电化学发光免疫传感器用于制备严重发热伴血小板减少综合症病毒检测试剂盒的应用的制作方法

本发明涉及一种基于cdzntes量子点的电化学发光免疫传感器的新应用，特别涉及一种基于cdzntes量子点的电化学发光免疫传感器用于制备严重发热伴血小板减少综合症病毒检测试剂盒的应用。

背景技术

严重发热伴血小板减少综合症病毒，(severefeverwiththrombocytopeniasyndromebunyavirus，简称sftsv)，它能够引起发热和血小板减少等症状，早期致死率高达30％左右。因此，对于sftsv的检测具有重要意义。目前，有关sftsv的检测方法非常少；而电化学发光由于背景信号低、灵敏度高、仪器操作简单等优点而成为一种备受青睐的检测手段。

技术实现要素：

发明目的：针对现有技术中缺乏有效的严重发热伴血小板减少综合症病毒(以下简称为sftsv)检测方法的问题，本发明提供一种基于cdzntes量子点的电化学发光免疫传感器用于制备sftsv检测试剂盒的应用，该sftsv检测试剂盒可用于sftsv检测。

技术方案：本发明所述的基于cdzntes量子点的电化学发光免疫传感器用于制备sftsv检测试剂盒的应用；sftsv检测试剂盒包括sftsv的电化学发光免疫传感器，上述应用具体为：以sftsv为抗原，制备cdzntes量子点标记的sftsv的电化学发光免疫传感器。

其中，sftsv的电化学发光免疫传感器是以fe3o4@sio2为磁性载体的三明治型夹心免疫传感器，包括表面修饰有sftsv一抗的fe3o4@sio2、cdzntes量子点标记的sftsv二抗、以及通过抗原-抗体间相互作用与两者分别连接的sftsv抗原；其中，表面修饰有sftsv一抗的fe3o4@sio2的非特异性结合位点被封闭。fe3o4@sio2为sio2包覆的fe3o4。

其中，sftsv抗原为sftsv核蛋白抗原(np)，sftsv一抗、sftsv二抗为单克隆抗体，该单克隆抗体为mab0005、mab0004、mab0003、mab0007中的一种。

该sftsv的电化学发光免疫传感器的制备方法包括如下步骤：

1)制备表面修饰有sftsv一抗的fe3o4@sio2，封闭其非特异性结合位点；

2)制备cdzntes量子点标记的sftsv二抗；

3)将表面修饰有sftsv一抗的fe3o4@sio2与cdzntes量子点标记的sftsv二抗与sftsv抗原连接。

具体的，步骤1)中，先将戊二醛与表面氨基化的fe3o4@sio2反应，得到戊二醛功能化的fe3o4@sio2；然后使sftsv一抗与戊二醛功能化的fe3o4@sio2反应，通过交联作用获得表面修饰有sftsv一抗的fe3o4@sio2；最后用牛血清白蛋白封闭其非特异性结合位点。

其中，表面氨基化的fe3o4@sio2的制备方法为：

0.5～0.8gfecl3和0.2～0.3g柠檬酸三钠溶于20～30ml乙二醇，在机械搅拌下加入1.5～1.8gnaac，剧烈搅拌30min。随后，将混合物密封在高压反应釜中，于200℃下加热10h。将所得黑色产品用水和乙醇的混合液洗涤数次，干燥，得fe3o4。将0.05～0.07gfe3o4超声分散于40ml乙醇和5ml水的混合液中，用稀氨水调ph至9.0，搅拌下加入0.3～0.5ml原硅酸四乙酯(teos)。反应3h后，加入0.15～0.2ml(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷(aptes)，继续搅拌8h。最后，产物洗涤并干燥，得表面氨基化的fe3o4@sio2。

上述步骤2)中，可先将cdzntes量子点表面的羧基活化，然后将sftsv的二抗与表面羧基被活化的cdzntes量子点反应，制得cdzntes量子点标记的sftsv二抗。优选的，可采用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐活化cdzntes量子点表面的羧基。

