一种丹参的检测方法与流程

本发明涉及中药质量检测领域，具体而言，涉及一种丹参的检测方法。
背景技术：
丹参，为唇形科植物丹参(salviamiltiorrhizabge.)的干燥根和根茎，在我国大部分地区都有所分布。其具有活血祛瘀、通经止痛、清心除烦、凉血消痈的功效，在临床上多用于心血管疾病的治疗，例如复方丹参片、复方丹参滴丸、丹七片、冠心丹参片等，都是临床常用药剂。对于丹参的质量标准检测，在药典等标准方法中，也都提供了多种相应的方法。然而，现有的标准检测方法中，虽然能够满足标准要求，但偏差较大，检测结果准确度和精度仍有待提高。有鉴于此，特提出本发明。技术实现要素：本发明的第一目的在于提供一种丹参的检测方法，具有良好的耐受性、重现性和专属性，检测结果准确。为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：一种丹参的检测方法，包括：(a)取丹参对照药材制得对照药材溶液；取丹参酮iia和丹酚酸b分别得到相应的对照品溶液；以乙酸乙酯-丁酮-冰醋酸为展开剂，采用薄层层析法对丹参供试品溶液进行检测；(b)采用高效液相色谱法，对丹参中的丹参酮类物质含量进行检测；其中，所述高效液相色谱法中，采用如下条件进行梯度洗脱：其中，流动相a为乙腈；流动相b为ph3.2～3.6的缓冲溶液与乙腈的混合液，缓冲溶液与乙腈的比例为93～95:5～7；(c)采用高效液相色谱的方法，对丹参中的丹酚酸b进行含量检测，采用如下条件进行梯度洗脱：其中，流动相a为乙腈，流动相b为ph3.0～4.0的缓冲溶液。与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明检测方法中，通过对色谱条件的优化，使得各杂质峰分离效果更好，检测结果更准确；同时，本发明检测方法耐受性、重现性和专属性更好。附图说明为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，以下将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。图1为本发明实施例1薄层层析对照检测结果图；图2为本发明实施例2线性标准曲线；图3为本发明实施例3线性标准曲线；图4为本发明实施例4中精密度相似度评价系统匹配图；图5为本发明实施例4中重复性相似度评价系统匹配图；图6为本发明实施例4中稳定性相似度评价系统匹配图；图7为本发明实施例4中15批丹参药材相似度评价系统匹配图；图8为本发明实施例4中丹参药材对照指纹图谱。具体实施方式下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。本发明所提供的丹参检测方法，是在药典等标准检测方法的基础上所进行的优化，通过对于薄层层析分离中所用展开剂，高效液相色谱中所用洗脱剂以及洗脱方法的调整和优化，改善了杂质分离效果，提高了检测结果的准确度。本发明检测方法中，主要是通过薄层层析以及高效液相色谱的方法，对丹参中相关物质进行检测。具体的：(1)薄层层析检测薄层层析能够在薄层板上同时分析多个样品，其色谱彩色图像特征性强，易于平行观察、辨识和比较，是中药鉴别常用方法之一。现有标准方法中，主要是采用以丹参乙醇提取物离心上清液为供试品溶液，然后以三氯甲烷-甲苯-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(6：4：8：1：4)为展开剂，展至约4cm，取出，晾干，再以石油醚(60～90℃)-乙酸乙酯(4：1)为展开剂，展开，展至约8cm，取出，晾干，分别在日光及紫外光灯(365nm)下检视的方法进行检测。此方法操作较为繁琐，需要依次在不同展开剂中进行多次展开，且需要进行长时间的监测。本发明中，则是将待检测原料丹参进行粉碎后，过三号筛得到丹参粉末；然后，将丹参粉末加入乙醚中超声处理6～10min，滤过，除去滤渣，所得滤液蒸干后，以乙醇进行溶解，作为丹参供试品溶液；同时，将丹参对照药材制按照丹参供试品溶液相同的方法制得丹参对照药材溶液；丹参酮iia和丹酚酸b分别加乙醇制成相应的对照品溶液。然后，将丹参供试品溶液，丹参对照药材溶液，丹参酮iia对照溶液，以及丹酚酸b对照溶液分别在相同环境条件下，以体积比为8:1:2的乙酸乙酯，丁酮，以及冰醋酸的混合溶液进行展开；展开约8cm，取出，晾干，分别在日光以及紫外灯(365nm)下进行对比检视。