本发明涉及米面及制品中检测技术领域，具体是用于检测米面及制品中乌洛托品含量的方法。
背景技术
乌洛托品（methenamine）为白色细粒状结晶，又名六亚甲基四胺，溶于水、乙醇、氯仿，不溶于四氯化碳、乙醚、石油醚。乌洛托品在工业生产中用作树脂和塑料的固化剂、催化剂和发泡剂、橡胶硫化的促进剂、纺织品的防缩剂等。在军工领域，乌洛托品与发烟硝酸作用，可制成爆炸性极强的旋风炸药。该品具有易燃性与腐蚀性，接触可引起皮炎和湿疹，对人体的肾、肝、中枢神经、免疫功能与消化系统等均有危害。近年来，监督部门加大了对违法添加物吊白块的打击，部分企业改变生产工艺与配方，违法使用乌洛托品代替吊白块。乌洛托品在弱酸的条件下会分解产生甲醛，部分违法者将其掺入米面及制品中，能起到增白、保鲜、防腐的效果。截至2011年底，原国家卫生部发布了6批《食品中可能违法添加的非食用物质和易滥用的食品添加剂名单》，并于2014年底对其进行了修订，提出了《食品中可能违法添加的非食用物质名单》（征求意见稿）。两份名单在米面及制品中明确公布了乌洛托品，加强对违法添加乌洛托品的打击力度。
加强对违法添加乌洛托品的打击，首先要有对应的检测方法。目前，乌洛托品在食品中没有国家标准检测方法，只在进出口动物源性食品中有乌洛托品残留量的检测方法液相色谱－质谱法，该方法为行业标准，且不适用米面及制品乌洛托品的检测。关于乌洛托品的检测方法，文献中有提出分光光度法、表面增强拉曼光谱法、气相色谱法、气相色谱－质谱法、离子色谱法、高效液相色谱法、液相色谱－质谱法。对于这些方法中的高效液相色谱法，按照文献中的色谱柱与提取液等条件进行试验，由于食品置于水中后，其ph值多在5.0-6.5之间，呈弱酸性，乌洛托品这种酸性溶液中会部分分解为甲醛和氨气，因此采用现有的提取液普遍存在乌洛托品回收率差的缺陷，检测结果准确度低，重复性差。而行业标准方法中液相色谱－质谱仪法，不是适合米面及制品的测定，只限于动物源性食品中乌洛托品的测定。因此，开发建立一种稳定可靠的测定米面及制品中乌洛托品的方法尤为重要，具有现实意义。
技术实现要素：
本发明的目的是提出一种测定米面及制品中乌洛托品含量的方法，其采用亲水性色谱柱高效液相色谱法对米面及制品中乌洛托品的检测进行研究，以乙酸铵溶液（ph=10）作为米面及制品中乌洛托品的提取液，具有乌洛托品提取效率高的特点，还具有操作简单、准确度高、稳定性强和重复性好的特点，为米面制品中乌洛托品的检测提供稳定可靠的检测方法。
本发明的目的可通过以下技术方案实现：
一种测定米面及制品中乌洛托品含量的方法，其包括以下步骤。
步骤1、将待测食品制成样品，其中液状待测食品直接作为样品，膏状待测食品搅碎至颗粒直径不大于0.3mm作为样品，固体状待测食品粉碎至颗粒直径不大于0.3mm作为样品。
步骤2、称取步骤1的样品2.5g至离心管中，向离心管中加入5ml乙酸铵，所述乙酸铵的浓度为20～25mmol/l，混匀后超声提取8～12min，用离心机于8000～12000r/min下离心2～5min，将离心管中的上清液转移至容量瓶中。
步骤3、继续向步骤2的离心管中加入5ml乙酸铵，所述乙酸铵的浓度为20～25mmol/l，将离心管中的剩余物与乙酸铵混匀后，超声提取8～12min，用离心机于8000～12000r/min下离心2～5min，将离心管中的上清液再次转移至步骤2的容量瓶中，用20mmol/l乙酸铵将容量瓶中的上清液定容至10ml，混匀得到样品清液。