其中，cdzntes量子点的制备步骤包括：

(1)将0.8～1.5gcdcl2·2.5h2o和1.0～1.5gl-半胱氨酸溶于150ml超纯水中，ph调节至10～11，得cd前驱体溶液；

(2)将0.1～0.2g碲粉加入30ml超纯水中并通n210min，加入0.1～0.2gnahb4，80℃下冷凝回流30～40min，得nahte前驱体；

(3)将20mlnahte前驱体溶液用注射器注入n2氛围下的cd前驱体溶液中，于110℃下加热30min；

(4)将0.1～0.15gzncl2和0.15～0.25gl-半胱氨酸溶于30ml超纯水中，制得zns前驱体溶液,将zns前驱体溶液全部加入到(3)中的混合液中，继续于110℃下冷凝回流6～7h，得到cdzntes量子点。

作为优选的，上述步骤3)中，先将步骤1)制得的非特异性结合位点被封闭的表面修饰有sftsv一抗的fe3o4@sio2与含有sftsv的pbs缓冲液于35～37℃振荡1～2h，洗涤除去未特异性结合的sftsv；然后将获得的产物与步骤2)制得的cdzntes量子点标记的sftsv二抗混合，并于35～37℃孵育1～2h，洗涤，得到sftsv电化学发光免疫传感器。

利用该sftsv的电化学发光免疫传感器检测sftsv浓度的方法为：构建含已知浓度sftsv的电化学发光免疫传感器，在以sftsv的电化学发光免疫传感器修饰的玻碳电极为工作电极的三电极体系中，以k2s2o8为共反应试剂，借助电化学发光分析仪记录电化学发光信号，构建电化学发光强度与sftsv浓度的线性关系，拟合线性方程；构建含待测浓度sftsv的电化学发光免疫传感器，在同样条件下采集电化学发光信号，由线性方程获得sftsv的待测浓度。上述三电极体系中，铂丝电极为对电极，饱和甘汞电极为参比电极。检测条件优选为：光电倍增管的高压设为800v，电位窗口设置为-1.6～0v，扫描速度为100mvs^-1。

有益效果：与现有技术相比，本发明的优点在于：(1)本发明基于cdzntes量子点的电化学发光免疫传感器用于制备sftsv检测试剂盒，为sftsv检测提供了新思路，该sftsv检测试剂盒可简便、快速地检测出sftsv的浓度，且检测限低、灵敏度高等，对sftsv的浓度检测范围为0.01fg/ml～1ng/ml，检测限为0.003fg/ml；(2)本发明制备的sftsv检测试剂盒包括以sftsv为抗原制得的cdzntes量子点标记的电化学发光免疫传感器，一方面，借助磁性fe3o4@sio2为载体能够实现快速的分离，消除非特异性吸附，另一方面，cdzntes量子点纳米材料具有较高的电化学发光效率，可大幅地提高传感器的灵敏度；而且，该sftsv的电化学发光免疫传感器具备优异的稳定性、重现性和特异性，能够较好地对sftsv进行检测评估。

附图说明

图1为本发明中制备三明治型sftsv电化学发光免疫传感器的构建机理图；

图2为实施例1制备的cdzntes量子点的透射电镜图；

图3为实施例1制备的cdzntes量子点的紫外吸收光谱和荧光发射光谱，插图为cdzntes量子点在紫外灯下的荧光照片；

图4为实施例1制备的fe3o4@sio2的透射电镜图；

图5a为实施例1中采用不同浓度sftsv制备的电化学发光免疫传感器的电化学发光响应，反应溶液为含50mmk2s2o8的0.1mpbs(ph7.4)；

图5b为实施例1中制备的不同浓度的sftsv电化学发光免疫传感器电化学发光强度和对应浓度之间的线性关系；

图6为实施例2中sftsv电化学发光免疫传感器存放不同时间后修饰到玻碳电极上的电化学发光强度；

图7为实施例3中将sftsv电化学发光免疫传感器修饰到不同玻碳电极上的电化学发光强度；

图8为实施例4中加入10000倍浓度的不同干扰物后制得的sftsv电化学发光免疫传感器的电化学发光强度。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的技术方案作进一步说明。

