土壤脲酶的测定方法与流程

本发明涉及一种脲酶的测定方法。

背景技术

脲酶广泛存在于土壤中，为含镍寡聚酶，具有绝对专一性，特异性地催化脲素水解释放出氨和二氧化碳。土壤脲酶活性，与土壤的微生物数量、有机物质含量、全氮和速效氮含量呈正相关。根际土壤脲酶活性高于非根际土壤脲酶活性，中性土壤脲酶活性大于碱性土壤，通常用土壤脲酶活性表征土壤的氮素状况。

测定脲酶的方法很多，包括比色法、扩散法、电极法等。其中苯酚-次氯酸钠比色法最为常用，该方法以尿素为基质，根据酶促产物氨与苯酚-次氯酸钠作用(在碱性溶液或在亚硝基铁氰化钠催化剂作用下)生成蓝色的靛酚，颜色深浅与氨的量相关，因此可以测定氨量来表示脲酶的活性。但此方法存在许多不足，首先柠檬酸盐缓冲液的配制较为复杂，且柠檬酸盐缓冲液不够稳定，影响测定效果；其次，使用柠檬酸盐缓冲液时，土样滤液颜色较深，且不够澄清，影响吸光度测定，导致目前苯酚-次氯酸钠比色法测定脲酶活性准确性较低。

技术实现要素：

本发明的目的是为了解决目前比色法测定土壤脲酶活性的测定效果不稳定、准确率较低的问题，提供了一种土壤脲酶的测定方法

土壤脲酶的测定方法按以下步骤进行：

一、取4.95g～5.05g风干土样品加1ml±2μl甲苯，15min后加10ml±2μl尿素溶液和20ml±2μl修正通用缓冲工作液摇匀，再在37℃±1℃恒温箱中培养23h～25h，获得样品测量液；

二、无土对照样、无基质对照样制备：

取4.95g～5.05g水加1ml±2μl甲苯，15min后加10ml±2μl尿素溶液和20ml±2μl修正通用缓冲工作液摇匀，再在37℃±1℃恒温箱中培养23h～25h，即得到无土对照样；

取4.95g～5.05g风干土样品加1ml±2μl甲苯，15min后加10ml±2μl水和20ml±2μl修正通用缓冲工作液摇匀，再在37℃±1℃恒温箱中培养23h～25h，即得到无基质对照样；

三、过滤步骤一样品测量液，取1ml±2μl滤液加蒸馏水至20ml，然后加入4ml±2μl苯酚钠溶液和3ml±2μl次氯酸钠溶液，边加边摇匀，20min～25min后显色，定容，1h内分光光度计波长578nm比色，测定吸光值再与氮溶液浓度标准曲线比较，获得初步nh3-n浓度；过滤步骤二无土对照样和无基质对照样测量液，分别取1ml±2μl滤液加蒸馏水至20ml，然后加入4ml±2μl苯酚钠溶液和3ml±2μl次氯酸钠溶液，边加边摇匀，20min～25min后显色，定容，1h内分光光度计波长578nm比色，测定吸光值再与氮溶液浓度标准曲线比较，获得无土对照样nh3-n浓度和无基质对照样nh3-n浓度；四、计算

以1g土壤中nh3-n的质量(mg)表示脲酶活性(ure)：

ure＝a·v·n/m

其中：a为样品测量液nh3-n浓度(mg/ml)，样品测量液nh3-n浓度＝初步nh3-n浓度-无土对照样nh3-n浓度-无基质对照样nh3-n浓度；v为显色液体积(ml)；n为样品测量液的分取倍数；m为烘干土重(g)；

其中，尿素溶液为24g～26g尿素溶于水中，并用蒸馏水定容至250ml制成；

修正通用缓冲工作液是199～201ml修正通用缓冲储备液用0.1mhcl调节至ph6.0，然后用蒸馏水定容到1l制成；

上述修正通用缓冲储备液是将12.0g～12.2gtris、11.5g～11.7g顺丁烯二酸、13.9g～14.1g柠檬酸一水化合物和6.2g～6.4g硼酸溶于490ml～510ml1mnaoh中，再用蒸馏水定容到1000ml制成。

本发明用修正通用缓冲液工作液(ph6.0)代替柠檬酸盐缓冲液，缓冲液的稳定性大幅提升，测量的准确度显著提高；而且样品测量液的滤液颜色浅，吸光度测量准确性高。

通过使用修正通用缓冲液工作液(ph6.0)代替柠檬酸盐缓冲液，提高了土壤脲酶活性测定的准确性。同时采用本方法与原有的普通方法柠檬酸盐缓冲液测定同一土壤脲酶活性，本发明方法得到的值分别为0.15254、0.15564、0.15469、0.15302、0.15349，标准值为0.11347±0.01678，原有普通方法测定得到值分别为1.81401、1.87080、1.88547、1.91932、1.87945，标准值为1.87381±0.05980，本发明测定土壤脲酶活性平行性好，变异系数小，方法可行性高、精确度高。