由如上所介绍的本发明薄层层析方法可知，本发明检测方法无需在不同溶液中进行多次展开，而且所用溶剂也不含苯、甲苯等对于人体具有较大伤害的有机溶剂，安全性好。(2)高效液相色谱法对丹参样品中丹参酮类物质含量的检测对照品溶液制备方法参考如下：丹参酮iia对照品适量，精密称定，置量瓶中，加甲醇制成每1ml含20μg的溶液，即得；供试品溶液制备方法参考如下：待检测丹参粉末(过三号筛)约0.3g，置于塞锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，称定重量，超声处理(功率140w，频率42khz)30分钟，放冷，再称定重量，以甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；柱温20℃；检测波长为270nm；理论板数按丹参酮iia峰计算应不低于60000；以乙腈为流动相a；以体积比为(93～95):(5～7)的ph3.2～3.6的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液与乙腈的混合液为流动相b，按照如下条件进行梯度洗脱：0～5min，流动相a10→20％，流动相b90→80％(体积比，二者之和为100％，下同)；5～22min，流动相a20→60％，流动相b80→40％；22～22.5min，流动相a60→10％，流动相b40→90％；22.5～25min，流动相a10％，流动相b90％。相较于药典等现有技术中所公开的洗脱方法而言，本发明检测方法中，通过对于洗脱剂和洗脱方法的调整，能够进一步改善杂质分离效果，提高检测的精度与准确性。(3)高效液相色谱法对丹参样品中丹酚酸b含量的检测对照品溶液制备方法如下：丹酚酸b对照品适量，精密称定，置量瓶中，加甲醇-水(8:2)混合溶液制成每1ml含0.10mg的溶液，即得。供试品溶液的制备方法参考如下：待检测丹参粉末(过三号筛)置于塞锥形瓶中，取待测丹参样品粉末(过三号筛)约0.15g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇-水(8:2)混合溶液50ml，密塞，称定重量，超声处理(功率140w，频率42khz)30分钟，放冷，再称定重量，以甲醇-水(8:2)混合溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液5ml，移至10ml量瓶中，加甲醇-水(8:2)混合溶液稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；柱温为20℃；流速为每分钟1.2ml，检测波长为286nm；理论板数按丹酚酸b峰计算应不低于6000；以乙腈为流动相a，ph3.0～4.0的磷酸氢二钠-柠檬酸钠缓冲溶液为流动相b，按照如下条件进行洗脱：0～15min，流动相a10→15％，流动相b90→85％(体积比，二者之和为100％，下同)；15～30min，流动相a15→35％，流动相b85→65％；30～40min，流动相a35→10％，流动相b65→90％；40～45min，流动相a10％，流动相b90％。不同于药典等现有技术中所公开的等度洗脱方法，本发明中，采用梯度洗脱的方式，进行丹酚酸b的检测。同样的，通过对于洗脱剂和洗脱方法的调整，能够进一步改善杂质分离效果，提高检测的精度与准确性。(4)进一步的，本发明检测方法中，还可以进一步包括对于杂质、水份、总灰分、酸性不溶灰分、金属及有害元素，以及浸出物等中的至少一项指标进行检测的步骤，从而实现对于丹参质量的整体性检测。实施例1丹参样品薄层层析取待检测原料丹参(过三号筛)1g，加乙醚约10ml，超声处理8min，滤过，除去滤渣，所得滤液蒸干后，以3ml乙醇进行溶解，作为丹参供试品溶液；取丹参对照药材1g，按照相同方法，制得丹参对照药材溶液；取丹参酮iia对照品，加乙醇制成含量为0.5mg/ml的丹参酮iia对照溶液；取丹酚酸b对照品，加乙醇制成含量为1.5mg/ml丹酚酸对照品溶液。然后，按照薄层色谱法，吸取上述四种溶液各5μl，分别点于同一硅胶g薄层板上，使成条状，以乙酸乙酯，丁酮，以及冰醋酸(8:1:2)为展开剂，展开，展至约8cm，取出，晾干，分别在日光及紫外光灯(365nm)下检视；其中，展开剂用量：各10ml；展开方式：双槽展缸(10×20cm)；展距：8㎝；显色：紫外光灯(365nm)下检视；温度：25℃；湿度：55％供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点或荧光斑点，结果如图1所示。