步骤4、用0.22um水相微孔滤膜过滤步骤3制得的样品清液后，得到样品待测液。
步骤5、用高效液相色谱仪进行测定。
高效液相色谱仪的测定条件为：色谱柱为hilic柱、3.5um、4.6×150mm；进样量为10ul；柱温为28至32℃；流速为0.8至1.2ml/min；测定波长210nm；流动相为：纯水和乙腈的混合物；检测时间为5至8分钟。
将乌洛托品标准工作液及步骤4制得的样品待测液分别注入高效液相色谱仪中，测定样品待测液和乌洛托品标准工作液的峰面积，以乌洛托品标准工作液的色谱峰的峰面积为纵坐标y，以乌洛托品标准工作液的乌洛托品浓度为横坐标x，绘制标准曲线，得到标准曲线方程。
步骤6、根据步骤5得到的标准曲线方程及样品待测液的色谱峰的峰面积，计算得到样品待测液的乌洛托品浓度a、单位为mg/l，再计算得出待测制品中乌洛托品含量检测值b，b=（a×v）/m、单位为mg/kg；其中v为步骤3定容的样品清液体积、单位为l，m为步骤2称取的样品质量、单位为kg。
优化方案，本发明中步骤2和步骤3中乌洛托品的提取液为20mmol/l乙酸铵溶液，且用氨水调节乙酸铵溶液的ph值介于10～12。
进一步优化方案，本发明的步骤5中用高效液相色谱仪测定时，采用的流动相为纯水和乙腈的混合流动相，且纯水:乙腈的体积比为70:30。
本发明中在步骤2和步骤3中采用20～25mmol/l乙酸铵溶液作为米面及制品中乌洛托品的提取液，以及进一步限定乙酸铵溶液的ph值介于10～12的原理如下：
本发明人分别用以下7种提取液——纯水；2mmol/l乙酸铵溶液；5mmol/l乙酸铵溶液；10mmol/l乙酸铵溶液；15mmol/l乙酸铵溶液；20mmol/l乙酸铵溶液；25mmol/l乙酸铵溶液，采用本发明的方法及各步骤，其中步骤2和步骤3中乙酸铵分别替换为上述7种提取液，对制品中乌洛托品的含量进行检测，已知该制品中乌洛托品的含量为100mg/kg，并对乌洛托品的回收率进行分析。结果显示，7种提取液——纯水；2mmol/l乙酸铵溶液；5mmol/l乙酸铵溶液；10mmol/l乙酸铵溶液；15mmol/l乙酸铵溶液；20mmol/l乙酸铵溶液；25mmol/l乙酸铵溶液，对样品中的乌洛托品的回收率分别为49.4%、57.8%、69.7%、74.7%、83.1%、86.6%、86.7%。说明用纯水提取乌洛托品效果不好。用乙酸铵溶液提取乌洛托品时，随着乙酸铵溶液摩尔浓度增大，回收率不断提高，提取效率不断提高。当乙酸铵溶液为20mmol/l时，进一步提高乙酸铵浓度，不会增大乌洛托品的提取效率。不同浓度的乙酸铵溶液与乌洛托品提取回收率的关系图见图1。因此确定20mmol乙酸铵溶液对米面及制品中的乌洛托品进行提取。
在确定用20mmol/l乙酸铵溶液对米面及制品中的乌洛托品进行提取后，由于乌洛托品提取效率只有86%左右，因此对20mmol/l乙酸铵的ph值进行研究。本发明人分别用以下6种提取液——20mmol/l乙酸铵溶液（ph=7）；20mmol/l乙酸铵溶液（ph＝8）；20mmol/l乙酸铵溶液（ph＝9）；20mmol/l乙酸铵溶液（ph＝10）；20mmol/l乙酸铵溶液（ph＝11）；20mmol/l乙酸铵溶液（ph＝12）。乙酸铵溶液的ph值通过添加氨水进行调节。