本发明的基于cdzntes量子点的电化学发光免疫传感器用于制备sftsv检测试剂盒的应用，sftsv检测试剂盒包括sftsv的电化学发光免疫传感器，上述应用具体为：以sftsv为抗原，制备cdzntes量子点标记的sftsv的电化学发光免疫传感器。

该sftsv的电化学发光免疫传感器，是以fe3o4@sio2为磁性载体的三明治型夹心免疫传感器，如图1，包括表面修饰有sftsv一抗的fe3o4@sio2(其非特异性结合位点被封闭)、cdzntes量子点标记的sftsv二抗，两者分别通过抗原-抗体间相互作用与抗原sftsv连接。其中，fe3o4@sio2为sio2包覆的fe3o4。

sftsv抗原包括sftsv核蛋白抗原(np)、sftsvx蛋白抗原(gc)和sftsvx蛋白抗原(gn)三种，本发明中，sftsv的电化学发光免疫传感器中的sftsv抗原为sftsv核蛋白抗原(np)。sftsv的一抗和二抗均为单克隆抗体，其可为mab0005、mab0004、mab0003、mab0007等，实施例中以单克隆抗体mab0005为例，对本发明的技术方案进行说明。

试剂和仪器：cdcl2·2.5h2o，fecl3·6h2o，te粉，nabh4，乙二醇，柠檬酸三钠和醋酸钠(naac)购买于国药集团化学试剂有限公司；l-半胱氨酸，aptes，teos和戊二醛(ga)购买于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；edc购买于萨恩化学技术有限公司，zncl2购买于西龙化工有限公司，bsa购自于生工生物工程股份有限公司，sftsv核蛋白抗原(np)及其单克隆抗体mab0005由江苏省疾病预防控制中心提供，mpi-m型电化学发光分析仪购自于西安瑞迈分析仪器有限公司。

实施例1

制备sftsv的电化学发光免疫传感器，并使用该免疫传感器对sftsv进行检测，验证本发明的技术方案的可实现性。

步骤如下：

(1)合成cdzntes量子点

(a)0.8gcdcl2·2.5h2o和1.0gl-半胱氨酸溶于150ml超纯水中，用1mnaoh调节ph至10，得cd前驱体溶液；

(b)将0.1g碲粉加入30ml超纯水中，通n210min后，快速加入0.1gnahb4，80℃下回流30min，得nahte前驱体；

(c)将20mlnahte前驱体溶液用注射器注入n2氛围下的cd前驱体溶液中，于110℃下加热30min；

(d)将0.1gzncl2和0.15gl-半胱氨酸溶于30ml超纯水中，制得zns前驱体溶液，将zns前驱体溶液全部加入到(c)中的混合液中，继续于110℃下冷凝回流7h，得到cdzntes量子点，其tem表征图如图2，紫外吸收光谱和荧光发射光谱如图3。

(2)cdzntes-mab0005溶液的制备

将75μl新制的edc水溶液(浓度为4.2mg/ml)加入到步骤(1)制得的cdzntes量子点溶液(500μl，5mg/ml)中活化量子点表面的羧基。然后，加入1mlmab0005溶液(浓度为10μg/ml)，室温下暗处振荡反应2小时。50kd超滤管用于除去未连接的量子点和副产物。最后，于4℃储存，备用。

(3)fe3o4@sio2-mab0005溶液的制备

氨基化的fe3o4@sio2合成：

0.5gfecl3·6h2o和0.2g柠檬酸三钠溶于20ml乙二醇，在机械搅拌下加入1.5gnaac，剧烈搅拌30min。将混合物密封在高压反应釜中，在200℃下加热10h。所得黑色产品用去离子水和乙醇清洗，干燥，得fe3o4。将0.05g上述制备的fe3o4超声分散于40ml乙醇和5ml超纯水的混合液中，用稀氨水调ph至9.0，搅拌下加入0.3mlteos。反应3h后，加入0.15mlaptes，继续搅拌8h。最后的产物洗涤并干燥，得表面氨基化的fe3o4@sio2，其tem表征如图4。

