本发明涉及一种金纳米团簇探针的酸性磷酸酶电致化学发光测定方法，属于分析化学及纳米技术领域。
背景技术
酸性磷酸酶（acidphosphatase，acp）是哺乳动物体液和组织中的一种水解酶，它能够在酸性条件下有效地水解磷酸酯，脱去其中的磷酸基团，在基因转移、细胞代谢、神经系统等生物过程中起着关键的作用。正常人血清中的酸性磷酸酶主要来源于人体的骨、肝、肾、脾、胰等组织中。在临床上，异常的酸性磷酸酶浓度暗示了一些疾病的病理过程，例如，前列腺癌、溶血性贫血、甲状旁腺功能亢进与多发性骨髓瘤等。酸性磷酸酶已被认为是一些疾病的生物标志物，在疾病诊断、术后评估与药物筛选方面具有重要的意义。目前，用于检测酸性磷酸酶检测的方法如高效液相色谱法，比色法，荧光分析法，化学发光法，电化学方法等存在如灵敏度和准确度低、操作过程繁琐、费用较高、检测时间长等不足，极大地限制其在临床诊断中的应用。因此，建立简单、快速、高灵敏的酸性磷酸酶含量检测新方法具有重要的实际意义。
电致化学发光（electrochemiluminescence，简称ecl）是指电活性物质在电极表面或电极附近发生氧化还原反应，形成激发态，再由激发态回到基态而产生光辐射的现象。从某种意义上说，ecl是电化学和光谱方法的理想组合。ecl不仅具有传统化学发光（cl）的灵敏度和宽动力学响应范围，而且还表现出电化学方法的几个优点，包括设备简单，可控性强和重现性好。迄今为止，ecl已经成为一种强大的分析技术，被广泛应用于生命分析、环境监测、临床检测等领域。
随着科技的不断发展，纳米发光体已由分子发光体逐渐发展为纳米发光体，这些材料包括半导体量子点、碳纳米材料、过渡金属硫族化合物、金属团簇等。金纳米团簇（aunanocluster，auncs）是最近发展起来一种新型的ecl发光体，因其独特的性质展现出巨大的应用潜力，引起了人们广泛的关注。auncs直径接近电子的费米波长，因此可出现尺寸依赖的homo-lumo能级跃迁及荧光现象。此外低毒性、催化性能和生物相容性好等优点，使其在ecl分析中有着广泛的应用前景。虽然目前基于auncs荧光性质的研究与应用已经取得相当丰富的成果，但基于auncs的ecl方面的研究还相对较少，可能是由于还存在ecl强度小、发光机制尚未阐明等问题。因此，构建一个新型高效的ecl传感器显得尤为重要。本课题组通过纳米尺度调控成功实现高量子产率金纳米团簇电致化学发光探针的制备，并在此基础上建立了一系列新型高效电致化学发光生命分析平台。
本发明以金纳米团簇为电致化学发光探针，以二氧化锰纳米片为猝灭剂，基于酸性磷酸酶选择性水解2-磷酸-l-抗坏血酸三钠盐产生的抗坏血酸与二氧化锰的氧化还原反应恢复电致化学发光信号，建立一种高灵敏、高选择、快速的酸性磷酸酶测定新方法。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种以金纳米团簇为电致化学发光探针的酸性磷酸酶测定方法。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：一种基于金纳米团簇探针的酸性磷酸酶电致化学发光测定方法，其特征是：首先在电极表面修饰金纳米团簇，通过还原法制备高量子产率金纳米团簇电致化学发光探针，并进一步在电极表面修饰二氧化锰纳米材料，将其作为电致化学发光猝灭剂；将酸性磷酸酶加入2-磷酸-l-抗坏血酸三钠盐溶液中，酸性磷酸酶选择性水解2-磷酸-l-抗坏血酸三钠盐产生抗坏血酸，进而将修饰电极浸入上述反应液中，产生的抗坏血酸与二氧化锰发生氧化还原反应；采集修饰电极的电致化学发光信号，根据电致化学发光信号的改变实现酸性磷酸酶的测定。
2、根据权利要求1所述的一种基于金纳米团簇探针的酸性磷酸酶电致化学发光测定方法，其特征是所述还原法制备高量子产率金纳米团簇电致化学发光探针采用下述的电化学还原法或化学还原法制备：