采用本发明的方法及各步骤，其中步骤2和步骤3中乙酸铵分别替换为上述6种提取液，对制品中乌洛托品的含量进行检测，已知该制品中乌洛托品的含量为100mg/kg，并对乌洛托品的回收率进行分析。结果显示，6种提取液——20mmol/l乙酸铵溶液（ph=7）；20mmol/l乙酸铵溶液（ph＝8）；20mmol/l乙酸铵溶液（ph＝9）；20mmol/l乙酸铵溶液（ph＝10）；20mmol/l乙酸铵溶液（ph＝11）；20mmol/l乙酸铵溶液（ph＝12），对样品中的乌洛托品的回收率分别为86.6%、89.7%、94.3%、96.5%、96.4%、96.6%。说明用20mmol/l乙酸铵溶液提取乌洛托品时，随着ph值增大，提取效率增大；当ph＝10时，提取效率达到最佳；进一步调高ph值，不会增大乌洛托品提取效率。不同ph值的20mmol/l乙酸铵溶液与乌洛托品提取回收率的关系图见图2。因此，选择ph值大于等于10的20mmol/l乙酸铵溶液可以对米面及制品中的乌洛托品进行有效提取。
本发明中，确定高效液相色谱仪的流动相为纯水:乙腈=70:30的原理是：高效液相色谱仪的流动相从纯水:乙腈＝10:90开始，让纯水依次增加10%，乙腈相应依次减少10%，直到纯水:乙腈＝90:10。用200mg/l的乌洛托品标准溶液作为待测样品，采用本发明步骤5中相同的高效液相色谱测定条件，一共进行9组测试。实验结果显示：当纯水:乙腈＝70:30时，如图3所示，乌洛托品出峰时间在2.903分钟，峰面积最大，峰形最好。因此，综合考虑峰面积与保留时间，选择纯水与乙腈为流动相，且纯水：乙腈＝70:30。
本发明具有以下突出的实质性特点和显著的进步。
1、本发明通过乙酸铵溶液，采用分步提取、混合定容的步骤，提取米面及制品中的乌洛托品。米面及制品中多数样品的ph值在5.0-6.5之间，呈弱酸性。乌洛托品在酸性溶液中可分解为甲醛和氨气，该反应是动态平衡可逆反应。乌洛托品分解的氨气与水反应生成氨水，化学反应方程式为nh3+h2o⇌nh3•h2o，也是动态平衡可逆反应。氨水是弱电解质，在水溶液中电离为铵离子与氢氧根离子，电离方程式为nh3•h2o⇌nh4++oh-，该电离反应也是动态平衡可逆反应。而乙酸铵易溶于水，是强电解质，在水溶液中完全电离成ch3coo-和nh4+。因此乙酸铵电离生成的nh4+抑制氨水电离，从而增加nh3•h2o含量；nh3•h2o的增加抑制氨气与水反应，从而增加氨气含量；氨气的增加抑制乌洛托品的分解，从而增加乌洛托品含量。所以用乙酸铵溶液提取乌洛托品的回收率高，提取效果好。进一步确定米面及制品中乌洛托品的提取液为20mmol/l乙酸铵溶液。
2、本发明进一步通过氨水调节20mmol/l乙酸铵溶液的ph值等于10。一方面氨水是碱性物质，在弱酸性的米面及制品中提取乌洛托品，加入氨水可防止乌洛托品在提取过程中分解；另一方面氨水是弱电解质，在米面及制品中提取乌洛托品时加入氨水，能使乌洛托品分解的动态平衡向逆方向反应。因此，通过氨水调节20mmol/l乙酸铵溶液的ph值等于10，能进一步提高米面及制品中乌洛托品的提取效率与回收率。
3、本发明中乙酸铵是弱酸弱碱盐，在水溶液中的ph值为7左右。乙酸铵-氨水组成的混合溶液具有缓冲作用，能在一定程度上抵消或减轻外加酸或碱对溶液ph值的影响，从而保持溶液的ph值相对稳定。因此，用乙酸铵-氨水作为米面及制品中乌洛托品的提取液，可维持提取液与提取过程中的ph值基本稳定不变，使提取过程一直在碱性条件下完成，避免乌洛托品的分解，有利于提高样品中乌洛托品的提取效率与回收率，确保本发明检测方法的准确度高、稳定性强和重复性好。
