本发明属于药物分析技术领域，涉及一种复方制剂中有关物质的定性分析方法，具体涉及一种注射用头孢噻肟钠他唑巴坦钠中有关物质的液相色谱-串联质谱(lc-ms/ms)定性分析方法。
背景技术
注射用头孢噻肟钠他唑巴坦钠为头孢噻肟钠(cefotaximesodium，ctx)和他唑巴坦钠(tazobactamsodium，taz)的复方制剂。cn1425376a公开了一种注射用头孢噻肟钠和他唑巴坦钠复方制剂，其中头孢噻肟钠和他唑巴坦钠的重量比为5:1；cn102949397a公开了一种注射用头孢噻肟钠和他唑巴坦钠制剂，其中头孢噻肟钠与他唑巴坦钠的质量比为1-4:1；nz553119a公开了一种包含抗生素、三唑和糖皮质激素的药剂配方，其中抗生素可以选用头孢噻肟钠，并且可以与他唑巴坦钠联用；nz575435a公开了一种可咀嚼的抗生素兽药配方，其包含抗生素、疏水材料、大豆蛋白粉末、崩解剂、溶剂、任选的调味剂和任选的防腐剂，其中抗生素可以选用头孢噻肟钠，并且可以与他唑巴坦的盐联用。
头孢噻肟钠(分子式为c16h16n5o7s2na，分子量为477.45)为第三代半合成头孢菌素，他唑巴坦钠(分子式为c10h11n4o5sna，分子量为322.27)为半合成β-内酰胺酶抑制剂，二者联合用药可以增强抑菌效果并拓宽抗菌谱。然而，在注射用头孢噻肟钠他唑巴坦钠的稳定性研究过程中，人们从该复方制剂中发现了多种有关物质(如表1和表2所示)，其类型及含量将直接影响制剂的质量和性能，故需建立合适的方法来检测复方制剂中的有关物质，但目前尚无关于注射用头孢噻肟钠他唑巴坦钠中有关物质定性分析方法的文献报道。
表1.头孢噻肟钠中有关物质一览表
表2.他唑巴坦中有关物质一览表
技术实现要素：
为了在稳定性考察过程中更好地对注射用头孢噻肟钠他唑巴坦钠中有关物质进行定性分析和质量监控，本发明旨在提出一种基于lc-ms/ms的注射用头孢噻肟钠他唑巴坦钠中有关物质的定性分析方法。
具体而言，本发明提供了一种注射用头孢噻肟钠他唑巴坦钠中有关物质的液相色谱-串联质谱定性分析方法，其包括下列步骤：
1)色谱条件：
色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶(ods)为填充剂(固定相)；
流动相由流动相a和流动相b组成，流动相a和流动相b均为乙酸-乙酸铵缓冲液和甲醇的混合溶液，但混合比例不同；
洗脱方式为梯度洗脱；
流动相流速为1.0ml/min；
进样量为50μl；
检测波长为230nm；
2)质谱条件：
离子源为电喷雾离子源(esi)；
检测模式为正离子模式；
扫描范围为m/z100～600；
干燥气温度为350℃；
干燥气流量为10l/min；
雾化气压强为35.0psi；
毛细管电压为3500v；
柱后分流为1:4；
3)供试品溶液的配制：
取注射用头孢噻肟钠他唑巴坦钠适量，加水配制成1mg/ml的溶液，于室温放置24小时后，作为注射用头孢噻肟钠他唑巴坦钠供试品溶液；
4)对照品溶液的配制：
取头孢噻肟对照品适量，加水配制成1mg/ml的溶液后稀释100倍，作为头孢噻肟对照品溶液；
取他唑巴坦对照品适量，加水配制成1mg/ml的溶液后稀释100倍，作为他唑巴坦对照品溶液；
分别取头孢噻肟钠中结构已知的有关物质和他唑巴坦钠中结构已知的有关物质适量，各自加水配制成0.1mg/ml的有关物质对照品溶液；
5)液相色谱-串联质谱测定：
分别将步骤3)中配制的注射用头孢噻肟钠他唑巴坦钠供试品溶液以及步骤4)中配制的头孢噻肟对照品溶液、他唑巴坦对照品溶液和有关物质对照品溶液注入lc-ms/ms联用仪，按照步骤1)中的色谱条件和步骤2)中的质谱条件进行检测，并记录相应的液相色谱图、一级质谱图和二级质谱图；
