本发明涉及一种基于金功能化钛掺杂溴氧铋微球的电化学发光传感器的制备方法及应用。具体是采用金功能化钛掺杂溴氧铋微球作为发光材料和基底，制备了一种检测n-端脑钠肽前体的无标记型电化学发光传感器，属于电化学分析和生物传感器领域。
背景技术
心力衰竭是全球最严峻的健康问题之一，全世界有2300多万人患有心力衰竭。心衰的发病率逐年升高，迫使我们必须重视对心衰早期正确的诊断和治疗，以延长病人的寿命、改善其生活质量。作为心功能紊乱最敏感和特异的指标，n-端脑钠肽前体在心力衰竭的筛选、疗效评估和预后判断中具有重要的价值。如何实现对n-端脑钠肽前体的高效灵敏准确地检测是目前亟待解决的问题。
目前检测n-端脑钠肽前体的分析方法主要有放射免疫检定法和酶联免疫分析法，尽管这两种方法有一定的优越性，但也存在着明显的局限性，其中放射免疫检定法存在放射性废物处理等问题、设备复杂，酶联免疫分析法测定周期长、重现性较差、灵敏度较低。为了克服以上传统分析方法的弊端，本发明制备了一种操作简单快速、灵敏度高的电化学发光传感器用于n-端脑钠肽前体的检测。
电化学发光是由电化学反应直接或间接引发的化学发光现象，作为电化学和化学发光互相交叉渗透的产物，该方法既有发光分析的超高灵敏度，又结合了电化学电位可控的优点，所以引起了分析化学和生物分析等诸多领域的高度重视。目前用于检测n-端脑钠肽前体的电化学发光传感器大多是基于夹心型免疫传感策略，该传感策略标记步骤复杂、实验成本高且耗时长。基于此，本发明制备了一种无标记型检测n-端脑钠肽前体的电化学发光传感器，该传感器具有制备简单、响应迅速、成本较低等优点。
传统电化学发光材料如鲁米诺、三联吡啶钌等具有在电极表面固定困难、发光信号不稳定等缺点。因此，本发明制备了一种金功能化钛掺杂溴氧铋微球，并发现该材料能够产生稳定的电化学发光信号且易于固定在电极表面，该材料在电化学发光传感器中的应用尚属首次。本发明制备的钛掺杂溴氧铋微球具有大的比表面积和稳定的电化学发光信号。用金纳米粒子将其功能化后，金功能化钛掺杂溴氧铋微球的导电性提高，电化学发光信号进一步增强，其电化学发光信号为钛掺杂溴氧铋微球的两倍以上。本发明将金功能化钛掺杂溴氧铋微球作为发光材料和基底，制备了一种无标记型电化学发光传感器，用于n-端脑钠肽前体的灵敏检测。本发明制备的电化学发光传感器对n-端脑钠肽前体的检测范围为1pg·ml-1-50ng·ml-1，检测限达到0.33pg·ml-1。该传感器可有效用于n-端脑钠肽前体的分析检测，具有制备简单快速、分析成本低、灵敏度高等优点。
技术实现要素：
本发明的目的之一是合成花状钛掺杂溴氧铋微球并将其作为电化学发光材料。花状溴氧铋微球具有较大的比表面积，钛的掺杂使其比表面积增大，并在界面形成异质结。
本发明的目的之二是用金纳米粒子将钛掺杂溴氧铋微球功能化以提高其导电性。金纳米粒子提高了钛掺杂溴氧铋微球的导电性，此外，金纳米粒子具有良好的生物相容性，能够通过金-氨键与抗体连接。
本发明的目的之三是提供一种简单易行的n-端脑钠肽前体传感器的制备方法。将金功能化钛掺杂溴氧铋微球作为发光材料和基底，不需要复杂繁琐的标记技术，即可实现对n-端脑钠肽前体的快速灵敏检测。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
1.一种基于金功能化钛掺杂溴氧铋微球的电化学发光传感器的制备方法及应用，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将直径为4mm的玻碳电极用氧化铝粉打磨抛光至镜面，再用超纯水洗涤干净；