随后，将10mg上述氨基化的fe3o4@sio2溶于7.5ml超纯水中，加入2.5ml戊二醛(2.5wt％)溶液，室温下搅拌6小时。通过磁性分离，用10mmpbs(ph7.4)洗涤以除去过量的戊二醛，即得戊二醛功能化的fe3o4@sio2。将500μlmab0005溶液(10μg/ml)加入到500μl戊二醛功能化的fe3o4@sio2分散液中，震荡反应1小时，用10mmpbs(ph7.4)洗涤以除去多余的mab0005。然后，将fe3o4@sio2-mab0005在含bsa的pbs溶液(150μl，1.0wt％)中温育30min以封闭非特异性结合位点。洗涤，即得bsa封闭的fe3o4@sio2-mab0005，简写为fe3o4@sio2-mab0005/bsa。将fe3o4@sio2-mab0005/bsa重新分散于500μlpbs中，4℃保存，备用。

(4)电化学发光免疫传感器的构建

将50μl步骤(3)制得的fe3o4@sio2-mab0005/bsa溶液分别加入到含不同浓度sftsv核蛋白抗原的50μlpbs溶液中，sftsv核蛋白抗原的浓度分别为0.01fg/ml、0.1fg/ml、1fg/ml、10fg/ml、100fg/ml、1pg/ml、10pg/ml、100pg/ml和1ng/ml，在37℃振荡反应1小时。用10mmpbs(ph7.4)洗涤抗原-抗体复合物以除去物理吸附的sftsv核蛋白抗原。然后，将步骤(2)制得的cdzntes-mab0005与上述抗原-抗体复合物混合，于37℃孵育1h以构建免疫传感器。最后，洗涤得到的免疫传感器以除去未结合的cdzntes-mab0005，再分散在100μlpbs(10mm，ph7.4)溶液中，4℃下储存备用。

(5)不同浓度的sftsv的检测

将10μl步骤(4)构建的sftsv的免疫传感器滴加至玻碳电极表面，室温干燥。在含50mmk2s2o8的pbs溶液中，使用电化学发光分析仪在三电极体系中采集电化学发光信号，结果如图5a～5b，其中，图5a为不同浓度的sftsv电化学发光免疫传感器的ecl响应，图5b为电化学发光强度与sftsv对数浓度之间的线性关系图，a-i浓度分别为:0.01fg/ml，0.1fg/ml，1fg/ml，10fg/ml，100fg/ml，1pg/ml，10pg/ml，100pg/ml，1ng/ml；由图5b可知，电化学发光强度与sftsv浓度的对数值之间存在良好的线性关系，线性回归方程为i＝1876.87lgcsftsv+15528.27，相关系数为0.989；可检测的线性范围为0.01fg/ml～1ng/ml，检测限为0.003fg/ml。

在此基础上，可通过本发明的方法构建未知浓度的三明治型sftsv电化学发光免疫传感器，采集待测sftsv免疫传感器的电化学发光信号，通过上述线性关系分析得出待测sftsv的浓度，从而实现未知sftsv浓度的检测。

实施例2

本实施例评估sftsv电化学发光免疫传感器的稳定性，良好的稳定性是免疫传感器性能的评判指标之一。

步骤如下：

(1)合成cdzntes量子点：

(a)1gcdcl2·2.5h2o和1gl-半胱氨酸溶于150ml超纯水中，用1mnaoh调节ph至10，得cd前驱体溶液；

(b)将0.15g碲粉加入30ml超纯水中，通n210min后，快速加入0.2gnahb4，80℃下回流30min，得nahte前驱体；

(c)将20mlnahte前驱体溶液用注射器注入n2氛围下的cd前驱体溶液中，于110℃下加热30min；

(d)将0.15gzncl2和0.15gl-半胱氨酸溶于30ml超纯水中，制得zns前驱体溶液，将zns前驱体溶液全部加入到(c)中的混合液中，继续于110℃下冷凝回流7h，得到cdzntes量子点。其形貌及电化学发光性能与实施例1中相近。

