一种高稳定快速比色检测铵根的试剂的制作方法

本发明属于环境和非制式爆炸物原料检测领域，提供了一种不仅能够稳定保存，而且绿色无毒的比色检测铵根的试剂。本试剂检测限低、抗干扰性强且反应时间短，完全可以实现低成本、实时比色检测铵根的目的。

背景技术

随着工业和农业的飞速发展，大量的含氮化合物(如铵根类化合物)排入了表面和地下水中(sensorsandactuatorsb:chemical,2018,256:167-175)。在这些含氮化合物中，溶解的铵根是生态环境中氮循环过程非常重要的组分。而过量的铵根会导致水中藻类植物的快速增殖，而藻类植物的过度增殖会耗尽水中的溶解氧，从而破坏水生物的平衡(sensorsandactuatorsb:chemical,2004,98:12-17)。更为严重的是，铵盐基爆炸物被广泛应用于恐怖袭击活动。如:“爱尔兰共和军”利用硝铵和糖果混合，在北爱尔兰和伦敦制造了大量的恐怖袭击事件(scienceandjustice,2009,49:73–80)；西班牙恐怖组织埃塔(eta)、哥伦比亚革命武装力量(farc)和巴勒斯坦极端分子广泛使用硝铵-石油进行恐怖袭击活动(appliedmagneticresonance,2012,43:557-566)。除此之外，高氯酸铵由于其优异的燃烧特性，成为了组合燃料中使用最为广泛的氧化剂(combustionandflame,2018,192:10-24)。因此，针对铵根进行检测，不仅对于维持环境中的生态平衡至关重要，更是关系世界人民的生命和财产安全。目前，科研人员已经开发出了各种检测铵根的方法，如离子色谱法(journalofchromatographya,2003,997:191-197；journalofchromatographya,2003,1003:197-202)、毛细管电泳技术(journalofchromatographya,2006,1106:61-66)、气敏法(limnologyandoceanography:methods,2009,7:144-156)、化学发光法(analyticachimicaacta,1999,398:33-39)等等。然而，这些检测方法存在实验设备昂贵、需要专业的技术操作人员、检测耗时较长、抗干扰性差等缺点，严重限制了其在实际中的应用。与以上检测方法相比，比色检测法因具有操作简单、成本低、选择性和灵敏度高、检测范围广、响应时间短等优点，而受到了人们的广泛关注。

目前，比色检测铵根的最主要的两种检测方法是纳氏试剂法(journalofchemistry,2013,2013:9)和靛酚蓝法(sensorsandactuatorsb:chemical,2018，256：167–175)。纳氏试剂是在1856年由德国化学家nessler发明(chemicalcenter,1856,27,nenefolge1,529)，并一直被广泛使用的铵根检测试剂，如国家标准hj535-2009《水质氨氮的测定纳氏试剂分光光度法》就是采用纳氏试剂检测水中的铵根。然而，由于其含有大量汞离子，易造成环境污染，且容易被其它离子干扰，如cl2、cl^-、mg²⁺、fe²⁺等离子都会对铵根检测产生严重的干扰(journaloftheamericanchemicalsociety,1934,56:769-774)，严重限制了其在实际中的应用。虽然后来经过科研人员的改进，通过加入酒石酸有效地屏蔽了其它金属离子的干扰性，但是其稳定性差和剧毒的特性依然存在。1859年化学家berthelot开发出了比纳氏试剂具有更高灵敏度的试剂，该试剂由苯酚和次氯酸盐混合而成，遇到待检测离子铵根后由无色变为蓝色(report,chimieappliquee,1859,1:284)。这就是目前被广泛采用的铵根检测试剂，俗称靛酚蓝法。然而由于苯酚具有极强的毒性、反应速度过于缓慢、次氯酸根的不稳定性等缺点限制了其应用。科研人员经过100多年的努力，利用无毒的水杨酸或水杨酸钠代替苯酚，加入硝普钠或mn²⁺提高反应速度等等方法，非常有效的改善了其毒性和反应速度。然而，对于其稳定性问题，newell(journalofthemarinebiologicalassociationoftheunitedkingdom,1967,47:271)，stegemann(hoppe-seylersz.physiol.chem.,1969,329:241)，haussler(wienerklinischewochenschrift,1960,17:874)等科研人员采取了以更稳定的二氯异氰尿酸钠替代次氯酸根，kingtonglau(sensorsandactuatorsb:chemical,2004,98:12-17)，yongshinkimb(sensorsandactuatorsb:chemical,2018,256:167–175)等课题组将试剂做成固体状态的方法以提高其稳定性。然而，遗憾的是其有效期最多也只能达到24小时。此外，国际上的科研人员也开发了多种比色检测铵根的方法。如日本东北大学的nagaokobayashi课题组合成出了一种新型bodipy类荧光分子，完全可以达到裸眼比色检测铵根的目的(chemicalcommunications,2011,47:12092-12094)，但是这种荧光分子合成过程复杂，成本较高，不能批量生产。