（2）将6µl、浓度为4～14mg·ml-1金功能化钛掺杂溴氧铋微球的水溶液滴涂到电极表面，室温保存至干燥；
（3）滴涂6μl、浓度为2～14μg·ml-1的n-端脑钠肽前体的抗体溶液于玻碳电极表面，4℃下保存至干燥，超纯水清洗；
（4）滴涂3μl、质量分数为1%的牛血清白蛋白，封闭非特异性活性位点，4℃下保存至干燥，超纯水清洗；
（5）将6μl、浓度为0.001-50ng·ml-1的一系列不同浓度的n-端脑钠肽前体滴涂在电极表面，4℃下保存至干燥，超纯水清洗，即制得检测n-端脑钠肽前体的电化学发光传感器。
2.如权利要求1所述的一种基于金功能化钛掺杂溴氧铋微球的电化学发光传感器的制备方法及应用，所述金功能化钛掺杂溴氧铋微球，其特征在于，制备步骤如下：
（1）钛掺杂溴氧铋微球的制备
将0.4～0.8gbi(no3)3·5h2o溶解到60ml2-甲氧基乙醇中，搅拌使其形成澄清溶液，然后缓慢加入1.2g十六烷基三甲基溴化铵和0.3ml钛酸四丁酯，磁力搅拌30min后将上述溶液转移至反应釜中，160℃反应24h。冷却至室温后，离心、洗涤、干燥得到钛掺杂溴氧铋微球；
（2）金功能化钛掺杂溴氧铋微球的制备
将0.3～0.5g上述制备的钛掺杂溴氧铋微球分散到100ml超纯水中，超声1h后，用氨水调节溶液ph至11。将5ml、质量分数为1%的haucl4逐滴加入到上述溶液中，50℃下磁力搅拌5h，离心、洗涤、干燥后得到金功能化钛掺杂溴氧铋微球。
3.如权利要求1所述的电化学发光传感器用于n-端脑钠肽前体的检测，其特征在于，步骤如下：
（1）将ag/agcl电极作为参比电极、铂丝电极作为对电极、所制得的电化学发光传感器作为工作电极，连接在化学发光检测仪的暗盒中，将电化学工作站和化学发光检测仪连接在一起；
（2）化学发光检测仪参数设置为，光电倍增管的高压设置为750v，扫描速率设置为0.1v/s；
（3）电化学工作站参数设置为，循环伏安扫描电位范围为-1.8～0v，扫描速率设置为0.1v/s；
（4）使用含100mmkcl和40～140mmk2s2o8的pbs缓冲溶液作为测试底液，通过电化学发光法检测不同浓度的n-端脑钠肽前体产生的电化学发光信号强度；所述pbs缓冲溶液，其ph=5.5～8.5，用0.1mna2hpo4和0.1mkh2po4配制；
（5）根据所得的电化学发光强度值与n-端脑钠肽前体浓度对数的线性关系，绘制工作曲线。
本发明的有益成果
（1）本发明利用钛的掺杂使溴氧铋微球的比表面积由11.55m2/g增加到109.2m2/g，同时钛与溴氧铋之间形成了界面异质结，减小了溴氧铋的带隙，使得溴氧铋的电化学发光强度增强，钛掺杂溴氧铋微球在电化学发光传感器中的应用尚属首次；
（2）本发明制备的钛掺杂溴氧铋微球具有大的比表面积，可以固载大量的金纳米粒子，以便结合更多的抗体，同时金纳米粒子提高了基底材料的导电性，进一步增强了电化学发光信号，金功能化钛掺杂溴氧铋微球的电化学发光信号为钛掺杂溴氧铋微球的两倍以上；
（3）本发明将金功能化钛掺杂溴氧铋微球作为电化学发光材料和基底，制备了无标记型电化学发光传感器用于n-端脑钠肽前体的检测。该传感器操作简单，反应迅速，可以实现对n-端脑钠肽前体的高选择性和高灵敏检测。本发明制备的传感器对n-端脑钠肽前体检测的线性范围为1pg·ml-1-50ng·ml-1，检测限为0.33pg·ml-1。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1