(2)cdzntes-mab0005溶液的制备

将75μl新制的edc水溶液(浓度为4.2mg/ml)加入到步骤(1)制得的cdzntes量子点溶液(500μl，5mg/ml)中活化量子点表面的羧基。然后，加入1mlmab0005溶液(浓度为10μg/ml)，室温下暗处振荡反应2小时。50kd超滤管用于除去未连接的量子点和副产物。最后，于4℃储存，备用。

(3)fe3o4@sio2-mab0005溶液的制备

氨基化的fe3o4@sio2合成：

0.5gfecl3·6h2o和0.2g柠檬酸三钠溶于20ml乙二醇，在机械搅拌下加入1.5gnaac，剧烈搅拌30min。将混合物密封在高压反应釜中，在200℃下加热10h。所得黑色产品用去离子水和乙醇清洗，干燥，得fe3o4。将0.05g上述制备的fe3o4超声分散于40ml乙醇和5ml超纯水的混合液中，用稀氨水调ph至9.0，搅拌下加入0.3mlteos。反应3h后，加入0.2mlaptes，继续搅拌8h。最后的产物洗涤并干燥，得表面氨基化的fe3o4@sio2，其形貌与实施例1中相近。

将10mg上述氨基化的fe3o4@sio2溶于7.5ml超纯水中，加入2.5ml戊二醛(2.5wt％)溶液，室温下搅拌6小时。通过磁性分离，用10mmpbs(ph7.4)洗涤以除去过量的戊二醛，即得戊二醛功能化的fe3o4@sio2。将500μlmab0005溶液(10μg/ml)加入到500μl戊二醛功能化的fe3o4@sio2分散液中，震荡反应1h，用10mmpbs(ph7.4)洗涤以除去多余的mab0005。然后，将fe3o4@sio2-mab0005在含bsa的pbs溶液(150μl，1.0wt％)中温育30min以封闭非特异性结合位点。洗涤，即得bsa封闭的fe3o4@sio2-mab0005，简写为fe3o4@sio2-mab0005/bsa。将fe3o4@sio2-mab0005/bsa重新分散于500μlpbs中，4℃保存，备用。

(4)电化学发光免疫传感器的构建

将50μl步骤(3)制得的fe3o4@sio2-mab0005/bsa溶液加入到含100fg/mlsftsv核蛋白抗原的50μlpbs溶液中，在37℃振荡反应1小时。用10mmpbs(ph7.4)洗涤抗原-抗体复合物以除去物理吸附的sftsv核蛋白抗原。然后，将步骤(2)制得的cdzntes-mab0005与上述抗原-抗体复合物混合，于37℃孵育1h以构建免疫传感器。最后，洗涤得到的免疫传感器以除去未结合的cdzntes-mab0005，再分散在100μlpbs(10mm，ph7.4)溶液中，4℃下储存备用。

(5)电化学发光免疫传感器的稳定性评估

将步骤(4)中制得的sftsv的电化学发光免疫传感器在pbs(10mm,ph7.4)溶液中存放，每天使用电化学发光分析仪对sftsv的电化学发光免疫传感器测试一次，一周后，可检测到的信号仍旧能够达到最初响应值的89.2％，如图6；说明本发明所构建的sftsv的电化学发光免疫传感器具有优越的稳定性。

实施例3

本实施例对sftsv电化学发光免疫传感器进行重现性评估，结果能够得到重现才能表明得到的数据具有一定的可靠性。

步骤如下：

(1)合成cdzntes量子点：

(a)1.2gcdcl2·2.5h2o和1.2gl-半胱氨酸溶于150ml超纯水中，用1mnaoh调节ph至10，得cd前驱体溶液；

(b)将0.18g碲粉加入30ml超纯水中，通n210min后，快速加入0.2gnahb4，80℃下回流30min，得nahte前驱体；

(c)将20mlnahte前驱体溶液用注射器注入n2氛围下的cd前驱体溶液中，于110℃下加热30min；

(d)将0.18gzncl2和0.22gl-半胱氨酸溶于30ml超纯水中，制得zns前驱体溶液，将zns前驱体溶液全部加入到(c)中的混合液中，继续于110℃下冷凝回流7h，得到cdzntes量子点。其形貌及电化学发光性能与实施例1中相近。