6)有关物质的定性分析：
比较注射用头孢噻肟钠他唑巴坦钠供试品溶液、头孢噻肟对照品溶液、他唑巴坦对照品溶液、有关物质对照品溶液的液相色谱图，确定供试品溶液的液相色谱图中与头孢噻肟、他唑巴坦及结构已知的有关物质分别对应的色谱峰，并通过一级质谱图中的分子离子峰和二级质谱图中的主要碎片离子峰加以鉴定，再通过一级质谱图中的分子离子峰和二级质谱图中的主要碎片离子峰推定供试品溶液的液相色谱图中与头孢噻肟、他唑巴坦及结构已知的有关物质无对应关系的色谱峰所代表的有关物质的结构，完成注射用头孢噻肟钠他唑巴坦钠中有关物质的定性分析。
在一项优选的实施方案中，步骤1)中所述色谱柱为watersxbridgeshieldrp18(250×4.6mm，5μm)色谱柱。
在一项优选的实施方案中，步骤1)中所述流动相a中乙酸-乙酸铵缓冲液与甲醇的体积比为92:8，所述流动相b中乙酸-乙酸铵缓冲液与甲醇的体积比为60:40。
在一项优选的实施方案中，步骤1)中所述乙酸-乙酸铵缓冲液中乙酸铵的摩尔浓度为20mmol/l。
在一项优选的实施方案中，步骤1)中所述乙酸-乙酸铵缓冲液的ph值为6.25。
在一项优选的实施方案中，步骤1)中所述梯度洗脱的洗脱条件如下：0分钟，流动相a为100v％；15分钟，流动相a为100v％；17分钟，流动相a为72v％，流动相b为28v％；24分钟，流动相a为72v％，流动相b为28v％；53分钟，流动相b为100v％；58分钟，流动相b为100v％；63分钟，流动相a为100v％；66分钟，流动相a为100v％。
在一项优选的实施方案中，步骤3)中所述注射用头孢噻肟钠他唑巴坦钠供试品溶液的具体配制过程如下所述：称取注射用头孢噻肟钠他唑巴坦钠0.13g，精密称定，置于100ml容量瓶中，加水溶解后定容，摇匀，配制成1mg/ml的溶液，于室温放置24小时后，作为注射用头孢噻肟钠他唑巴坦钠供试品溶液。
在一项优选的实施方案中，步骤4)中所述头孢噻肟对照品溶液的具体配制过程如下所述：称取头孢噻肟对照品10mg，精密称定，置于10ml容量瓶中，加水溶解后定容，摇匀，配制成1mg/ml的溶液；精密量取1ml该溶液至100ml容量瓶中，加水溶解后定容，摇匀，作为头孢噻肟对照品溶液。
在一项优选的实施方案中，步骤4)中所述他唑巴坦对照品溶液的具体配制过程如下所述：称取他唑巴坦对照品10mg，精密称定，置于10ml容量瓶中，加水溶解后定容，摇匀，配制成1mg/ml的溶液；精密量取1ml该溶液至100ml容量瓶中，加水溶解后定容，摇匀，作为他唑巴坦对照品溶液。
在一项优选的实施方案中，步骤4)中所述头孢噻肟钠中结构已知的有关物质包括头孢噻肟杂质a(去乙酰氧基头孢噻肟脱乙酰化物)、杂质b(去乙酰基头孢噻肟)、杂质d(反式头孢噻肟)、杂质e(去乙酰基头孢噻肟内酯)和7-aca(7-氨基头孢烷酸)，所述他唑巴坦钠中结构已知的有关物质包括他唑巴坦杂质a(2-氨基-3-甲基-3-亚磺酰基-4-(1h-1,2,3-三唑-1-基)丁酸)。
本发明以十八烷基硅烷键合硅胶作为色谱柱的填充剂(例如watersxbridgeshieldrp18色谱柱)，利用基于挥发性乙酸-乙酸铵缓冲液的流动相进行梯度洗脱，能够有效地分离测定注射用头孢噻肟钠他唑巴坦钠及其中有关杂质。另外，本发明还采用lc-ms/ms法对注射用头孢噻肟钠他唑巴坦钠中出现的主要杂质峰进行杂质类型的定性分析，使杂质结构的确证更为快捷，为制剂稳定性考察过程中有关物质的定性分析提供了一种切实有效的方法。
