本申请属于烟草代谢组学技术领域，具体涉及一种烟叶中多酚类化合物的检测方法专利申请事宜。
背景技术
我国是世界上最大的烟草生产国，烟叶作为高税率产品，其产量与品质直接关系到我国国民经济的发展。烟草成分比较复杂，其中植物多酚类化合物对烟叶产量的提高与品质的保持起着至关重要的作用。
多酚类物质是植物生长发育过程中的一类重要的次生代谢产物。多酚类物质虽然包括很多种，但统计表明，其中芸香苷、绿原酸含量比例最高，绿原酸占总多酚的比例甚至可达75%～90%。就烟草中多酚类物质检测而言，不同烟草品种、不同多酚类化合物的含量参差不齐，有些多酚化合物的含量又过于偏低不易检测，因此选用合适的样品处理方法以及检测方法尤为重要。而准确测定烟草中的酚类物质对于烟草鉴定、烟草制品质量控制及中式卷烟的开发具有重要意义。
现有技术中，烟草中多酚类化合物的测定方法主要有分光光度法、气相色谱法和液相色谱法和高效液相色谱-质谱联用法等。近年来，国内外关于烟叶中多酚类物质定性定量分析已有较多报道，其中液质联用由于样品处理简单、灵敏度高、定性定量结果可靠、快速简便、高自动化、回收率高、适用于复杂基质样品的分析等特点，已经发展为多酚类检测的主流方法。但总体而言，现有检测方法、多酚检测种类仍然较为有限，且灵敏度不高。因此，探索、建立一种新的烟叶中高通量、高灵敏度的、可对多种多酚类化合物同时进行检测分析的方法，对多酚类化合物的网络互作和烟叶培育研究具有重要理论意义和应用价值。
技术实现要素：
本申请目的在于提供一种针对烟叶多酚类化合物的检测方法，该方法属于液相色谱-串联质谱法，可对新鲜烟叶中的中山奈酚（kaemferol）、花青素（cyanidin）、氯化花翠素（delphinidinchloride）、鼠李金（rhamnazin）、绿原酸（chlorogenicacid）、飞燕草素葡萄糖苷（delphinidin3-o-b-d-glucosidechloride）、原花青素b2（procyanidineb2）、花青素鼠李糖苷（keracyaninchloride）、芸香苷（rutin）、莨菪亭（scopoletin）中一种或任意几种组合同时进行检测，从而为烟草相关植物生理学的分析和研究奠定基础。
本申请所采取的技术方案详述如下。
一种烟叶中多酚类化合物的检测方法，该方法利用液相色谱-串联质谱联用仪来实现，可对烟叶中的中山奈酚、花青素、氯化花翠素、鼠李金、绿原酸、飞燕草素葡萄糖苷、原花青素b2、花青素鼠李糖苷、芸香苷和莨菪亭中一种或任意几种同时检测；具体包括如下步骤：
（一）对预处理后新鲜烟叶进行萃取
首先，对待测新鲜烟叶进行预处理，具体而言：先用液氮速冻，冷冻干燥后，再用粉碎机打碎（100~300目粉碎）备用；
其次，用萃取溶剂对打碎后新鲜烟叶进行萃取；
所述萃取溶剂，为乙醇与水混合物，以体积比计，乙醇：水=4~5：1；（具体例如为：乙醇：水=80：20，v/v）
萃取时，优选采用超声辅助萃取；
具体物料用量方面，参考设置如下：
新鲜烟叶样品：萃取溶剂=50mg：1~2ml；具体例如为：新鲜烟叶样品50mg，萃取溶剂1.5ml；
超声辅助（具体例如采用超声波细胞破碎仪）萃取时间为1~2h（超声功率在20khz以上）；
需要说明的是，该方法同样可以用于贮藏烟叶中多酚物质含量检测，但针对贮藏烟叶应用时，样本量应适当加大（例如，相当于上述技术方案中新鲜烟叶的10倍样品量），以确保萃取效果；
（二）制备待检液
分离获得步骤（一）中含有植物多酚的萃取相，冷冻、离心（20000转离心15min），取上清液冷冻干燥；
将冷冻干燥后的样品复溶后离心（20000转离心3min），取上清液备用待检；
所述复溶，采用80%乙醇-水溶液作为复溶溶剂，对应步骤（一）中物料用量及上述过柱分离样品量，复溶溶剂用量为200μl；
（三）液相色谱-串联质谱（lc-ms/ms）检测分析
液相色谱、质谱条分析时，具体参数参考设置如下：
色谱柱：behphenyl色谱柱，柱的规格为：2.1×150mm，1.7μm；
色谱检测分析时：
柱温，35℃；
流动相为：a，含0.1%甲酸的水；b，含0.1%甲酸的甲醇；
流速：0.3ml/min；进样量：1μl；
梯度洗脱：
0~2min：b相由5%升到15%；
2min-10min：b相保持15%；
10.01min-15min：b相升到100%；
质谱检测分析时：
离子源：电喷雾离子源，正离子扫描，实时多反应监测（mrm模式，multireactionmonitoring）；