(2)cdzntes-mab0005溶液的制备

将75μl新制的edc水溶液(浓度为4.2mg/ml)加入到步骤(1)制得的cdzntes量子点溶液(500μl，5mg/ml)中活化量子点表面的羧基。然后，加入1mlmab0005溶液(浓度为10μg/ml)，室温下暗处振荡反应2小时。50kd超滤管用于除去未连接的量子点和副产物。最后，于4℃储存，备用。

(3)fe3o4@sio2-mab0005溶液的制备

氨基化的fe3o4@sio2合成：

0.5gfecl3·6h2o和0.2g柠檬酸三钠溶于20ml乙二醇，在机械搅拌下加入1.5gnaac，剧烈搅拌30min。将混合物密封在高压反应釜中，在200℃下加热10h。所得黑色产品用去离子水和乙醇清洗，干燥，得fe3o4。将0.05g上述制备的fe3o4超声分散于40ml乙醇和5ml超纯水的混合液中，用稀氨水调ph至9.0，搅拌下加入0.3mlteos。反应3h后，加入0.2mlaptes，继续搅拌8h。最后的产物洗涤并干燥，得表面氨基化的fe3o4@sio2，其形貌与实施例1中相近。

将10mg上述氨基化的fe3o4@sio2溶于7.5ml超纯水中，加入2.5ml戊二醛(2.5wt％)溶液，室温下搅拌6小时。通过磁性分离，用10mmpbs(ph7.4)洗涤以除去过量的戊二醛，即得戊二醛功能化的fe3o4@sio2。将500μlmab0005溶液(10μg/ml)加入到500μl戊二醛功能化的fe3o4@sio2分散液中，震荡反应1h，用10mmpbs(ph7.4)洗涤以除去多余的mab0005。然后，将fe3o4@sio2-mab0005在含bsa的pbs溶液(150μl，1.0wt％)中温育30min以封闭非特异性结合位点。洗涤，即得bsa封闭的fe3o4@sio2-mab0005，简写为fe3o4@sio2-mab0005/bsa。将fe3o4@sio2-mab0005/bsa重新分散于500μlpbs中，4℃保存，备用。

(4)电化学发光免疫传感器的构建

将50μl步骤(3)制得的fe3o4@sio2-mab0005/bsa溶液加入到含100fg/mlsftsv核蛋白抗原的50μlpbs溶液中，在37℃振荡反应1小时。用10mmpbs(ph7.4)洗涤抗原-抗体复合物以除去物理吸附的sftsv核蛋白抗原。然后，将步骤(2)制得的cdzntes-mab0005与上述抗原-抗体复合物混合，于37℃孵育1h以构建免疫传感器。最后，洗涤得到的免疫传感器以除去未结合的cdzntes-mab0005，再分散在100μlpbs(10mm，ph7.4)溶液中，4℃下储存备用。

(5)电化学发光免疫传感器的重现性评估

将步骤(4)中制得的sftsv电化学发光免疫传感器修饰到不同的玻碳电极上进行电化学发光分析，如图7，经计算，各组数据中电化学发光强度的相对标准偏差为2.36％，表明所构建的sftsv电化学发光免疫传感器重现性良好。