附图说明
图1为头孢噻肟钠有关物质混合对照品在挥发性缓冲盐流动相系统及非挥发性缓冲盐流动相系统中的液相色谱比较图。
图2为在室温条件下放置24小时的注射用头孢噻肟钠他唑巴坦钠和头孢噻肟有关物质混合对照品的液相色谱比较图。
图3为头孢噻肟原料药对照品的二级质谱图。
图4为他唑巴坦原料药对照品的二级质谱图。
图5为头孢噻肟杂质a对照品的二级质谱图。
图6为头孢噻肟杂质b对照品的二级质谱图。
图7为头孢噻肟杂质d对照品的二级质谱图。
图8为头孢噻肟杂质e对照品的二级质谱图。
图9为头孢噻肟杂质a对照品的液相色谱图。
图10为头孢噻肟杂质b对照品的液相色谱图。
图11为头孢噻肟杂质e对照品的液相色谱图。
图12为注射用头孢噻肟钠他唑巴坦钠中未知杂质1的二级质谱图。
图13为注射用头孢噻肟钠他唑巴坦钠中未知杂质2的二级质谱图。
图14为注射用头孢噻肟钠他唑巴坦钠中未知杂质4的二级质谱图。
图15为注射用头孢噻肟钠他唑巴坦钠中未知杂质7的二级质谱图。
图16为在室温条件下放置24小时的注射用头孢噻肟钠他唑巴坦钠和头孢噻肟杂质d对照品的液相色谱比较图。
图17为注射用头孢噻肟钠他唑巴坦钠中未知杂质8的二级质谱图。
图18为注射用头孢噻肟钠他唑巴坦钠中未知杂质9的二级质谱图。
图19为注射用头孢噻肟钠他唑巴坦钠中未知杂质10的二级质谱图。
图20为注射用头孢噻肟钠他唑巴坦钠中未知杂质11的二级质谱图。
具体实施方式
以下将结合附图和具体实施例对本发明中的技术方案做出进一步的阐述。需要说明的是，下列实施例仅用于解释本发明，而不应被理解为限制本发明。下列实施例中未注明具体技术或条件者均按照本领域的文献中所描述的技术或条件进行。除另有说明外，下列实施例中所使用的试剂、药品及仪器均可通过常规商业手段获得。
试剂：磷酸氢二钠(na2hpo4)、乙酸铵(ch3coonh4)、乙酸(ch3cooh)、甲醇(ch3oh)、超纯水(h2o)。
药品：注射用头孢噻肟钠他唑巴坦钠。
对照品：头孢噻肟对照品；他唑巴坦对照品；头孢噻肟杂质a、杂质b、杂质e(由山东省药检所提供)；头孢噻肟杂质d(头孢噻肟的反式异构体，由中检院提供)；头孢噻肟钠有关物质混合对照品(批号：y0000506)。
仪器：waters2996；agilent1100。
实施例一：液相色谱-串联质谱条件的确定。
1、色谱条件：
目前，基于hplc的注射用头孢噻肟钠他唑巴坦钠检测方法通常使用磷酸盐缓冲液(例如磷酸氢二钠缓冲体系)来配制流动相。然而，由于磷酸盐具有不挥发性，极易堵塞雾化器并污染离子源，从而影响样品电离，因此不适用于液质联用分析，故将磷酸盐缓冲液更换为挥发性的乙酸盐缓冲液(例如乙酸-乙酸铵缓冲体系)，实现了流动相的优化。
具体的色谱条件如下所述：
色谱柱：watersxbridgeshieldrp18(250×4.6mm，5μm)；
流动相a：乙酸-乙酸铵缓冲液(20mmol/l，ph＝6.25)-甲醇(92:8v/v)；
流动相b：乙酸-乙酸铵缓冲液(20mmol/l，ph＝6.25)-甲醇(60:40v/v)；
梯度洗脱条件：0分钟，流动相a为100v％；15分钟，流动相a为100v％；17分钟，流动相a为72v％，流动相b为28v％；24分钟，流动相a为72v％，流动相b为28v％；53分钟，流动相b为100v％；58分钟，流动相b为100v％；63分钟，流动相a为100v％；66分钟，流动相a为100v％；
流速：1.0ml/min；
进样量：50μl；