（1）电化学还原法：采用三电极体系，以金纳米团簇修饰玻碳电极为工作电极，铂丝电极为对电极，ag/agcl为参比电极，将上述电极插入0.1mol/lph7.4磷酸盐缓冲溶液中，施加-1.4v~-2v范围内负电位电压，进行恒电位还原处理5min~1h，得到电化学发光金纳米团簇探针；
（2）化学还原法：将金纳米团簇修饰玻碳电极浸泡在0.1~1mol/l硼氢化钠溶液反应5min~30min，得到化学还原法制备的金纳米团簇探针修饰电极。
所述金纳米团簇为功能化修饰金纳米团簇，采用n-乙酰化-l-半胱氨酸-金纳米团簇或谷胱甘肽-金纳米团簇。
所述在电极表面修饰二氧化锰纳米材料的方法为电化学沉积法：采用三电极体系，以还原法处理金纳米团簇修饰电极为工作电极，铂丝电极为对电极，ag/agcl为参比电极，采用i-t法，在1:1v/v的kmno4-h2so4溶液中，电化学沉积二氧化锰，电位为-0.1~-0.5v，沉积时间为100s~600s，清洗，氮气吹干。
所述采集修饰电极的电致化学发光信号方法如下：采用三电极体系进行测试，以修饰电极为工作电极，铂丝电极为对电极，ag/agcl为参比电极，缓冲溶液为磷酸盐缓冲溶液或tris-hcl缓冲溶液，所用电解质为kcl或kno3；将上述电极插入含有过硫酸根离子共反应剂的缓冲溶液中，采用阶跃脉冲法进行电化学发光测试，初始电位为0v，脉冲时间为10s，终止电位为-2v，脉冲时间为1s，光电倍增管高压设置为600~800v，检测电致化学发光辐射信号。
所述产生的抗坏血酸与二氧化锰发生氧化还原反应的ph为8.0，反应时间为4min。
采集修饰电极的电致化学发光信号的磷酸盐缓冲溶液或tris-hcl缓冲溶液的ph值为7.4，过硫酸根离子浓度为0.1mol/l。
电致化学发光强度变化值与抗坏血酸浓度的对数值在2.0×10-4~2.0×102u/l的范围内呈线性关系，检测限为6.5×10-5u/l。
具体地说，为了实现上述目的，本发明采用以下具体技术方案：将金纳米团簇修饰在玻碳电极上，通过还原法制备高量子产率金纳米团簇电致化学发光探针，进而在电极表面电沉积二氧化锰纳米材料；将酸性磷酸酶加入2-磷酸-l-抗坏血酸三钠盐溶液中，酸性磷酸酶选择性水解2-磷酸-l-抗坏血酸三钠盐产生抗坏血酸，进一步将二氧化锰/金纳米团簇修饰电极浸入上述反应液中；采集修饰电极的电致化学发光信号，利用反应液中产生的抗坏血酸与电极表面的二氧化锰发生氧化还原反应恢复电致化学发光信号，根据电致化学发光信号的变化实现酸性磷酸酶的测定。
上述金纳米团簇探针由以下方法制备：（1）电化学还原法：采用三电极体系进行还原，以金纳米团簇修饰玻碳电极为工作电极，铂丝电极为对电极，ag/agcl为参比电极，将上述电极插入缓冲溶液中，施加不同负电位电压，进行恒电位还原处理，得到电化学发光金纳米团簇探针；（2）化学还原法：将金纳米团簇修饰玻碳电极浸泡在一定浓度的硼氢化钠溶液反应一定时间，得到化学还原法制备的金纳米团簇探针修饰电极。
所述的金纳米团簇材料为功能化修饰金纳米团簇，如：n-乙酰化-l-半胱氨酸-金纳米团簇，牛血清白蛋白-金纳米团簇等。
所述的在电极表面电沉积二氧化锰纳米材料的方法为：采用三电极体系，以还原法处理金纳米团簇修饰电极为工作电极，铂丝电极为对电极，ag/agcl为参比电极，采用i-t法，在kmno4-h2so4（1:1v/v）溶液中，恒电位沉积制得二氧化锰纳米材料修饰电极。
所述的电致化学发光信号由以下方法采集：采用三电极体系进行测试，以修饰玻碳电极为工作电极，铂丝电极为对电极，ag/agcl为参比电极，将上述电极插入含有共反应剂的缓冲溶液中。采用阶跃脉冲法，光电倍增管高压设置为600v~800v，检测工作电极表面产生的电致化学发光信号。
