪，测定，以甘油三油酸酯对照品的峰面积为对照，按一测多评法分别计算三亚油酸甘油酯，1,2-二亚油酸-3-棕榈酸甘油酯，1,2-二亚油酸-3-油酸甘油酯，1-棕榈酸-2-油酸-3-亚油酸甘油酯，1,2-二油酸-3-亚油酸甘油酯，1,2-二油酸-3-棕榈酸甘油酯，三油酸甘油酯的含量。结果显示，总含量为96.44％。
实施例3
薏苡仁制剂的含量测定方法：
薏苡仁注射液样品制备：取薏苡仁注射液100mg，精密称定，置10ml容量瓶中，加二氯甲烷-甲醇(1:9，v/v)制成每1ml含10mg的溶液，摇匀，即得。
对照品溶液的制备：取三油酸甘油酯(ooo)对照品适量，精密称定，加二氯甲烷-甲醇(1:9，v/v)，制成每1ml含0.08mg的溶液，摇匀，即得。
色谱条件：色谱柱：agilentporoshell120ec-c8(3×100mm，2.7μm)，柱温：25℃；以甲醇-乙腈(95:5)为流动相等度洗脱，流速为0.3ml/min，进样量为5μl，蒸发光散射检测器(elsd-ltii)检测参数：温度45℃，增益值11，过滤值10。
测定法：分别精密吸取供试品溶液5μl，对照品溶液5μl和10μl，注入液相色谱仪，测定，以甘油三油酸酯对照品的峰面积为对照，按一测多评法分别计算三亚油酸甘油酯，1,2-二亚油酸-3-棕榈酸甘油酯，1,2-二亚油酸-3-油酸甘油酯，1-棕榈酸-2-油酸-3-亚油酸甘油酯，1,2-二油酸-3-亚油酸甘油酯，1,2-二油酸-3-棕榈酸甘油酯，三油酸甘油酯的含量。结果显示，总含量为10.61％。