1.一种基于金功能化钛掺杂溴氧铋微球的电化学发光传感器的制备方法
（1）钛掺杂溴氧铋微球的制备
将0.4gbi(no3)3·5h2o溶解到60ml2-甲氧基乙醇中，搅拌使其形成澄清溶液，然后缓慢加入1.2g十六烷基三甲基溴化铵和0.3ml钛酸四丁酯，磁力搅拌30min后将上述溶液转移至反应釜中，160℃反应24h。冷却至室温后，离心、洗涤、干燥得到钛掺杂溴氧铋微球。
（2）金功能化钛掺杂溴氧铋微球的制备
将0.3g上述制备的钛掺杂溴氧铋微球分散到100ml超纯水中，超声1h后，用氨水调节溶液ph至11。将5ml、质量分数为1%的haucl4逐滴加入到上述溶液中，50℃下磁力搅拌5h，离心、洗涤、干燥后得到金功能化钛掺杂溴氧铋微球。
（3）电化学发光传感器的制备
1）将直径为4mm的玻碳电极用氧化铝粉打磨抛光至镜面，再用超纯水洗涤干净；
2）将6µl、浓度为4mg·ml-1金功能化钛掺杂溴氧铋微球的水溶液滴涂到电极表面，室温保存至干燥；
3）滴涂6μl、浓度为6μg·ml-1的n-端脑钠肽前体的抗体溶液于玻碳电极表面，4℃下保存至干燥，超纯水清洗；
4）滴涂3μl、质量分数为1%的牛血清白蛋白，封闭非特异性活性位点，4℃下保存至干燥，超纯水清洗；
5）将6μl、浓度为0.001-50ng·ml-1的一系列不同浓度的n-端脑钠肽前体滴涂在电极表面，4℃下保存至干燥，超纯水清洗。
2.将所述的电化学发光传感器应用于对n-端脑钠肽前体的检测
（1）将ag/agcl电极作为参比电极、铂丝电极作为对电极、所制得的电化学发光传感器作为工作电极，连接在化学发光检测仪的暗盒中，将电化学工作站和化学发光检测仪连接在一起；
（2）化学发光检测仪参数设置为，光电倍增管的高压设置为750v，扫描速率设置为0.1v/s；
（3）电化学工作站参数设置为，循环伏安扫描电位范围为-1.8～0v，扫描速率设置为0.1v/s；
（4）使用含100mmkcl和40～140mmk2s2o8的pbs缓冲溶液作为测试底液，通过电化学发光法检测不同浓度的n-端脑钠肽前体产生的电化学发光信号强度；所述pbs缓冲溶液，其ph=5.5～8.5，用0.1mna2hpo4和0.1mkh2po4配制；
（5）根据所得的电化学发光强度值与n-端脑钠肽前体浓度对数的线性关系，绘制工作曲线。
实施例2
1.一种基于金功能化钛掺杂溴氧铋微球的电化学发光传感器的制备方法
（1）钛掺杂溴氧铋微球的制备
将0.5gbi(no3)3·5h2o溶解到60ml2-甲氧基乙醇中，搅拌使其形成澄清溶液，然后缓慢加入1.2g十六烷基三甲基溴化铵和0.3ml钛酸四丁酯，磁力搅拌30min后将上述溶液转移至反应釜中，160℃反应24h。冷却至室温后，离心、洗涤、干燥得到钛掺杂溴氧铋微球。
（2）金功能化钛掺杂溴氧铋微球的制备
将0.5g上述制备的钛掺杂溴氧铋微球分散到100ml超纯水中，超声1h后，用氨水调节溶液ph至11。将5ml、质量分数为1%的haucl4逐滴加入到上述溶液中，50℃下磁力搅拌5h，离心、洗涤、干燥后得到金功能化钛掺杂溴氧铋微球。
（3）电化学发光传感器的制备
1）将直径为4mm的玻碳电极用氧化铝粉打磨抛光至镜面，再用超纯水洗涤干净；
2）将6µl、浓度为10mg·ml-1金功能化钛掺杂溴氧铋微球的水溶液滴涂到电极表面，室温保存至干燥；
3）滴涂6μl、浓度为6μg·ml-1的n-端脑钠肽前体的抗体溶液于玻碳电极表面，4℃下保存至干燥，超纯水清洗；