本发明开发了一种比色检测铵根的试剂，其主要利用在碱性条件下，铵根可以使蓝色百里酚蓝溶液快速变成黄色的现象实现检测。此外，本试剂不仅具有原料均可通过商业途径购买得到、制备简便、价格低廉的优点，而且绿色无毒、快速、灵敏、高选择性及操作简单，十分具有推广应用的潜力。

技术实现要素：

本发明目的在于，提供一种高稳定快速比色检测铵根的试剂，该试剂是由百里酚蓝、四丁基氢氧化铵和溶剂为超纯水配制而成，其主要利用在碱性条件下，铵根可以使蓝色百里酚蓝溶液快速变成黄色的现象实现检测，利用百里酚蓝ph指示剂的性质开发了无需复杂的有机合成、省时省力、绿色无毒、操作简便、灵敏度高、成本低的比色检测铵根的试剂。本发明的检测试剂对铵根显示极低的检测限(裸眼检测限10μm和紫外-可见检测限为51nm)和极高的选择性，这就保证了可以针对环境和非制式爆炸物原料中的铵根成分进行检测。此外，本试剂与铵根接触后在1s内达到裸眼可视变色，无需复杂的分析设备，从而实现了铵根的低成本、即时检测。克服了现有的比色检测铵根方法毒性强、稳定性差及探针分子合成复杂等不足。

本发明所述的一种高稳定快速比色检测铵根的试剂，该试剂是由化学试剂百里酚蓝、四丁基氢氧化铵和溶剂为超纯水配制而成，其中：

四丁基氢氧化铵在溶液中的浓度为61.6nm-308nm；

百里酚蓝在溶液中的浓度为2.14μm-107μm；

将四丁基氢氧化铵和百里酚蓝按摩尔浓度溶解在超纯水中，搅拌均匀，搅拌时间为10-30min，即得到高稳定快速比色检测铵根的试剂。

本发明所述的一种高稳定快速比色检测铵根的试剂，将配制的检测试剂应用于铵根的比色检测，具体步骤如下：

制备检测试剂：

(1)将购买的40％于水的四丁基氢氧化铵(tbah)试剂用超纯水稀释10倍，即得到154μm的四丁基氢氧化铵(tbah)水溶液；

(2)称量100mg百里酚蓝溶于1l超纯水中得0.1g/l百里酚蓝水溶液，即得百里酚蓝摩尔浓度为214μm；

(3)分别量取四丁基氢氧化铵(tbah)的量为4μl、6μl、8μl、10μl、12μl、14μl、16μl、18μl和20μl，和百里酚蓝水溶液的量为100μl、200μl、400μl、600μl、800μl、1ml、1.2ml、1.4ml、1.6ml、1.8ml、2ml、2.5ml、3ml、3.5ml、4ml、4.5ml和5ml，然后用超纯水混合定容至10ml，搅拌均匀，搅拌时间为10-30min，即得到四丁基氢氧化铵(tbah)摩尔浓度为61.6nm-308nm，百里酚蓝摩尔浓度为2.14μm–107μm的检测试剂；