附图说明
图1为不同浓度的乙酸铵溶液与乌洛托品提取回收率的关系图。
图2为不同ph值的20mmol/l乙酸铵溶液与乌洛托品提取回收率的关系图。
图3为流动相纯水:乙腈＝70:30时乌洛托品的色谱图。
图4为采用本发明的方法绘制的二氧化硫脲标准曲线。
具体实施方式
下面结合附图对本发明作进一步说明。
实施例1
一种测定米面及制品中乌洛托品含量的方法，其包括以下步骤。
步骤1、将待测食品制成样品，本实施例的待测食品为由米面制成的固体食品，将该固体状待测食品粉碎至颗粒直径不大于0.3mm作为样品；本实施例的样品中未检出含有乌洛托品，因此先称取样品1kg，加入4mg乌洛托品，混匀得到样品p1，其乌洛托品含量的加标值为4mg/kg。
从步骤2开始进行6组平行试验，即称取2.5g步骤1的样品p1各6份，分别置于6个不同的离心管中，成6组平行试验，每组平行试验依次进行步骤2至4。
步骤2、称取2.5g步骤1的样品p1至离心管中，向离心管中加入5ml浓度为20mmol/l乙酸铵，所述乙酸铵溶液用氨水调节ph值至10，涡旋振荡混匀后超声提取8min，用离心机于8000r/min下离心2min，将离心管中的上清液转移至容量瓶中。
步骤3、继续向步骤2的离心管中加入5ml浓度为20mmol/l乙酸铵，之后，将离心管中的剩余物与乙酸铵涡旋振荡混匀后,超声提取8min，用离心机于8000r/min下离心2min，将离心管中的上清液再次转移至步骤2的容量瓶中，用20mmol/l乙酸铵将容量瓶中的上清液定容至10ml，混匀得到样品清液；本步骤中所述乙酸铵溶液用氨水调节ph值至10。
步骤4、用0.22um水相微孔滤膜过滤步骤3制得的样品清液后，得到样品待测液。
步骤5、用高效液相色谱仪进行测定。
高效液相色谱仪的测定条件为：色谱柱为hilic柱、3.5um、4.6×150mm；进样量为10ul；柱温为28℃；流速为0.8ml/min；测定波长210nm；流动相为：纯水和乙腈的混合物，纯水:乙腈的体积比为70:30；检测时间为6分钟；
将乌洛托品标准工作液及步骤4制得的样品待测液分别注入高效液相色谱仪中，测定样品待测液和乌洛托品标准工作液的峰面积，以乌洛托品标准工作液的色谱峰的峰面积为纵坐标y，以乌洛托品标准工作液的乌洛托品浓度为横坐标x，绘制标准曲线，如图4所示，得到标准曲线方程为y=1.647x+0.3669，相关系数r2为0.9999。
其中，本实施例中乌洛托品标准工作液采用7个浓度的乌洛托品标准液，分别为：0、5.00、10.00、20.00、50.00、100.00、200.00mg/l，其配制方法为：称取0.1000g乌洛托品标准物质，用纯水定容至100ml容量瓶中，得到浓度为1.00mg/l的乌洛托品溶液，再吸取上述1.00mg/l的乌洛托品溶液0、50、100、200、500、1000、2000ul溶液分别置于7个不同的10ml容量瓶中，分别用20mmol/l乙酸铵溶液定容至10ml，所述乙酸铵溶液用氨水调节ph值至10，得到浓度为0、5.00、10.00、20.00、50.00、100.00、200.00mg/l的乌洛托品标准溶液。