检测波长：230nm。
2、质谱条件：
将上述液相色谱仪与三重四极杆质谱仪串联进行试验。
具体的离子源参数如下所述：
离子源：esi；
检测模式：正离子模式；
扫描范围：m/z100-600；
干燥气温度：350℃；
干燥气流量：10l/min；
雾化气压强：35.0psi；
毛细管电压：3500v；
柱后分流：1:4。
3、样品配制：
(1)注射用头孢噻肟钠他唑巴坦钠供试品溶液的配制：
称取注射用头孢噻肟钠他唑巴坦钠约0.13g，精密称定，置于100ml容量瓶中，加水溶解后定容，摇匀，配制成1mg/ml的溶液，于室温放置24h后取样分析，结果显示主要成分与各种有关物质在液相图谱中具有良好的分离度，因此以该溶液作为供试品溶液。
(2)头孢噻肟对照品溶液的配制：
称取头孢噻肟对照品约10mg，精密称定，置于10ml容量瓶中，加水溶解后定容，摇匀，配制成1mg/ml的溶液；精密量取1ml该溶液至100ml容量瓶中，加水溶解后定容，摇匀，作为头孢噻肟对照品溶液。
(3)他唑巴坦对照品溶液的配制：
称取他唑巴坦对照品约10mg，精密称定，置于10ml容量瓶中，加水溶解后定容，摇匀，配制成1mg/ml的溶液；精密量取1ml该溶液至100ml容量瓶中，加水溶解后定容，摇匀，作为他唑巴坦对照品溶液。
(4)有关物质对照品溶液的配制：
分别称取头孢噻肟钠有关物质混合对照品、头孢噻肟杂质a、b、d及e约1mg，精密称定，置于10ml容量瓶中，加水溶解后定容，摇匀，配制成0.1mg/ml的有关物质对照品溶液。
4、结果分析：
分别采用由非挥发性磷酸盐缓冲液配制的流动相和本发明中由挥发性乙酸-乙酸铵缓冲液配制的流动相对头孢噻肟钠有关物质混合对照品溶液进行分析，记录色谱图，其结果如图1所示。由图1可知，两种分析方法的有关物质色谱图具有高度一致性，并且能够将主要成分与其各种杂质进行有效分离，故由乙酸-乙酸铵缓冲液配制的流动相可用于供试品溶液中有关物质的定性分析。
实施例二：代表性样品中有关物质的定性分析。
采用lc-ms/ms对注射用头孢噻肟钠他唑巴坦钠中有关物质进行定性分析。
1、代表性样品的选择：
在实施例一中最终确定的检测条件下，对单一组分的杂质对照品溶液、头孢噻肟钠有关物质混合对照品溶液、注射用头孢噻肟钠他唑巴坦钠供试品溶液进行分析，并通过色谱图中的保留时间进行比对。结果显示，注射用头孢噻肟钠他唑巴坦钠供试品溶液和头孢噻肟钠有关物质混合对照品溶液中的有关物质可以涵盖稳定性考察样品中的杂质类型，因此本发明重点对这两种代表性样品中的有关物质进行定性分析。
2、代表性样品中有关物质及部分杂质对照品的色谱及质谱数据的采集：
采集注射用头孢噻肟钠他唑巴坦钠供试品溶液、头孢噻肟钠有关物质混合对照品溶液、部分杂质对照品溶液的色谱保留时间、一级质谱和二级质谱，其结果如表3和图2所示。由于无法获得所有有关物质的对照品，故采用相对保留时间来定位杂质谱研究中所涉及到的各种目标杂质。相对保留时间的计算采用“主峰就近原则”，即与他唑巴坦临近的杂质峰以他唑巴坦为参照来计算相对保留时间(包括杂质1、杂质2、杂质3、杂质4、杂质5)，与头孢噻肟临近的杂质峰以头孢噻肟为参照来计算相对保留时间(包括杂质6、杂质7、杂质8、杂质9、杂质10、杂质11)。
表3.代表性样品中有关物质的色谱及质谱数据
3、头孢噻肟、他唑巴坦及已知杂质的质谱裂解途径分析：
头孢噻肟的二级质谱图如图3所示，其可能的裂解途径如下所述。
他唑巴坦的二级质谱图如图4所示，其可能的裂解途径如下所述。
头孢噻肟杂质a的二级质谱图如图5所示，其可能的裂解途径如下所述。