附图说明

图1是实施例1绘制的氮溶液浓度标准曲线。

具体实施方式

本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。

具体实施方式一：本实施方式土壤脲酶的测定方法按以下步骤进行：

一、取4.95g～5.05g风干土样品加1ml±2μl甲苯，15min后加10ml±2μl尿素溶液和20ml±2μl修正通用缓冲工作液摇匀，再在37℃±1℃恒温箱中培养23h～25h，获得样品测量液；

二、无土对照样、无基质对照样制备：

取4.95g～5.05g水加1ml±2μl甲苯，15min后加10ml±2μl尿素溶液和20ml±2μl修正通用缓冲工作液摇匀，再在37℃±1℃恒温箱中培养23h～25h，即得到无土对照样；

取4.95g～5.05g风干土样品加1ml±2μl甲苯，15min后加10ml±2μl水和20ml±2μl修正通用缓冲工作液摇匀，再在37℃±1℃恒温箱中培养23h～25h，即得到无基质对照样；

三、过滤步骤一样品测量液，取1ml±2μl滤液加蒸馏水至20ml，然后加入4ml±2μl苯酚钠溶液和3ml±2μl次氯酸钠溶液，边加边摇匀，20min～25min后显色，定容，1h内分光光度计波长578nm比色，测定吸光值再与氮溶液浓度标准曲线比较，获得初步nh3-n浓度；过滤步骤二无土对照样和无基质对照样测量液，分别取1ml±2μl滤液加蒸馏水至20ml，然后加入4ml±2μl苯酚钠溶液和3ml±2μl次氯酸钠溶液，边加边摇匀，20min～25min后显色，定容，1h内分光光度计波长578nm比色，测定吸光值再与氮溶液浓度标准曲线比较，获得无土对照样nh3-n浓度和无基质对照样nh3-n浓度；四、计算

以1g土壤中nh3-n的质量(mg)表示脲酶活性(ure)：

ure＝a·v·n/m

其中：a为样品测量液nh3-n浓度(mg/ml)，样品测量液nh3-n浓度＝初步nh3-n浓度-无土对照样nh3-n浓度-无基质对照样nh3-n浓度；v为显色液体积(ml)；n为样品测量液的分取倍数；m为烘干土重(g)；

其中，尿素溶液为24g～26g尿素溶于水中，并用蒸馏水定容至250ml制成；

修正通用缓冲工作液是199～201ml修正通用缓冲储备液用0.1mhcl调节至ph6.0，然后用蒸馏水定容到1l制成；

上述修正通用缓冲储备液是将12.0g～12.2gtris、11.5g～11.7g顺丁烯二酸、13.9g～14.1g柠檬酸一水化合物和6.2g～6.4g硼酸溶于490ml～510ml1mnaoh中，再用蒸馏水定容到1000ml制成。

修正通用缓冲工作液制成后置于4℃环境中储存；修正通用缓冲储备液制成后置于4℃～5℃条件下储存。

具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一的不同点是：步骤三中氮溶液浓度标准曲线按以下步骤绘制分别取0ml、1ml、3ml、5ml、7ml、9ml、11ml和13ml氮工作液加蒸馏水至20ml，然后加入4ml±2μl苯酚钠溶液和3ml±2μl次氯酸钠溶液，边加边摇匀，20min～25min后显色，定容，1h内分光光度计波长578nm比色，绘制氮溶液浓度标准曲线。其它步骤及参数与实施方式一相同。

具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二的不同点是：步骤三中定容至50ml。其它步骤及参数与实施方式一或二相同。

具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一或二的不同点是：步骤三中苯酚钠溶液按以下步骤配制：称62g～63g苯酚溶于乙醇中，再加1.8ml～2.2ml甲醇和18.3ml～18.7ml丙酮，然后用乙醇稀释至100ml，即得到a液；称26g～28g氢氧化钠用水定容到100ml，即得到b液；取a液、b液各20ml±2μl混合，再用蒸馏水定容至100ml，即得到苯酚钠溶液。其它步骤及参数与实施方式一或二相同。