本发明所述的一种基于金纳米团簇为电致化学发光探针的抗坏血酸测定方法，包括如下步骤：1）将玻碳电极用al2o3粉末依次抛光、打磨，至光滑镜面，再依次放入hno3溶液、无水乙醇，和去离子水中超声清洗，n2吹干；2）将金纳米团簇探针溶液滴加在处理好的玻碳电极表面，室温干燥，即得金纳米团簇探针修饰玻碳电极，通过还原法制备高量子产率金纳米团簇电致化学发光探针，并进一步制得二氧化锰纳米材料/金纳米团簇修饰电极；3）取不同浓度的酸性磷酸酶溶液，加入到2-磷酸-l-抗坏血酸三钠盐溶液中，混合均匀，然后将二氧化锰/金纳米团簇探针修饰玻碳电极放入上述溶液中浸泡。取出后用双蒸水冲洗干净，n2吹干后备用；4）采用三电极体系进行测试，以上述反应后二氧化锰/金纳米团簇探针修饰玻碳电极为工作电极，铂丝电极为对电极，ag/agcl为参比电极，将上述电极插入含有共反应剂的缓冲溶液中，检测其电致化学发光信号值；采用阶跃脉冲法，光电倍增管高压设置为600v~800v，检测工作电极表面产生的电致化学发光信号；4）以电致化学发光信号变化值对酸性磷酸酶浓度的对数值作图得到标准曲线，在酸性磷酸酶浓度为2.0×10-4~2.0×102u/l的范围内抗坏血酸浓度的对数值与电致化学发光强度值呈良好的线性关系，检测限为6.5×10-5u/l。
上述共反应剂为过硫酸根离子，浓度范围为0.01~1mol/l，优选0.1mol/l。
所述缓冲溶液为磷酸盐缓冲液或tris-hcl缓冲溶液，在缓冲溶液中所添加电解质为kcl或kno3，浓度为0.01~1mol/l。
本发明采用的具体技术方案如下：
（一）n-乙酰-l-半胱氨酸-金纳米团簇的制备
n-乙酰-l-半胱氨酸-金纳米团簇合成步骤如下：将浓度为0.1~0.8mol/l的氢氧化钠与浓度为0.01~0.1g/l氯金酸溶液加入到浓度为0.02~0.18mol/l的n-乙酰-l-半胱氨酸溶液中，混匀后置于20~70℃恒温水浴恒温反应0~3.5小时。待反应结束后透析纯化处理，得到n-乙酰-l-半胱氨酸-金纳米团簇水溶液，冷冻干燥后可得到n-乙酰-l-半胱氨酸-金纳米团簇材料粉末。
（二）金纳米团簇修饰电极的制备
将玻碳电极用1.0μm、0.3μm和0.05μm的al2o3粉末依次抛光、打磨，至光滑镜面，再依次放入hno3溶液、无水乙醇，和去离子水中超声清洗3分钟，n2吹干。取5μl金纳米团簇水溶液滴加在处理好的玻碳电极表面，室温干燥，即得金纳米团簇修饰玻碳电极。
（三）金纳米团簇探针制备
（1）电化学还原法：采用三电极体系进行还原，以金纳米团簇修饰玻碳电极为工作电极，铂丝电极为对电极，ag/agcl为参比电极，将上述电极插入缓冲溶液中，施加负电位电压（-1.4v~-2v范围内），进行恒电位还原处理5min~1h，得到电化学发光金纳米团簇探针。
（2）化学还原法：将金纳米团簇修饰玻碳电极浸泡在0.1~1mol/l硼氢化钠溶液反应5~30min（优选0.1mol/l硼氢化钠溶液反应5min），得到化学还原法制备的金纳米团簇探针修饰电极。
（四）二氧化锰纳米材料修饰方法
采用电化学沉积法修饰二氧化锰纳米材料，具体步骤如下：采用三电极体系，以还原法处理金纳米团簇修饰电极为工作电极，铂丝电极为对电极，ag/agcl为参比电极，采用i-t法，在kmno4-h2so4（1:1v/v）溶液中，电化学沉积二氧化锰，沉积电位为-0.2v，沉积时间为100s~600s，优选300s，之后用双蒸水冲洗干净，氮气吹干备用。
（五）电致化学发光信号采集方法
将电极抛光，再依次放入hno3溶液、无水乙醇和去离子水中超声清洗，n2吹干。采用三电极体系进行测试，以修饰玻碳电极为工作电极，铂丝电极为对电极，ag/agcl为参比电极，将上述电极插入含有共反应剂的缓冲溶液中。采用阶跃脉冲法，初始电位为0v，脉冲时间为10s，终止电位为-2v，脉冲时间为1s。光电倍增管高压设置为600v~800v，检测工作电极表面产生的电致化学发光信号。
所述电极为玻碳电极、丝网印刷电极或ito电极等。上述共反应剂为过硫酸根离子，浓度范围为0.01~1mol/l，优选0.1mol/l。所述缓冲溶液为磷酸盐缓冲液或tris-hcl缓冲溶液，在缓冲溶液中所添加电解质为kcl或kno3，浓度为0.01~1mol/l，优选0.1mol/l。
