一种电化学免疫传感器及其制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种电化学免疫传感器，其电极表面的中心有抗苏氨酸磷酸裂合酶的抗体，所述抗体优选单克隆抗体，所述传感器优选含有双层纳米金膜，其电极优选玻碳电极，是以壳聚糖为桥联剂固定第一层纳米金于玻碳电极并吸附固定抗苏氨酸磷酸裂合酶的抗体，以滴电极方式将硫堇-壳聚糖/纳米金-辣根过氧化物酶(HRP)复合物固定于电极，并吸附抗苏氨酸磷酸裂合酶的抗体，构建双层纳米金修饰的苏氨酸磷酸裂合酶电化学免疫传感器。该传感器可用于检测食品中沙门氏菌和/或志贺氏菌，其灵敏度高，特异性强，能够对沙门氏菌和/或志贺氏菌实现快速定量检测。
【专利说明】一种电化学免疫传感器及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物免疫检测【技术领域】，特别是涉及一种电化学免疫传感器及其制备 方法和应用；优选地，所述电化学免疫传感器为苏氨酸磷酸裂合酶双层纳米金膜电化学免 疫传感器。
【背景技术】
[0002] 随着单克隆抗体杂交瘤技术日益广泛的应用，需要对获得的单克隆抗体（McAb) 进行系统地分析鉴定，以确定其在各种免疫学试验中的价值。除了对McAb的免疫球蛋白链 理化性质进行分析外，测定McAb结合抗原的特异性、解离平衡常数KD、结合亲和力K m及解 离速率常数Kdis对选择合适的McAb用于某一特定目的十分重要。生物分子相互作用仪采 用生物薄膜干涉（Bio-Layer Interferometry，BLI)技术，无需标记，具有高灵敏度、高通量 等特点，可以作为检测抗原抗体之间亲和力的工具。自2004年问世以来，在抗原与抗体互 作、小分子与蛋白互作、蛋白分子与蛋白分子互作及药物筛选等方面发展迅速，受到越来越 多的关注。
[0003] 沙门氏菌（Salmonella)是一种可以引起沙门氏菌病的革兰氏阴性菌，是最常见 的人畜共患型食源性致病菌之一。据统计，在世界各国的种类细菌性食物中毒中，沙门氏菌 引起的食物中毒常列榜首。志贺氏菌（Shigella)也是一类具有高度传染性的肠道致病菌。 根据WHO统计有1. 647亿人感染痢疾，1. 1万人死亡，其中多数为5岁以下的儿童。在成年 患者中，10?lOOcfu志贺氏菌就可通过感染肠道致病，引发炎症反应。目前，食品中沙门 氏菌的检测方法仍采用传统的国标法GB4789. 4-2010,食品中志贺氏菌的检测方法采用传 统的国标法GB4789. 5-2012,上述方法是目前世界各国普遍接受的标准方法，鉴定结果准确 可靠。但是由于菌种有上千种血清型，生化特性各异，使其检验程序十分复杂繁琐，由于检 测时需要反复进行细菌培养，因此至少需要4?7d才可得到准确的检测结果。近年来，国 内外对于沙门氏菌、志贺氏菌的检测有了一些新的进展，主要为基于光学表面等离子共振 (Surface Plasmon Resonance，SPR)技术、生物薄膜干涉（BioLayer Interferometry，BLI) 技术、PCR技术、荧光标记技术和酶联免疫技术（ELISA)等的快速检测方法。但PCR、SPR、 BLI仪器设备要求精度高、价格昂贵，不能实现在线检测，且对试验操作人员要求严格；而 荧光标记技术及ELISA只能进行定性或半定量，再加上数据处理和加样方式的限制，要实 现即时、准确定量和在线检测几乎是不可能的。电化学分析具有不受样品的浊度、颜色的影 响，所需设备仪器相对简单的特点以及酶促反应的高效性、免疫分析无需对样品进行纯化、 富集等预处理的特点，可以较好成为沙门氏菌及志贺氏菌的检测平台。
[0004] 苏氨酸憐酸裂合酶（phosphothreonine lyase)是以 SpvC(Salmonella plasmid virulence C)为代表的（包括Outer shigella protein F，OspF) -类新的酶效应蛋白家 族，由沙门氏菌及志贺氏菌通过III型分泌系统特异性分泌，因此可以作为检测两种菌的标 志物。当它注入到宿主细胞后，不可逆灭活宿主丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPKs)，破坏宿主的先天免疫防线，导致的急性炎症。研究发现在导致细 菌性痢疾的菌种都能通过III型分泌系统分泌SpvC。本发明拟以苏氨酸磷酸裂合酶为抗原制 备抗-Spvc单克隆抗体，利用抗原抗体之间特异性结合作用检测苏氨酸磷酸裂合酶，从而 间接达到检测沙门氏菌及志贺氏菌的目的；本发明拟通过BSI筛选出与抗原蛋白亲和力更 强的抗-SpvC单克隆抗体株以用于免疫传感器的制备。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是为解决现有技术中所存在的缺陷，发明的一种灵敏度高、特异性 强、快速定量测定沙门氏菌及志贺氏菌的电化学免疫传感器的制备方法。
[0006] 为实现上述目的，一方面，本发明提供一种电化学免疫传感器，所述传感器的电极 表面的中心有抗苏氨酸磷酸裂合酶的抗体。
[0007] 所述抗体为多克隆抗体。