实施例2丹参样品中丹参酮类物质含量检测①对照品溶液的制备：丹参酮iia对照品适量，精密称定，置量瓶中，加甲醇制成每1ml含20μg的溶液，即得。②供试品溶液的制备：取待检测丹参样品粉末(过三号筛)约0.3g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，称定重量，超声处理(功率140w，频率42khz)30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。③色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相a；以体积比为95:5的ph3.2的柠檬酸钠-柠檬酸缓冲溶液与乙腈的混合液为流动相b，按照如下条件进行梯度洗脱：时间(min)流动相a(v/v％)流动相b(v/v％)0～510→2090→805～2220→6080→4022～22.560→1040→9022.5～251090柱温20℃；检测波长为270nm。理论板数按丹参酮iia峰计算应不低于60000。测定方法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10ul。注入液相色谱仪，测定。以丹参酮ⅱa对照品为参照，以其相应的峰为s峰，计算隐丹参酮、丹参酮ⅰ的相应保留时间，其相对保留时间应在规定值的±5％范围之内。相应保留时间及校正因子见如下表所示：待测成分(峰)相对保留(s)时间校正因子隐丹参酮0.751.18丹参酮ⅰ0.791.31丹参酮ⅱa1.001.00④线性试验取丹参酮iia对照品溶液(23.02μg/ml)。分别精密量取2、4、8、12、16、20μl，注入色谱仪，按正文色谱条件试验，结果如下表所示：编号123456进样量(μg)0.046040.092080.184160.276240.368320.4604峰面积(a)318.9614642.09881288.84951932.56152576.99493223.0073以峰面积为纵坐标(y)，进样量为横坐标(x)绘制标准曲线，解脱如图1所示。回归方程为：y＝7006.6x-2.9372，相关系数r2＝1，表明丹参酮iia在0.04604～0.4604ug范围内线性关系良好；⑤仪器精密度试验取①项下制备的对照品溶液，在上述色谱条件下，重复进样6次，测定丹参酮iia峰面积，计算rsd％(丹参酮iia)值为0.24％，表明仪器精密度良好，测定结果见下表所示：编号123456平均值rsd％面积(a)1611.91321611.94291617.23401618.14311618.90271621.76451616.6500670.24％⑥重复性试验精密称取同一批丹参样品6份，按上述方法测定样品中丹参酮类的含量，平均含量为0.30％，rsd值1.74％，表明此丹参酮类的测定方法具有良好的重复性；结果如下表所示：⑦稳定性试验按②项下方法制备供试品溶液一份，室温放置，按拟定色谱条件下于0，2，4，6，8，10h分别进样，测定峰面积。计算rsd％为0.19％，表明隐丹参酮、丹参酮i、丹参酮iia在10h内相对稳定。稳定性试验结果如下表所示：编号0h2h4h6h8h10h平均值rsd(％)总峰面积(a)1342.52411342.86541345.21451347.12011341.02131340.26891343.169150.19％⑧回收试验采用加样回收法。取已知含量的样品(含量(丹参酮iia)：1.8mg/g)6份，每份精密称取0.15g，分别加入丹参酮iia对照品溶液(50μg/ml)5ml，按照②项下制备方法制备。在上述色谱条件下测定，测得其平均回收率为98.98％，rsd％值为0.95％，结果如下表所示：⑨样品含量测定按如上所述的方法对十批样品进行含量测定，结果如下表所示：由如上表数据可知，本发明中所检测的丹参中，含丹参酮iia(c19h18o3)、隐丹参酮(c19h20o3)和丹参酮i(c18h12o3)总量的平均值为0.43％。实施例3丹参样品中丹酚酸b含量检测①对照品溶液的制备：丹酚酸b对照品适量，精密称定，置量瓶中，加甲醇-水(8:2)混合溶液制成每1ml含0.10mg的溶液，即得。