将配制的检测试剂应用于铵根的比色检测：

(4)称取nh4cl溶解在超纯水中，配制成铵根标准溶液浓度为1m、900mm、800mm、700mm、600mm、500mm、400mm、300mm、200mm、100mm、90mm、80mm、70mm、60mm、50mm、40mm、30mm、20mm、10mm、9mm、8mm、7mm、6mm、5mm、4mm、3mm、2mm、1mm、900μm、800μm、700μm、600μm、500μm、400μm、300μm、200μm和100μm所需浓度的nh4cl水溶液；

(5)用紫外-可见分光光度计测试不同配比试剂在遇到相同浓度铵根前后的吸光度变化，然后测试试剂与不同浓度铵根反应后的吸光度，以吸光度的变化值为纵坐标，铵根浓度为横坐标，拟合得到工作曲线的一元一次方程，从而确定试剂的检测限，其中用紫外-可见吸收光谱扫描的检测试剂体积为3ml，加入标准铵根水溶液体积为30μl；

(6)用移液枪量取10μl不同浓度的铵根水溶液于2ml容量的离心管中，加入1ml步骤(5)所配制的试剂，拍照确定试剂检测铵根的裸眼检测限，裸眼对比试剂遇到不同浓度铵根反应前后的颜色变化，确定试剂的裸眼检测限。

(7)用采样纸分别擦取微量的(nh4)3po4、nh4hco3、nh4f、nh4cl、kno3、kclo3、nano3和nano2后，滴上1-2滴检测试剂，观察颜色变化，从而确定是否含有铵盐。

本发明所述的一种高稳定快速比色检测铵根的试剂，不仅可以检测液体中的铵根，还可以检测微量的固体铵盐残留。此外，本试剂对于常见的无机盐干扰物具有优异的选择性。

本发明所述的一种高稳定快速比色检测铵根的试剂，主要针对环境和非制式爆炸物中的铵根成分进行检测，解决了当前无法针对铵根成分进行绿色无毒、高稳定、快速、可视化、低成本检测难题。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

1.本发明所述的一种高稳定快速比色检测铵根的试剂，其原料均可通过商业市场购买得到且绿色无毒环境友好；

2.本发明所述的一种高稳定快速比色检测铵根的试剂，能够灵敏、高选择性的检测铵根；

3.本发明所述的一种高稳定快速比色检测铵根的试剂，反应快速，1s内就可以实现对铵根识别；

4.本发明所述的一种高稳定快速比色检测铵根的试剂，检测铵根，无需复杂的分析设备，可以直接裸眼识别检测；

5.本发明的检测试剂无需将待测物进行任何的前期处理，操作简单，方便推广应用。

附图说明

图1为本发明百里酚蓝和四丁基氢氧化铵(tbah)在超纯水溶液中的浓度分别为107μm和308nm，与10mm铵根反应前后的的紫外-可见吸收光谱谱图，其中插图为相机拍摄的反应前后试剂颜色变化照片；

图2为本发明百里酚蓝在试剂中的浓度固定为107μm，四丁基氢氧化铵(tbah)的浓度取61.6nm-308nm，不同四丁基氢氧化铵(tbah)浓度所配制的试剂与10mm铵根反应后的的紫外-可见吸收光谱谱图；

图3为以四丁基氢氧化铵(tbah)在试剂的加入量为横坐标，435nm处的吸收值为纵坐标，拟合可得指数曲线；

图4为本发明四丁基氢氧化铵(tbah)在试剂中的浓度固定为308nm，百里酚蓝的浓度依次取2.14μm-107μm时，试剂与1m铵根反应后的的紫外-可见吸收光谱谱图。

图5为以百里酚蓝在试剂的加入量为横坐标，435nm处的吸收值为纵坐标，拟合可得线性曲线；

图6为本发明百里酚蓝和四丁基氢氧化铵(tbah)在超纯水溶液中的浓度分别为107μm和308nm，与1μm-9mm的铵根反应后所得紫外-可见吸收光谱谱图；

图7为以铵根浓度为横坐标，435nm处的吸收值为纵坐标，拟合可得指数曲线；

图8为以铵根浓度(3μm-10μm)为横坐标，435nm处的吸收值为纵坐标，拟合可得线性曲线；

图9为本发明百里酚蓝和四丁基氢氧化铵(tbah)在超纯水溶液中的浓度分别为107μm和308nm，与1μm-9mm的铵根反应后所得相机拍摄图片。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明做进一步的说明，但本发明不限制于这些实施例。