（六）酸性磷酸酶的测定
将不同浓度的酸性磷酸酶加入50µl40~100mm2-磷酸-l-抗坏血酸三钠盐溶液，混合均匀，再加入400µl50mmhac缓冲液（ph5.0）反应30分钟后，随后加入0.1m氢氧化钠70~80µl，调节体系ph值至8.0。进而将二氧化锰/金纳米团簇修饰电极浸入上述反应液中反应4~10min，取出后用双蒸水冲洗干净，n2吹干。采集工作电极表面产生的电致化学发光信号，以电致化学发光信号对抗坏血酸浓度作图绘制标准曲线。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明以高量子产率金纳米团簇探针为电致化学发光材料，以纳米二氧化锰为电致化学发光猝灭剂，基于酸性磷酸酶选择性水解2-磷酸-l-抗坏血酸三钠盐产生的抗坏血酸与二氧化锰的氧化还原反应恢复电致化学发光信号，实现对酸性磷酸酶含量的检测。本发明对酸性磷酸酶的检测操作简单、成本低、灵敏度高、稳定性好、准确性好、线性范围宽（2.0×10-4~2.0×102u/l），且检测限低（6.5×10-5u/l），因而具有良好的市场价值。
附图说明
图1为金纳米团簇探针修饰玻碳电极的电致化学发光-时间曲线图。
图2为二氧化锰/金纳米团簇探针修饰玻碳电极的电致化学发光-时间曲线图。
图3为二氧化锰/金纳米团簇探针修饰电极浸入酸性磷酸酶和2-磷酸-l-抗坏血酸三钠盐反应液后的电致化学发光-时间曲线图。
图4为2-磷酸-l-抗坏血酸三钠盐浓度的优化图。
图5为电致化学发光强度变化与酸性磷酸酶浓度对数值之间的线性关系图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步阐述，本发明并不限于此。
实施例1
往4ml浓度为0.08mol/l的n-乙酰-l-半胱氨酸溶液中加入0.6ml浓度为0.5mol/l的氢氧化钠与0.4ml浓度为20mg/ml氯金酸溶液，混匀后置于37℃恒温水槽中孵育3h。反应结束后的反应液用截留分子为3500的透析袋进行透析纯化处理，得到n-乙酰-l-半胱氨酸-金纳米团簇水溶液，冷冻干燥后得到n-乙酰-l-半胱氨酸-金纳米团簇粉末。
实施例2
将直径3mm的玻碳电极用1.0μm、0.3μm和0.05μm的al2o3粉末依次抛光，打磨，至光滑镜面，再依次放入hno3溶液，无水乙醇，去离子水中超声清洗3分钟，n2吹干。取5μl实施例1制备的n-乙酰-l-半胱氨酸-金纳米团簇溶液滴加在处理好的玻碳电极表面，室温干燥，得n-乙酰-l-半胱氨酸-金纳米团簇修饰玻碳电极。将n-乙酰-l-半胱氨酸-金纳米团簇修饰玻碳电极浸泡在0.1mol/l硼氢化钠溶液中反应5min，得到金纳米团簇探针修饰电极。将上述金纳米团簇探针修饰电极为工作电极，铂丝为对电极，ag/agcl电极为参比电极，插入含有0.1mol/l过硫酸钾和0.1mol/lkcl的0.1mol/lph7.4磷酸盐缓冲溶液中。采用阶跃脉冲法，初始电位为0v，脉冲时间为10s，终止电位为-2v，脉冲时间为1s。光电倍增管高压设置为750v，检测工作电极表面产生的电致化学发光信号，得到电化学发光信号（见图1）。
实施例3
将直径3mm的玻碳电极用1.0μm、0.3μm和0.05μm的al2o3粉末依次抛光，打磨，至光滑镜面，再依次放入hno3溶液，无水乙醇，去离子水中超声清洗3分钟，n2吹干。取5μl实施例1制备的n-乙酰-l-半胱氨酸保护的金纳米团簇溶液滴加在处理好的玻碳电极表面，室温干燥，并进一步将该电极浸泡在0.1mol/l硼氢化钠溶液中反应5分钟，得到金纳米团簇探针修饰玻碳电极。采用三电极体系，以金纳米团簇探针修饰玻碳电极为工作电极，铂丝电极为对电极，ag/agcl为参比电极，采用计时电流法，在1:1v/vkmno4-h2so4溶液中，电沉积二氧化锰，沉积电位为-0.2v，沉积时间为300s，所得到的电极为二氧化锰/金纳米团簇修饰玻碳电极，之后用双蒸水冲洗干净，n2气轻轻吹干备用。将上述电极插入含有0.1mol/l过硫酸钾和0.1mol/lkcl的0.1mol/lph7.4磷酸盐缓冲溶液中。采用阶跃脉冲法，初始电位为0v，脉冲时间为10s，终止电位为-2v，脉冲时间为1s。光电倍增管高压设置为750v，检测工作电极表面产生的电致化学发光信号，得到电化学发光信号（见图2）。