步骤6、将样品待测液的色谱峰的峰面积，峰面积如表1中所示，根据标准曲线方程，计算得到6组平行试验的样品待测液的乌洛托品浓度a、单位为mg/l，再计算得出6组平行试验的样品p1中乌洛托品的质量含量，作为乌洛托品含量检测值b，样品p1中乌洛托品含量检测值b的计算公式为：b=（a×v）/m、单位为mg/kg；其中v为步骤3定容的样品清液体积、单位l，m为步骤2称取的样品p1质量、单位kg；具体检测结果见表2。
实施例2
本实施例的测定米面及制品中乌洛托品含量的方法，其包括以下步骤：
步骤1、将待测制品粉碎成颗粒直径不大于0.3mm的样品，本实施例中待测制品未检出含有乌洛托品，因此先称取样品1kg，加入8mg乌洛托品，混匀得到样品p2，其乌洛托品含量的加标值为8mg/kg。
从步骤2开始进行6组平行试验，即称取2.5g步骤1的样品p2各6份，分别置于6个不同的离心管中，成6组平行试验，每组平行试验依次进行步骤2至4。
步骤2、称取2.5g步骤1的样品p2至离心管中，向离心管中加入5ml浓度为20mmol/l乙酸铵，所述乙酸铵溶液用氨水调节ph值至10，涡旋振荡混匀后超声提取10min，用离心机于10000r/min下离心3min，将离心管中的上清液转移至容量瓶中。
步骤3、继续向步骤2的离心管中加入5ml浓度为20mmol/l乙酸铵，之后，将离心管中的剩余物与乙酸铵涡旋振荡混匀后,超声提取10min，用离心机于10000r/min下离心3min，将离心管中的上清液再次转移至步骤2的容量瓶中，用20mmol/l乙酸铵将容量瓶中的上清液定容至10ml，混匀得到样品清液；本步骤中所述乙酸铵溶液用氨水调节ph值至10。
步骤4至步骤6与实施例1的相同，本实施例中样品待测液的色谱峰的峰面积如表1中所示，具体检测结果见表2。
实施例3
本实施例的测定米面及制品中乌洛托品含量的方法，其包括以下步骤：
步骤1、将待测制品粉碎成颗粒直径不大于0.3mm的样品，本实施例中待测制品未检出含有乌洛托品，因此先称取样品1kg，加入40mg乌洛托品，混匀，得到样品p3，其乌洛托品含量的加标值为40mg/kg。
从步骤2开始进行6组平行试验，即称取2.5g步骤1的样品p3各6份，分别置于6个不同的离心管中，成6组平行试验，每组平行试验依次进行步骤2至4。
步骤2、称取2.5g步骤1的样品p3至离心管中，向离心管中加入5ml浓度为20mmol/l乙酸铵，所述乙酸铵溶液用氨水调节ph值至10，涡旋振荡混匀后超声提取12min，用离心机于12000r/min下离心5min，将离心管中的上清液转移至容量瓶中。
步骤3、继续向步骤2的离心管中加入5ml浓度为20mmol/l乙酸铵，之后，将离心管中的剩余物与乙酸铵涡旋振荡混匀后,超声提取12min，用离心机于12000r/min下离心5min，将离心管中的上清液再次转移至步骤2的容量瓶中，用20mmol/l乙酸铵将容量瓶中的上清液定容至10ml，混匀得到样品清液；本步骤中所述乙酸铵溶液用氨水调节ph值至10。
步骤4至步骤6与实施例1的相同，本实施例中样品待测液的色谱峰的峰面积如表1中所示，具体检测结果见表2。
对本发明的测定米面及制品中乌洛托品含量的方法的准确度进行衡量，具体见表3，各实施例的相对标准偏差rsd及回收率均符合gb/t27404-2008《实验室质量控制规范米面及制品中理化检测》的要求，因此本发明可准确、高效、稳定的用于测定米面及制品中乌洛托品含量。