实施例1

室温下，称量100mg百里酚蓝溶于1l超纯水中得0.1g/l百里酚蓝水溶液，用移液枪量取5ml的0.1g/l百里酚蓝水溶液，20μl的超纯水稀释10倍的40％于水的四丁基氢氧化铵(tbah)水溶液，与5ml超纯水搅拌至混合均匀，搅拌时间为10min，得到百里酚蓝和四丁基氢氧化铵(tbah)在水溶液中浓度分别为107μm和308nm的蓝色检测试剂；

将配置好的检测试剂量取3ml置于石英比色皿中，再加入已配制的1m铵根标准液30μl，用紫外-可见分光光度计进行紫外-可见吸收光谱扫描，铵根加入前后的谱图如图1所示，通过对比反应前后谱图可以看出，反应后位于595nm处的吸收峰急剧降低，而435nm处出现了明显的吸收峰，对反应前后的试剂进行直接拍照(如图1插图所示)，对比反应前后试剂照片可以看出反应后试剂由深蓝色变为了亮黄色，说明已检出了铵根。

实施例2

室温下，称量100mg百里酚蓝溶于1l超纯水中得0.1g/l百里酚蓝水溶液，取9个玻璃瓶，用移液枪分别加入5ml的0.1g/l百里酚蓝水溶液和5ml超纯水，然后分别量取4μl、6μl、8μl、10μl、12μl、14μl、16μl、18μl和20μl已稀释10倍的40％于水的tbah水溶液，加入9个玻璃瓶中，搅拌至混合均匀，搅拌时间为20min，得到百里酚蓝摩尔浓度为107μm和四丁基氢氧化铵(tbah)摩尔浓度为61.6nm、92.4nm、123.2nm、154nm、184.8nm、215.6nm、246.4nm、277.2nm和308nm的蓝色检测试剂；

将配置好的检测试剂量取3ml置于石英比色皿中，再加入已配制的1m铵根标准水溶液30μl，用紫外-可见分光光度计进行紫外-可见吸收光谱扫描，不同四丁基氢氧化铵(tbah)浓度的试剂检测相同浓度铵根后的谱图结果如图2所示，从图中可以看出：随四丁基氢氧化铵(tbah)浓度的增加，反应后435nm处的吸收值逐渐增加，由图3可以更加明显看出：随四丁基氢氧化铵(tbah)加入量的增加，位于435nm处的吸收峰强度呈指数增加。

实施例3

室温下，称量100mg百里酚蓝溶于1l超纯水中得0.1g/l百里酚蓝水溶液，取17个10ml容量瓶，用移液枪加入已用超纯水稀释10倍的40％于水的四丁基氢氧化铵(tbah)水溶液20μl，然后分别量取100μl、200μl、400μl、600μl、800μl、1ml、1.2ml、1.4ml、1.6ml、1.8ml、2ml、2.5ml、3ml、3.5ml、4ml、4.5ml和5ml的0.1g/l百里酚蓝水溶液加入17个容量瓶中，用超纯水定容、摇匀，时间为30min，即得到四丁基氢氧化铵(tbah)摩尔浓度为308nm和百里酚蓝摩尔浓度为2.14μm、4.28μm、8.56μm、12.84μm、17.12μm、21.4μm、25.68μm、29.596μm、38.52μm、42.8μm、53.5μm、64.2μm、74.9μm、85.6μm、96.3μm和107μm的蓝色检测试剂；

将配置好的检测试剂量取3ml置于石英比色皿中，再加入已配制的1m铵根标准水溶液30μl，用紫外-可见分光光度计进行紫外-可见吸收光谱扫描，不同百里酚蓝浓度的试剂检测相同浓度铵根后的谱图结果如图4所示，从图中可以看出：随百里酚蓝浓度的增加，反应后位于435nm处的吸收值逐渐增加，由图5可以更加明显看出：随百里酚蓝加入量的增加，位于435nm处的吸收峰强度呈线性关系增加。