4）滴涂3μl、质量分数为1%的牛血清白蛋白，封闭非特异性活性位点，4℃下保存至干燥，超纯水清洗；
5）将6μl、浓度为0.001-50ng·ml-1的一系列不同浓度的n-端脑钠肽前体滴涂在电极表面，4℃下保存至干燥，超纯水清洗。
2.将所述的电化学发光传感器应用于对n-端脑钠肽前体的检测
（1）将ag/agcl电极作为参比电极、铂丝电极作为对电极、所制得的电化学发光传感器作为工作电极，连接在化学发光检测仪的暗盒中，将电化学工作站和化学发光检测仪连接在一起；
（2）化学发光检测仪参数设置为，光电倍增管的高压设置为750v，扫描速率设置为0.1v/s；
（3）电化学工作站参数设置为，循环伏安扫描电位范围为-1.8～0v，扫描速率设置为0.1v/s；
（4）使用含100mmkcl和40～140mmk2s2o8的pbs缓冲溶液作为测试底液，通过电化学发光法检测不同浓度的n-端脑钠肽前体产生的电化学发光信号强度；所述pbs缓冲溶液，其ph=5.5～8.5，用0.1mna2hpo4和0.1mkh2po4配制；
（5）根据所得的电化学发光强度值与n-端脑钠肽前体浓度对数的线性关系，绘制工作曲线。
实施例3
1.一种基于金功能化钛掺杂溴氧铋微球的电化学发光传感器的制备方法
（1）钛掺杂溴氧铋微球的制备
将0.8gbi(no3)3·5h2o溶解到60ml2-甲氧基乙醇中，搅拌使其形成澄清溶液，然后缓慢加入1.2g十六烷基三甲基溴化铵和0.3ml钛酸四丁酯，磁力搅拌30min后将上述溶液转移至反应釜中，160℃反应24h。冷却至室温后，离心、洗涤、干燥得到钛掺杂溴氧铋微球。
（2）金功能化钛掺杂溴氧铋微球的制备
将0.4g上述制备的钛掺杂溴氧铋微球分散到100ml超纯水中，超声1h后，用氨水调节溶液ph至11。将5ml、质量分数为1%的haucl4逐滴加入到上述溶液中，50℃下磁力搅拌5h，离心、洗涤、干燥后得到金功能化钛掺杂溴氧铋微球。
（3）电化学发光传感器的制备
1）将直径为4mm的玻碳电极用氧化铝粉打磨抛光至镜面，再用超纯水洗涤干净；
2）将6µl、浓度为12mg·ml-1金功能化钛掺杂溴氧铋微球的水溶液滴涂到电极表面，室温保存至干燥；
3）滴涂6μl、浓度为6μg·ml-1的n-端脑钠肽前体的抗体溶液于玻碳电极表面，4℃下保存至干燥，超纯水清洗；
4）滴涂3μl、质量分数为1%的牛血清白蛋白，封闭非特异性活性位点，4℃下保存至干燥，超纯水清洗；
5）将6μl、浓度为0.001-50ng·ml-1的一系列不同浓度的n-端脑钠肽前体滴涂在电极表面，4℃下保存至干燥，超纯水清洗。
2.将所述的电化学发光传感器应用于对n-端脑钠肽前体的检测
（1）将ag/agcl电极作为参比电极、铂丝电极作为对电极、所制得的电化学发光传感器作为工作电极，连接在化学发光检测仪的暗盒中，将电化学工作站和化学发光检测仪连接在一起；
（2）化学发光检测仪参数设置为，光电倍增管的高压设置为750v，扫描速率设置为0.1v/s；
（3）电化学工作站参数设置为，循环伏安扫描电位范围为-1.8～0v，扫描速率设置为0.1v/s；
（4）使用含100mmkcl和40～140mmk2s2o8的pbs缓冲溶液作为测试底液，通过电化学发光法检测不同浓度的n-端脑钠肽前体产生的电化学发光信号强度；所述pbs缓冲溶液，其ph=5.5～8.5，用0.1mna2hpo4和0.1mkh2po4配制；
（5）根据所得的电化学发光强度值与n-端脑钠肽前体浓度对数的线性关系，绘制工作曲线。