干燥气温度：290℃；干燥气流量：12l/min；
雾化器压力：40psi；鞘气温度：200℃，鞘气流量：11l/min；
正离子电离模式下毛细管电压：4kv。
所述新鲜烟叶中多酚类化合物的检测方法，具体检测分析过程中，mrm模式下10种植物多酚的特征碎片离子：
需要解释的是，质谱检测分析时，山奈酚、花青素、氯化花翠素、鼠李金、绿原酸、飞燕草素葡萄糖苷、原花青素、花青素鼠李糖苷、芸香苷和莨菪亭在正离子模式下主要产生[m＋h]＋准分子离子峰，其母子离子m/z分别为287.1/152.9，288.07/213.9，303/228.9，331.1/315.9，355.11/163.1，465.1/302.8，579.2/127，595.2/286.8，611.2/302.9，193.05/132.9；这些离子响应值高且结果稳定、重现性好，杂质干扰也较少，选为定量定性离子对，用于对样品中这10种多酚类化合物的定量。
具体定量测定时：利用80%乙醇-水溶液分别配制山奈酚、花青素、氯化花翠素、鼠李金、绿原酸、飞燕草素葡萄糖苷、原花青素、花青素鼠李糖苷、芸香苷和莨菪亭母液以及其混合标准工作溶液。用混合标准储备液分别配制用于正离子扫描模式的系列浓度的混合标准溶液，并进行测定，每个浓度平行测定3次，以分析物的峰面积与内标峰面积之比（y）为纵坐标、标样的浓度（x，μg/ml）为横坐标进行线性拟合，得到10种植物多酚化合物的线性方程和相关系数（r2）；以信噪比（s/n）为3确定10种植物多酚类化合物的检出限（lod），结果如下表所示：
10种植物多酚类的线性方程、相关系数及检出限：
基于此线性方程，以及待测样品的峰面积检测结果，从而计算获得待测样品中一种或几种植物多酚的具体含量。
总体而言，本申请所提供植物多酚检测方法，首先对前处理过程进行了进一步的优化；另一方面，相较于现有植物多酚测定方法，本申请采用lc-ms/ms法进行检测时，灵敏度较高，且可单独测一种、或者同时测定其中几种、甚至同时对10种植物多酚类化合物进行定性或定量测定。再者，由于正离子实时选择性检测模式（dmrm）选择性好，干扰小，效率高，检测一个样本的时间仅15min，因此本发明能有效地提高分析效率，非常适合复杂基质中低含量目标物的分析。
总之，相对于常规的多酚检测分析方法，本申请所提供检测方法具有分析速度快、研究对象多、精密度好、加标回收率高、稳定性良好等优点，因而具有较好的实用价值和推广应用意义。
附图说明
图1为10种多酚类化合物混合标样的总离子流tic图；
图2为tmv特异引物对烟叶样品pcr检测结果的琼脂糖凝胶电泳图。
具体实施方式
下面结合实施例对本申请做进一步的解释说明。在介绍具体实施例前，就下述实施例中部分实验背景情况简要介绍说明如下。
样品材料：下述实施例中新鲜烟叶样品为被tmv感染的鲜烟叶（k326烟叶，生长2个月左右的烟叶）片和未被感染的正常对照烟叶；
其他相关试剂及仪器均为本领域常用试剂和常见仪器，不再赘述。
实施例
以对新鲜烟叶中的10种多酚类物质（中山奈酚（kaemferol）、花青素（cyanidin）、氯化花翠素（delphinidinchloride）、鼠李金（rhamnazin）、绿原酸（chlorogenicacid）、飞燕草素葡萄糖苷（delphinidin3-o-b-d-glucosidechloride）、原花青素b2（procyanidineb2）、花青素鼠李糖苷（keracyaninchloride）、芸香苷（rutin）、莨菪亭（scopoletin））同时检测为例，就本申请所提供的检测方法详细介绍如下。
（一）对预处理后新鲜烟叶进行萃取
首先，取50mg被tmv感染的新鲜烟叶片，先用液氮速冻，冷冻干燥后，再用粉碎机打碎（200目粉碎）备用；
其次，将粉碎后烟叶样品置于离心管中，加入1.5ml萃取溶剂（乙醇与水混合物，以体积比计，乙醇：水=80：20）
萃取时，将含有萃取溶剂的离心管置于超声波细胞破碎仪（美国，sonics公司）内，超声萃取1h。
（二）制备待检液
分离获得步骤（一）中含有植物多酚的萃取相，冷冻、离心（20000转离心15min），取上清液冷冻干燥；
将冷冻干燥后的样品用200μl、80%乙醇复溶后离心（20000转离心3min），取上清液备用待检。
（三）液相色谱-串联质谱（lc-ms/ms）检测分析
液相色谱、质谱条分析时，具体参数参考设置如下：
色谱柱：behphenyl色谱柱，柱的规格为：2.1×150mm，1.7μm；
色谱检测分析时：