②供试品溶液的制备取待检测丹参粉末(过三号筛)约0.15g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇-水(8:2)混合溶液50ml，密塞，称定重量，超声处理(功率140w，频率42khz)30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇-水(8:2)混合溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液5ml，移至10ml量瓶中，加甲醇-水(8:2)混合溶液稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。③色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相a，ph3.2的磷酸氢二钠-柠檬酸钠缓冲溶液为流动相b；按照如下条件，进行线性梯度洗脱：柱温为20℃；流速为每分钟1.2ml，检测波长为286nm。理论板数按丹酚酸b峰计算应不低于6000。测定方法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10ul；注入液相色谱仪，测定。④线性试验取丹酚酸b对照品溶液(0.105881mg/ml)。分别精密量取2、4、8、12、16μl，注入色谱仪，按正文色谱条件试验，结果如下表所示：编号12345进样量(μg)0.2117620.4235240.8470481.2705721.694096峰面积(a)334.7132673.68621342.66682012.10852679.7456以峰面积为纵坐标(y)，进样量为横坐标(x)绘制标准曲线，标准曲线如图2所示；回归方程为：y＝1581.3x+2.2111，相关系数r2＝1，表明丹酚酸b在0.211762～2.11762ug范围内线性关系良好。⑤仪器精密度试验取①项下制备的对照品溶液，在上述色谱条件下，重复进样6次，测定丹酚酸b峰面积，计算rsd％(丹酚酸b)值为0.70％，表明仪器精密度良好，测定结果如下表所示：编号123456平均值rsd％面积(a)1119.00431115.19241112.97851097.90581109.60021103.65531109.722750.70％⑥重复性试验精密称取同一批样品(批号20161101)6份，按上述方法测定样品中丹酚酸b的含量，平均含量为7.0％，rsd值0，表明此丹酚酸b的测定方法具有良好的重复性；测定结果如下表所示：⑦稳定性试验按②项下方法制备供试品溶液一份，室温放置，按拟定色谱条件下于0，2，4，6，8，10h分别进样，测定峰面积。计算rsd％为0.19％，表明丹酚酸b在10h内相对稳定。稳定性试验结果如下表所示：⑧回收试验采用加样回收法。取已知含量的样品(含量(丹酚酸b)：70mg/·g)6份，每份精密称取0.075g，分别加入丹酚酸b对照品50.0mg，按照1.3.2项下制备方法制备。在上述色谱条件下测定，测得其平均回收率为98.75％，rsd％值为0.98，结果如下表所示：⑨样品含量测定按正文收载的方法对十批样品进行含量测定，结果如下表所示：由上表数据可知，本发明所检测的丹参中含丹酚酸b(c36h30o16)的量的平均值为5.0％。实施例4指纹图谱(1)仪器与试药仪器：高效液相色谱仪：aglient1260；色谱工作站：安捷伦1260工作站；色谱柱：zorbaxsb-c18(250mm×4.6,5μm)；电子分析天平。试剂：乙腈为色谱纯，水为超纯水；柠檬酸，柠檬酸钠及其他试剂均为分析纯。样品：修文基地采收丹参药材对照品：迷迭香酸对照品，丹酚酸b对照品。(2)方法色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为25cm，内径为4.6mm，粒径为5μm)；参照实施例3丹参样品中丹酚酸b含量检测的方法，进行梯度洗脱；检测波长为286nm；柱温为20℃；流速为每分钟1.0ml。参照物溶液的制备取迷迭香酸对照品和丹酚酸b对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml各含0.2mg的溶液，即得。供试品溶液的制备取本品粉末(过三号筛)约0.2g，精密称定，精密加入50ml甲醇，超声20min，即得。测定法分别精密吸取参照物溶液和供试品溶液各10μ1，注人液相色谱仪，测定，记录75分钟的色谱图，即得。