实施例4
将50µl400u/l酸性磷酸酶加入50µl40mm2-磷酸-l-抗坏血酸三钠盐（2-phospho-l-ascorbicacidtrisodiumsalt，购自sigma-aldrich公司）溶液，混合均匀，再加入400µl50mmhac缓冲液（ph5.0），随后加入0.1m氢氧化钠79.3µl，调节体系ph值至8.0反应30分钟后。进而将实施例3制备的二氧化锰/金纳米团簇修饰电极浸入上述反应液中反应4min，取出后用双蒸水冲洗干净，n2吹干。以上述吹干后的二氧化锰/金纳米团簇探针修饰电极为工作电极，铂丝为对电极，ag/agcl电极为参比电极，插入含0.1mol/l过硫酸钾和0.1mol/lkcl的0.1mol/l、ph8.0磷酸盐缓冲溶液中。采用阶跃脉冲法，初始电位为0v，脉冲时间为10s，终止电位为-2v，脉冲时间为1s。光电倍增管高压设置为750v，反应4min后，取出后用双蒸水冲洗干净，n2吹干。检测工作电极表面产生的电致化学发光信号，得到的电致化学发光信号比未加入酸性磷酸酶和2-磷酸-l-抗坏血酸三钠盐溶液反应液中的电致化学信号明显增大（见图3）。
实施例5
将50µl400u/l酸性磷酸酶加入50µl不同浓度2-磷酸-l-抗坏血酸三钠盐溶液，混合均匀，再加入400µl50mmhac缓冲液（ph5.0）反应30分钟后，随后加入0.1m氢氧化钠79.3µl，调节体系ph值至8.0。进而将将实施例3制备的二氧化锰/金纳米团簇修饰电极浸入上述反应液中反应4min，取出后用双蒸水冲洗干净，n2吹干。以上述吹干后的二氧化锰/金纳米团簇探针修饰电极为工作电极，铂丝为对电极，ag/agcl电极为参比电极，插入含0.1mol/l过硫酸钾和0.1mol/lkcl的0.1mol/l、ph8.0磷酸盐缓冲溶液中。采用阶跃脉冲法，初始电位为0v，脉冲时间为10s，终止电位为-2v，脉冲时间为1s。光电倍增管高压设置为750v，反应4min后，分别检测2-磷酸-l-抗坏血酸三钠盐溶液浓度为0，1mm，2mm，3mm，4mm，6mm，8mm和10mm时工作电极表面产生的电致化学发光信号，得到最佳2-磷酸-l-抗坏血酸三钠盐溶液浓度为4mm（见图4）。
实施例6
将50µl不同浓度的酸性磷酸酶加入50µl40mm的2-磷酸-l-抗坏血酸三钠盐溶液，混合均匀，再加入400µl50mmhac缓冲液（ph5.0）反应30分钟后，随后加入0.1m氢氧化钠79.3µl，调节体系ph值至8.0。进而将实施例3制备的二氧化锰/金纳米团簇修饰电极浸入上述反应液中反应4min，取出后用双蒸水冲洗干净，n2吹干。以上述吹干后的二氧化锰/金纳米团簇探针修饰电极为工作电极，铂丝为对电极，ag/agcl电极为参比电极，插入含0.1mol/l过硫酸钾和0.1mol/lkcl的0.1mol/l、ph8.0磷酸盐缓冲溶液中。采用阶跃脉冲法，初始电位为0v，脉冲时间为10s，终止电位为-2v，脉冲时间为1s。光电倍增管高压设置为750v，反应4min后，分别检测不同浓度的酸性磷酸酶条件下工作电极表面产生的电致化学发光信号，在酸性磷酸酶浓度为2.0×10-4~2.0×102u/l的范围内谷胱甘肽浓度的对数值与电致化学发光强度值呈良好的线性关系，检测限为6.5×10-5u/l（见图5）。
以上所述仅为本发明的典型实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改，等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。