柱温，35℃；
流动相为：a，含0.1%甲酸的水；b，含0.1%甲酸的甲醇；
流速：0.3ml/min；进样量：1μl；
梯度洗脱：
0~2min：b相由5%升到15%；
2min-10min：b相保持15%；
10.01min-15min：b相升到100%；
质谱检测分析时：
离子源：电喷雾离子源，正离子扫描，实时多反应监测（mrm模式，multireactionmonitoring）；
干燥气温度：290℃；干燥气流量：12l/min；
雾化器压力：40psi；鞘气温度：200℃，鞘气流量：11l/min；
正离子电离模式下毛细管电压：4kv。
参考上述操作，对未受tmv感染的新鲜烟叶片进行色谱-质谱分析作为对照。
需要解释和说明的是，在对待测样品进行具体质谱分析前，发明人首先分别对10种植物多酚标准品在mrm模式下的特征碎片离子情况进行了具体检测分析。10种植物多酚标准品在mrm模式下的特征碎片离子情况如下表1所示。
表110种植物多酚标准品在mrm模式下获得的特征碎片离子
需要解释的是，质谱检测分析时，山奈酚、花青素、氯化花翠素、鼠李金、绿原酸、飞燕草素葡萄糖苷、原花青素、花青素鼠李糖苷、芸香苷和莨菪亭在正离子模式下主要产生[m＋h]＋准分子离子峰，其母子离子m/z分别为287.1/152.9，288.07/213.9，303/228.9，331.1/315.9，355.11/163.1，465.1/302.8，579.2/127，595.2/286.8，611.2/302.9，193.05/132.9；这些离子响应值高且结果稳定、重现性好，杂质干扰也较少，选为定量定性离子对，用于对样品中这10种多酚类化合物的定量。
具体定量测定时：利用80%乙醇-水溶液分别配制山奈酚、花青素、氯化花翠素、鼠李金、绿原酸、飞燕草素葡萄糖苷、原花青素、花青素鼠李糖苷、芸香苷和莨菪亭母液以及其混合标准工作溶液。用混合标准储备液分别配制用于正离子扫描模式的系列浓度的混合标准溶液，并进行测定（混合标样检测结果如图1所示），每个浓度平行测定3次，分析物的峰面积与内标峰面积之比（y）为纵坐标、标样的浓度（x，μg/ml）为横坐标进行线性拟合，得到10种植物多酚化合物的线性方程和相关系数（r2）；以信噪比（s/n）为3确定10种植物多酚类化合物的检出限（lod），结果如下表所示：
表210种植物多酚类的线性方程、相关系数及检出限：
基于此线性方程，以及待测样品的峰面积检测结果，从而计算获得待测样品中一种或几种植物多酚的具体含量。
依据上述回归方程及最终色谱-质谱检测结果，最终计算可知，tmv侵染的烟叶中所含山奈酚、花青素、氯化花翠素、鼠李金、绿原酸、飞燕草素葡萄糖苷、原花青素、花青素鼠李糖苷、芸香苷和莨菪亭分别为26.95μg/g，6.17μg/g，2.23μg/g，15.76μg/g，6481.24μg/g，25.25μg/g，0.21μg/g，0.68μg/g，1647.92μg/g，0.11μg/g；其对照样品的山奈酚、花青素、氯化花翠素、鼠李金、绿原酸、飞燕草素葡萄糖苷、原花青素、花青素鼠李糖苷、芸香苷和莨菪亭的含量分别为21.27μg/g，5.64μg/g，1.61μg/g，20.84μg/g，5959.81μg/g，11.53μg/g，0.20μg/g，0.70μg/g，600.22μg/g，0.10μg/g。对上述结果具体列表如下：
表3tmv病毒感染后对烟叶样品中10种植物多酚类含量影响情况
对上表结果进一步分析可以看出，tmv感染后，烟叶中部分多酚类物质含量发生了明显变化，基于这些变化可为烟草进一步的生理学研究、品种培育等奠定应用基础。
需要说明的是，为确保上述多酚检测结果的准确性，确定相关多酚含量差异是由tmv侵染所导致的，在具体检测前，发明人以特异性引物对烟叶样品进行了pcr检测，确定了tmv烟叶样品与对照样品之间差异的真实性（具体pcr检测验证结果如图2所示）。
进一步地，为确定本申请所提供检测方法的准确性和可重复性，发明人对同一烟叶样品在一天内进行5次平行测定及分别进行了5天连续性测定，测定结果的相对标准偏差表示该方法的日内精密度和日间精密度，同时进行加标回收率实验，结果如表4和表5所示。
表4本申请测定方法的日内精密度(rsd，%，n=5)和日间精密度(rsd，%，n=5)
表510种植物多酚类的加标回收率和rsd(n=3)
对上表结果进行分析可以看出，该检测方法的精密度好、加标回收率高，可较好满足大批量样品的检测分析要求，因而具有较好的实用价值。