实施例4

室温下，称量100mg百里酚蓝溶于1l超纯水中得0.1g/l百里酚蓝水溶液，取200ml容量瓶，用移液枪加入40％于水的四丁基氢氧化铵(tbah)水溶液400μl和所配制的百里酚蓝水溶液100ml，然后用超纯水混合滴定至200ml，搅拌时间为15min，得到百里酚蓝摩尔浓度为107μm和四丁基氢氧化铵(tbah)摩尔浓度为308nm的检测试剂；

将配置好的检测试剂量取3ml置于石英比色皿中，再加入已配制的不同浓度铵根标准水溶液30μl，加入不同铵根浓度后的紫外-可见分光光度计所测吸收光谱如图6所示，从图中可以看出：随着铵根浓度的提高位于435nm处的吸收峰强度逐渐增大，而由图7的拟合曲线可以更加明显看出：随铵根浓度的提高，位于435nm处的吸收峰强度随铵根浓度的增加而呈指数关系增加，当铵根浓度为3μm-10μm时，位于435nm处的吸收峰强度随铵根浓度的增加而呈很好的线性关系增加(如图8所示)，拟合线性方程可得y＝6.02174×10^-4x+0.00938，根据检测限计算方程式：检测限＝3σ/k，其中σ为所使用紫外-可见分光光度计的标准偏差，本发明所用紫外-可见分光光度计的标准偏差σ＝1.59463×10^-4(n＝15)，k为拟合曲线的斜率，即k＝6.02174×10^-4，经计算本试剂的检测限为51nm。

实施例5

室温下，称量100mg百里酚蓝溶于1l超纯水中得0.1g/l百里酚蓝水溶液，取200ml容量瓶，用移液枪加入40％于水的四丁基氢氧化铵(tbah)水溶液400μl和所配制的百里酚蓝水溶液100ml，然后用超纯水混合滴定至200ml，搅拌时间为25min，得到百里酚蓝摩尔浓度为107μm和四丁基氢氧化铵(tbah)摩尔浓度为308nm的检测试剂；

将配置好的检测试剂量取1ml置于容量为2ml的离心管中，再加入已配制的不同浓度铵根标准水溶液10μl，于标准灯箱中拍摄不同浓度铵根反应后的照片如图9所示，从图中可以看出：所配制的试剂对于铵根的裸眼识别检测限为10μm。

实施例6

室温下，称量100mg百里酚蓝溶于1l超纯水中得0.1g/l百里酚蓝水溶液，取200ml容量瓶，用移液枪加入40％于水的四丁基氢氧化铵(tbah)水溶液400μl和所配制的百里酚蓝水溶液2ml，然后用超纯水混合滴定至200ml，搅拌时间为15min，得到百里酚蓝摩尔浓度为2.14μm和四丁基氢氧化铵(tbah)摩尔浓度为308nm的检测试剂；

用采样纸擦拭微量的(nh4)3po4固体残留物后，在采样纸中心滴加1-2滴检测试剂，可以明显看出：采样纸中心可以快速由深蓝蓝色变为亮黄色，证明待检物中含有非制式爆炸物原料铵盐。

实施例7

室温下，称量100mg百里酚蓝溶于1l超纯水中得0.1g/l百里酚蓝水溶液，取200ml容量瓶，用移液枪加入40％于水的四丁基氢氧化铵(tbah)水溶液80μl和所配制的百里酚蓝水溶液100ml，然后用超纯水混合滴定至200ml，搅拌时间为15min，得到百里酚蓝摩尔浓度为107μm和四丁基氢氧化铵(tbah)摩尔浓度为61.6nm的检测试剂；

用采样纸擦拭微量的nh4hco3固体残留物后，在采样纸中心滴加1-2滴检测试剂，可以明显看出：采样纸中心可以快速由深蓝蓝色变为亮黄色，证明待检物中含有非制式爆炸物原料铵盐。

实施例8

室温下，称量100mg百里酚蓝溶于1l超纯水中得0.1g/l百里酚蓝水溶液，取200ml容量瓶，用移液枪加入40％于水的四丁基氢氧化铵(tbah)水溶液400μl和所配制的百里酚蓝水溶液50ml，然后用超纯水混合滴定至200ml，搅拌时间为15min，得到百里酚蓝摩尔浓度为53.5μm和四丁基氢氧化铵(tbah)摩尔浓度为308nm的检测试剂；