方法学验证色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为25cm，内径为4.6mm，粒径为5μm)；参照实施例3丹参样品中丹酚酸b含量检测的方法，进行梯度洗脱；检测波长为286nm；柱温为30℃；流速为每分钟1.0ml。理论板数按迷迭香酸峰计算应不低于20000。专属性：按供试品溶液的制备方法分别制备供试品溶液(2份平行样)，再分别精密吸取参照物溶液、供试品溶液(2份平行样)、空白溶液及配置溶剂各10μl，注入液相色谱仪，测定，记录色谱图。精密度：按供试品溶液的制备方法制备的供试品溶液，取同一份供试品溶液,重复进样6次,直观观察指纹图谱的全貌无明显差别,采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004a版)”计算相似度，其匹配图如图4所示。由图4所示的结果可知，在同一台仪器测得的色谱指纹图谱的相似度均为1.000，全部相似度≥0.950,表明该仪器的精密度良好,符合指纹图谱检测要求。重复性：按供试品溶液的制备方法制备的供试品溶液，平行操作6次，在上述色谱条件下，记录色谱图，采用“中药指纹图谱相似度评价系统(2004年a版)”计算相似度，其匹配图如图5所示。由图5所示结果可知，在同一台仪器测得的色谱指纹图谱的相似度分别为相似度分别是0.997、0.999、0.951、0.997、0.999、1.000，相似度≥0.95，表明该方法重复性较好，符合指纹图谱检测要求。稳定性：取同一份样品，分别在0、2、4、6、8、10h等6个时间点进行检测，直观观察指纹图谱的全貌，无明显变化,用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004a版)”计算相似度，其匹配图如图6所示。由图6结果的结果可知，在同一台仪器测得的色谱指纹图谱的相似度分别为0.961，0.994，1.000，0.994，1.000，1.000，相似度≥0.950,表明在此时间内供试品溶液的成分稳定,符合指纹图谱检测要求。取15批丹参药材，照(2)方法中供试品处理进行试验，记录色谱图。其中，15批丹参药材的指纹图谱编号如下表所示：编号批号s120141101s220141102s320141103s420141104s520141105s620151101s720151102s820151103s920151104s1020151105s1120161101s1220161102s1320161103s1420161104s1520161105采用“中药指纹图谱相似度评价系统(2004年a版)”分析，以s1产地样品的色谱图作为参照图谱，中位数生成法，选取时间宽度为0.10min，经多点校正后，生成丹参药材指纹图谱共有模式。其相似度见下表：由上表数据可知，十五批丹参药材指纹图谱的整体相似度为0.954～1(＞0.95，符合标准要求)。十五批丹参药材相似度评价系统匹配图如图7所示。同时，十五批丹参药材生成的对照指纹图谱如图8所示；图8中，峰2为迷迭香酸特征峰；峰4为丹酚酸b特征峰。对比例1按照现有技术中所公开的方法，对实施例2中同批次的丹参进行丹参酮类物质检测，具体方法如下：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相a，以0.02％磷酸溶液为流动相b，按下表中的规定进行梯度洗脱；时间(分钟)流动相a(乙腈)流动相b(0.1％磷酸酸水溶液)01090152080352575453070559010709010柱温20℃；检测波长为270nm。理论板数按丹参酮iia峰计算应不低于60000。对照品溶液以及具体测定方法和相关参数的选择与实施例2相同。分别参照实施例2的方法，进行⑤-⑨测试，结果如下：对比例2按照现有技术中所公开的方法，对实施例2中同批次的丹参进行丹酚酸检测；色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-0.1％磷酸溶液(22：78)为流动相；柱温为20℃；流速为每分钟1.2ml；检测波长为286nm。理论板数按丹酚酸b峰计算应不低于6000。对照品溶液以及具体测定方法和相关参数的选择与实施例3相同。分别参照实施例3的方法，进行⑤-⑨测试，结果如下：尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。当前第1页12