实施例4

本实施例对sftsv电化学发光免疫传感器进行特异性评估，只有当免疫传感器对特定抗原有响应而其他干扰物无响应时，所构建的免疫传感器才具有应用价值。

步骤如下：

(1)合成cdzntes量子点：

(a)1.5gcdcl2·2.5h2o和1.5gl-半胱氨酸溶于150ml超纯水中，用1mnaoh调节ph至10，得cd前驱体溶液；

(b)将0.2g碲粉加入30ml超纯水中，通n210min后，快速加入0.2gnahb4，80℃下回流30min，得nahte前驱体；

(c)将20mlnahte前驱体溶液用注射器注入n2氛围下的cd前驱体溶液中，于110℃下加热30min；

(d)将0.15gzncl2和0.25gl-半胱氨酸溶于30ml超纯水中，制得zns前驱体溶液，将zns前驱体溶液全部加入到(c)中的混合液中，继续于110℃下冷凝回流7h，得到cdzntes量子点。其形貌及电化学发光性能与实施例1中相近。

(2)cdzntes-mab0005溶液的制备

将75μl新制的edc水溶液(浓度为4.2mg/ml)加入到步骤(1)制得的cdzntes量子点溶液(500μl，5mg/ml)中活化量子点表面的羧基。然后，加入1mlmab0005溶液(浓度为10μg/ml)，室温下暗处振荡反应2小时。50kd超滤管用于除去未连接的量子点和副产物。最后，于4℃储存，备用。

(3)fe3o4@sio2-mab0005溶液的制备

氨基化的fe3o4@sio2合成：

0.5gfecl3·6h2o和0.2g柠檬酸三钠溶于20ml乙二醇，在机械搅拌下加入1.5gnaac，剧烈搅拌30min。将混合物密封在高压反应釜中，在200℃下加热10h。所得黑色产品用去离子水和乙醇清洗，干燥，得fe3o4。将0.05g上述制备的fe3o4超声分散于40ml乙醇和5ml超纯水的混合液中，用稀氨水调ph至9.0，搅拌下加入0.3mlteos。反应3h后，加入0.2mlaptes，继续搅拌8h。最后的产物洗涤并干燥，得表面氨基化的fe3o4@sio2，其形貌与实施例1中相近。

将10mg上述氨基化的fe3o4@sio2溶于7.5ml超纯水中，加入2.5ml戊二醛(2.5wt％)溶液，室温下搅拌6小时。通过磁性分离，用10mmpbs(ph7.4)洗涤以除去过量的戊二醛，即得戊二醛功能化的fe3o4@sio2。将500μlmab0005溶液(10μg/ml)加入到500μl戊二醛功能化的fe3o4@sio2分散液中，震荡反应1h，用10mmpbs(ph7.4)洗涤以除去多余的mab0005。然后，将fe3o4@sio2-mab0005在含bsa的pbs溶液(150μl，1.0wt％)中温育30min以封闭非特异性结合位点。洗涤，即得bsa封闭的fe3o4@sio2-mab0005，简写为fe3o4@sio2-mab0005/bsa。将fe3o4@sio2-mab0005/bsa重新分散于500μlpbs中，4℃保存，备用。

(4)电化学发光免疫传感器的构建

将50μl步骤(3)制得的fe3o4@sio2-mab0005/bsa溶液加入到含100fg/mlsftsv核蛋白抗原的50μlpbs溶液中，在37℃振荡反应1小时。用10mmpbs(ph7.4)洗涤抗原-抗体复合物以除去物理吸附的sftsv核蛋白抗原。然后，将步骤(2)制得的cdzntes-mab0005与上述抗原-抗体复合物混合，于37℃孵育1h以构建免疫传感器。最后，洗涤得到的免疫传感器以除去未结合的cdzntes-mab0005，再分散在100μlpbs(10mm，ph7.4)溶液中，4℃下储存备用。

(5)电化学发光免疫传感器的特异性评估

在上述步骤(4)中，将100fg/mlsftsv核蛋白抗原和1ng/ml葡萄糖(glu)、afp、cea和bsa一起加入到fe3o4@sio2-mab0005/bsa溶液中进行孵育。使用电化学发光分析仪检测各传感器的电化学发光强度，如图8，可以看出，10000倍浓度的干扰物对sftsv免疫传感器的干扰较小，相对标准偏差仅为3.09％，可忽略不计，表明本发明制备的sftsv电化学发光免疫传感器具有优越的特异性。