用采样纸擦拭微量的nh4f固体残留物后，在采样纸中心滴加1-2滴检测试剂，可以明显看出：采样纸中心可以快速由深蓝蓝色变为亮黄色，证明待检物中含有非制式爆炸物原料铵盐。

实施例9

室温下，称量100mg百里酚蓝溶于1l超纯水中得0.1g/l百里酚蓝水溶液，取200ml容量瓶，用移液枪加入40％于水的四丁基氢氧化铵(tbah)水溶液200μl和所配制的百里酚蓝水溶液100ml，然后用超纯水混合滴定至200ml，搅拌时间为15min，得到百里酚蓝摩尔浓度为107μm和四丁基氢氧化铵(tbah)摩尔浓度为154nm的检测试剂；

用采样纸擦拭微量的nh4cl固体残留物后，在采样纸中心滴加1-2滴检测试剂，可以明显看出：采样纸中心可以快速由深蓝蓝色变为亮黄色，证明待检物中含有非制式爆炸物原料铵盐。

实施例10

室温下，称量100mg百里酚蓝溶于1l超纯水中得0.1g/l百里酚蓝水溶液，取200ml容量瓶，用移液枪加入40％于水的四丁基氢氧化铵(tbah)水溶液400μl和所配制的百里酚蓝水溶液5ml，然后用超纯水混合滴定至200ml，搅拌时间为15min，得到百里酚蓝摩尔浓度为5.35μm和四丁基氢氧化铵(tbah)摩尔浓度为308nm的检测试剂；

用采样纸擦拭微量的kno3固体残留物后，在采样纸中心滴加1-2滴检测试剂，采样纸没有任何的颜色变化，证明待检物中不含有非制式爆炸物原料铵盐。

实施例11

室温下，称量100mg百里酚蓝溶于1l超纯水中得0.1g/l百里酚蓝水溶液，取200ml容量瓶，用移液枪加入40％于水的四丁基氢氧化铵(tbah)水溶液20μl和所配制的百里酚蓝水溶液100ml，然后用超纯水混合滴定至200ml，搅拌时间为15min，得到百里酚蓝摩尔浓度为107μm和四丁基氢氧化铵(tbah)摩尔浓度为15.4nm的检测试剂；

用采样纸擦拭微量的kclo3固体残留物后，在采样纸中心滴加1-2滴检测试剂，采样纸没有任何的颜色变化，证明待检物中不含有非制式爆炸物原料铵盐。

实施例12

室温下，称量100mg百里酚蓝溶于1l超纯水中得0.1g/l百里酚蓝水溶液，取200ml容量瓶，用移液枪加入40％于水的四丁基氢氧化铵(tbah)水溶液40μl和所配制的百里酚蓝水溶液10ml，然后用超纯水混合滴定至200ml，搅拌时间为15min，得到百里酚蓝摩尔浓度为10.7μm和四丁基氢氧化铵(tbah)摩尔浓度为30.8nm的检测试剂；

用采样纸擦拭微量的nano3固体残留物后，在采样纸中心滴加1-2滴检测试剂，采样纸没有任何的颜色变化，证明待检物中不含有非制式爆炸物原料铵盐。

实施例13

室温下，称量100mg百里酚蓝溶于1l超纯水中得0.1g/l百里酚蓝水溶液，取200ml容量瓶，用移液枪加入40％于水的四丁基氢氧化铵(tbah)水溶液100μl和所配制的百里酚蓝水溶液25ml，然后用超纯水混合滴定至200ml，搅拌时间为15min，得到百里酚蓝摩尔浓度为21.75μm和四丁基氢氧化铵(tbah)摩尔浓度为77nm的检测试剂；

用采样纸擦拭微量的nano2固体残留物后，在采样纸中心滴加1-2滴检测试剂，采样纸没有任何的颜色变化，证明待检物中不含有非制式爆炸物原料铵盐。

虽然上述实施方式描述了本发明，应当理解的是，在不违背本发明的精神的前提下，本试剂用于其它领域中的铵根检测同样适用。本发明中的试剂组分比例可以调动，且这些变动同样属于本发明的范围。