头孢噻肟杂质b的二级质谱图如图6所示，其可能的裂解途径如下所述。
头孢噻肟杂质d(反式头孢噻肟)的二级质谱图如图7所示，其可能的裂解途径如下所述。
头孢噻肟杂质e的二级质谱图如图8所示，其可能的裂解途径如下所述。
4、代表性样品中有关物质的结构鉴定：
(1)有对照品的有关物质的结构鉴定：
头孢噻肟杂质a、杂质b和杂质e分别与图2中杂质5、杂质3和杂质6的色谱保留时间、一级质谱、二级质谱一致，因此图2中杂质5、杂质3和杂质6分别为头孢噻肟杂质a、杂质b、杂质e，其hplc图谱分别如图9～11所示。
(2)无对照品的有关物质的结构推定：
(a)杂质1(其二级质谱图如图12所示)：
杂质1的[m+h]+为201，与头孢噻肟侧链降解产物的分子量吻合，其二级质谱的碎片离子为184,156,144,126,116，按该结构均能得到合理解析，可以推定杂质1为头孢噻肟侧链降解产物。
(b)杂质2(其二级质谱图如图13所示)和杂质4(其二级质谱图如图14所示)：
杂质2与杂质4的[m+h]+均为414，与头孢噻肟杂质b的分子量一致，其二级质谱主要碎片离子也与头孢噻肟杂质b大致相同，提示其可能为头孢噻肟杂质b的反式同分异构体，主要碎片离子按该结构均能得到合理解析，初步推测杂质2和杂质4均为头孢噻肟的反式异构体。
(c)杂质7(其二级质谱图如图15所示)：
杂质7的[m+h]+为456，与头孢噻肟的分子量一致，其二级质谱主要碎片离子也与头孢噻肟一致，提示其可能为头孢噻肟的同分异构体。但是，进一步的分析发现：该杂质与头孢噻肟的反式异构体(杂质d)的色谱保留时间完全不同(如图16所示)，由此可见该杂质不是头孢噻肟的反式异构体。综上所述，只能得出“杂质7是头孢噻肟的非反式同分异构体”的结论。
(d)杂质8(其二级质谱图如图17所示)：
杂质8的[m+h]+为216，与头孢噻肟另一侧链降解产物的分子量吻合，其二级质谱碎片离子为184,156,140,126,113，按该结构均能得到合理解析，可以推定杂质8为头孢噻肟侧链降解产物。
(e)杂质9(其二级质谱图如图18所示)：
杂质9的[m+h]+为470，其二级质谱碎片离子与头孢噻肟的二级质谱完全一致，提示该杂质可能具有与头孢噻肟相似的结构，杂质9的分子离子比头孢噻肟的分子离子大14，提示其比头孢噻肟分子结构中多一个甲基，特征碎片离子456,396,324,293,277,241均显示该杂质中增加的甲基应该在3位侧链上，按该结构均能得到合理解析。
(f)杂质10(其二级质谱图如图19所示)和杂质11(其二级质谱图如图20所示)：
杂质10和杂质11的[m+h]+均为852，与头孢噻肟二聚物(杂质f)的分子量一致，初步推测该杂质即为杂质f或其同分异构体，混合对照品中含有含量相对较大的杂质f，其色谱保留时间、一级质谱、二级质谱也与杂质10一致，推定杂质10为杂质f，杂质11为杂质f的同分异构体。
5、结果：
稳定性考察用注射用头孢噻肟钠他唑巴坦钠中有关物质的结构及其来源分析如表4所示。
表4.注射用头孢噻肟钠他唑巴坦钠中有关物质的结构及来源分析
本发明以十八烷基硅烷键合硅胶作为色谱柱的填充剂(例如watersxbridgeshieldrp18色谱柱)，利用基于挥发性乙酸-乙酸铵缓冲液的流动相进行梯度洗脱，能够有效地分离测定注射用头孢噻肟钠他唑巴坦钠及其中有关杂质。另外，本发明还采用lc-ms/ms法对注射用头孢噻肟钠他唑巴坦钠中出现的主要杂质峰进行杂质类型的定性分析，使杂质结构的确证更为快捷，为制剂稳定性考察过程中有关物质的定性分析提供了一种切实有效的方法。