本实施方式中a液、b液使用前保存在冰箱中，使用时进行混合。

实施例1

土壤脲酶的测定方法按以下步骤进行：

一、取5g风干土样品加1ml甲苯，15min后加10ml尿素溶液和20ml修正通用缓冲工作液摇匀，再在37℃恒温箱中培养24h，获得样品测量液；

二、无土对照样、无基质对照样制备：

取5g水加1ml甲苯，15min后加10ml尿素溶液和20ml修正通用缓冲工作液摇匀，再在37℃℃恒温箱中培养24h，即得到无土对照样；

取5g风干土样品加1ml甲苯，15min后加10ml水和20ml修正通用缓冲工作液摇匀，再在37℃恒温箱中培养24h，即得到无基质对照样；

三、过滤步骤一样品测量液，取1ml滤液加蒸馏水至20ml，然后加入4ml苯酚钠溶液和3ml次氯酸钠溶液，边加边摇匀，25min后显色，定容50ml，1h内分光光度计波长578nm比色，测定吸光值再与氮溶液浓度标准曲线比较，获得初步nh3-n浓度；过滤步骤二无土对照样和无基质对照样测量液，分别取1ml滤液加蒸馏水至20ml，然后加入4ml苯酚钠溶液和3ml次氯酸钠溶液，边加边摇匀，25min后显色，定容50ml，1h内分光光度计波长578nm比色，测定吸光值再与氮溶液浓度标准曲线比较，获得无土对照样nh3-n浓度和无基质对照样nh3-n浓度；四、计算

以1g土壤中nh3-n的质量(mg)表示脲酶活性(ure)：

ure＝a·v·n/m

其中：a为样品测量液nh3-n浓度(mg/ml)，样品测量液nh3-n浓度＝初步nh3-n浓度-无土对照样nh3-n浓度-无基质对照样nh3-n浓度；v为显色液体积(ml)；n为样品测量液的分取倍数；m为烘干土重(g)；

其中，尿素溶液为25g尿素溶于水中，并用蒸馏水定容至250ml制成；

修正通用缓冲工作液是200ml修正通用缓冲储备液用0.1mhcl调节至ph6.0，然后用蒸馏水定容到1l制成；

上述修正通用缓冲储备液是将12.1gtris、11.6g顺丁烯二酸、14.0g柠檬酸一水化合物和6.3g硼酸溶于500ml1mnaoh中，再用蒸馏水定容到1000ml制成。

修正通用缓冲工作液制成后置于4℃环境中储存；修正通用缓冲储备液制成后置于4℃～5℃条件下储存；

步骤三中苯酚钠溶液按以下步骤配制：称62.5g苯酚溶于乙醇中，再加2.0ml甲醇和18.5ml丙酮，然后用乙醇稀释至100ml，即得到a液；称27g氢氧化钠用水定容到100ml，即得到b液；取a液、b液各20ml7混合，再用蒸馏水定容至100ml，即得到苯酚钠溶液；

步骤三中氮溶液浓度标准曲线按以下步骤绘制分别取0ml、1ml、3ml、5ml、7ml、9ml、11ml和13ml氮工作液加蒸馏水至20ml，然后加入4ml苯酚钠溶液和3ml次氯酸钠溶液，边加边摇匀，25min后显色，定容为50ml，1h内分光光度计波长578nm比色，绘制氮溶液浓度标准曲线(如图1所示)。

实施例2

采用苯酚-次氯酸钠比色法测量土壤脲酶活性，使用柠檬酸盐缓冲液(ph值6.7柠檬酸盐缓冲液：取368g柠檬酸溶于590ml～610ml蒸馏水中，另取290g～300g氢氧化钾溶于蒸馏水，再将两种溶液合并，用1mol/l氢氧化钠将ph值调至6.7，并用水定容至2l)制备步骤一样品测量液。

本实施例除用柠檬酸盐缓冲液代替修正通用缓冲工作液外，其他步骤及参数与实施例1相同。

实验：

取10份标准土壤样品，分成2组分别采用实施例1和2的方法进行吸光度测量。表1为相应的实验数据。

表1

本发明方法(实施例1)得到的值分别为0.15254、0.15564、0.15469、0.15302、0.15349，标准值为0.15347±0.01678，现有常规方法(实施例2)测定得到值分别为1.81401、1.87080、1.88547、1.91932、1.87945，标准值为1.87381±0.05980。采用实施例1测定得到的土壤脲酶活性的变异系数为0.82％，显示出较好的准确性；采用实施例2测定得到的土壤脲酶活性变异系数较大，测得数值准确性较差。本发明方法测量土壤脲酶活性平行性好，变异系数小，可行性高、精确度高，更为准确。