[0008] 所述抗体为单克隆抗体。
[0009] 所述传感器含有双层纳米金膜。
[0010] 所述电极为玻碳电极。
[0011] 所述传感器以壳聚糖为桥联剂固定第一层纳米金于玻碳电极并吸附固定抗苏氨 酸磷酸裂合酶的抗体。
[0012] 所述传感器以滴电极方式将硫堇-壳聚糖/纳米金-辣根过氧化物酶（HRP)复合 物固定于电极，并吸附抗苏氨酸磷酸裂合酶的抗体，构建双层纳米金修饰的苏氨酸磷酸裂 合酶电化学免疫传感器。
[0013] 一方面，本发明还提供所述的电化学免疫传感器的制备方法，包括如下步骤：
[0014] 1)抗苏氨酸磷酸裂合酶的抗体的制备；
[0015] 2)玻碳电极的预处理；
[0016] 3)纳米金溶胶的制备；
[0017] 4)硫堇/壳聚糖（Thi/Chit)共聚物的制备；
[0018] 5)纳米金吸附辣根过氧化物酶的制备；
[0019] 6)苏氨酸磷酸裂合酶双层纳米金膜电化学免疫传感器的制备。
[0020] 所述抗体为多克隆抗体或单克隆抗体。
[0021] 一方面，本发明还提供所述的电化学免疫传感器检测食品中沙门氏菌和/或志贺 氏菌的检测方法。
[0022] 与现有技术相比，本发明的有益效果是：
[0023] 本发明以壳聚糖为桥联剂固定第一层纳米金于玻碳电极并吸附固定抗苏氨酸磷 酸裂合酶的抗体；以滴电极方式将硫堇-壳聚糖/纳米金-辣根过氧化物酶（HRP)复合物 固定于上述电极，并吸附抗苏氨酸磷酸裂合酶的抗体（所述抗体优选单克隆抗体），构建了 双层纳米金修饰的苏氨酸磷酸裂合酶电化学免疫传感器，于此形成的良好的信号放大系统 使其灵敏度高，特异性强，能够对沙门氏菌和/或志贺氏菌实现快速定量检测。
【专利附图】
【附图说明】
[0024] 图1为本发明的纳米金溶胶电镜照片，左上角标尺为50nm，右上角标尺为20nm，左 下角标尺为l〇nm，右下角标尺为5nm。
[0025] 图2为本发明的苏氨酸磷酸裂合酶双层纳米金膜电化学免疫传感器的制备示意 图。
【具体实施方式】
[0026] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0027] 实施例1传感器的制备
[0028] 1、抗苏氨酸磷酸裂合酶单克隆抗体株的筛选
[0029] 首先，采用常规单克隆抗体制备方法，将来源于沙门氏菌的SpvC蛋白抗原注射 Balb/C小鼠，得到单克隆抗体株，再腹腔注射Balb/C小鼠，纯化腹水即得抗苏氨酸磷酸裂 合酶单克隆抗体。
[0030] 然后，进行抗苏氨酸磷酸裂合酶单克隆抗体株的筛选：采用美国ForteBio公司 生产的生物分子相互作用仪Octet Red96进行本实验：取五只Protein A传感器A3、B3、 C3、D3、E3,五个浓度梯度苏氨酸磷酸裂合酶蛋白抗原与之一一对应，浓度分别是：4μΜ， 1. 33 μ Μ，0· 44 μ Μ，0· 1481 μ Μ，0 μ Μ。所用五株 SpvC 单克隆抗体分别为：Α2-Ε2 (1. 129 μ Μ); Α3-Ε3(0·91μΜ) ;Α4-Ε4(0·91μΜ) ;Α5-Ε5(1·755μΜ) ;Α6-Ε6(1μΜ)结果如下表。
[0031] 表1不同抗体株的解离平衡常数、结合常数和解离常数
[0032]
【权利要求】
1. 一种电化学免疫传感器，其特征在于，所述传感器的电极表面的中心有抗苏氨酸磷 酸裂合酶的抗体。
2. 根据权利要求1所述的电化学免疫传感器，其特征在于，所述抗体为多克隆抗体。
3. 根据权利要求1所述的电化学免疫传感器，其特征在于，所述抗体为单克隆抗体。
4. 根据权利要求1-3任一项所述的电化学免疫传感器，其特征在于，所述传感器含有 双层纳米金膜。
5. 根据前述任一项的电化学免疫传感器，其特征在于，其电极为玻碳电极。
6. 根据前述任一项的电化学免疫传感器，其特征在于，以壳聚糖为桥联剂固定第一层 纳米金于玻碳电极并吸附固定抗苏氨酸磷酸裂合酶的抗体。
7. 根据权利要求3的电化学免疫传感器，其特征在于，以滴电极方式将硫堇-壳聚糖/ 纳米金-辣根过氧化物酶（HRP)复合物固定于电极，并吸附抗苏氨酸磷酸裂合酶的抗体，构 建双层纳米金修饰的苏氨酸磷酸裂合酶电化学免疫传感器。
8. 前述任一项权利要求所述的电化学免疫传感器的制备方法，包括如下步骤： 1) 抗苏氨酸磷酸裂合酶的抗体的制备； 2) 玻碳电极的预处理； 3) 纳米金溶|父的制备； 4) 硫堇/壳聚糖（Thi/Chit)共聚物的制备； 5) 纳米金吸附辣根过氧化物酶的制备； 6) 苏氨酸磷酸裂合酶双层纳米金膜电化学免疫传感器的制备。
9. 根据权利要求8的制备方法，其中，所述抗体为多克隆抗体或单克隆抗体。
10. 前述任一项权利要求所述的电化学免疫传感器检测食品中沙门氏菌和/或志贺氏 菌的检测方法，其特征在于，将所述传感器用于检测食品。
【文档编号】G01N27/26GK104089997SQ201410233971
【公开日】2014年10月8日 申请日期:2014年5月29日 优先权日:2014年5月29日
【发明者】庞广昌, 鲁丁强, 耿利华 申请人:北京盈盛恒泰科技有限责任公司