本发明涉及质检检验技术领域，尤其涉及一种程式化的基于薄层图谱的广藿香精准检验方法。
背景技术：
广藿香是一种常见、常用的中药材。在中药药品的应用中，存在一些在外观上与广藿香近似但植物种属及药性完全不同中药材，同时也存在一些与广藿香种属分类及药性较为接近的药材。因此，对于广藿香的精准化鉴别具有重要的实际意义。
现有广藿香的薄层鉴别方法分述如下。
药典检测方法：取本品粗粉适量，照挥发油测定法（通则2204)测定，分取挥发油0.5ml，加乙酸乙酯稀释至5ml，作为供试品溶液。另取百秋李醉对照品，加乙酸乙酯制成每lml含2mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法（通则0502)试验，吸取上述两种溶液各1-2μl，分别点于同一硅胶g薄层板上，以石油醚（30-60℃)-乙酸乙酯-冰醋酸（95:5:0.2)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5%三氣化铁乙醇溶液。供试品色谱中显一黄色斑点；加热至斑点显色淸晰，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同的紫蓝色斑点。
文献方法，《广藿香配方颗粒及其药材质量关系研究》给出了一种鉴别方法。原药材供试品制备:称取原药材粗粉约5.0g,置30ml具塞三角烧瓶中,加石油醚20ml,密闭,超声10min,滤过,弃去石油醚液,药渣加甲醇10ml,密闭,超声15min,滤过,甲醇液作为供试品溶液1。中间体供试品制备:称取清膏喷干粉约0.2g,置30ml具塞三角烧瓶中,加石油醚20ml,密闭,超声10min,滤过,弃去石油醚液,药渣加甲醇10ml,密闭,超声15min,滤过,甲醇液作为供试品溶液2。成品供试品制备:称取配方颗粒约0.2g,置30ml具塞三角烧瓶中,加石油醚20ml,密闭,超声10min,滤过,弃去石油醚液,药渣加甲醇10ml,密闭,超声15min,滤过,甲醇液作为供试品溶液3。薄层色谱条件。薄层板为硅胶gf254预制板;点样量:10μl;展开系统为石油醚-醋酸乙酯-甲醇-甲酸(7.5∶1.8∶1∶0.125);展开方式为采用二次展开,9cm/次。薄层行为和结果。将各供试品同法点在同一张薄层板上,按展开方式进行展开,取出晾干,再用5%alcl3乙醇液显色,于365nm下观察。结果显示,广藿香配方颗粒(供试品3)、中间体(供试品2)和药材(供试品10的薄层行为一致,显示相同的荧光斑点)。
文献方法，《广藿香配方颗粒提取工艺的研究》给出了如下的检测方法。供试品的制备。称取广藿香样品粗粉约5g,置250ml烧杯中,加10倍量水,按上述最终确定的提取工艺进行提取(即煎煮2h、共2次),合并提取液,滤过,滤液减压浓缩成浸膏,将药渣和浸膏于60℃烘箱中烘干,备用。将浸膏用甲醇适量提取2次,合并甲醇液,浓缩至5ml,作为供试品a。将甲醇提取后剩下的残渣用5ml水溶解,作为供试品b。将烘干的上述药渣用甲醇适量提取2次,甲醇液浓缩至5ml,作为供试品c。称取广藿香药材约5g,加甲醇适量提取2次,甲醇液浓缩至5ml,作为供试品d。称取广藿香药材约5g,加乙醇适量提取2次,甲醇液浓缩至5ml,作为供试品f。薄层色谱条件。薄层板:硅胶gf254预制板;展开系统:石油醚-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(体积比7.5∶1.8∶1∶0.125);展开方法及显色:进行二次展开,每次9cm,取出晾干,于紫外光灯365nm下观察,再用质量分数5%alcl3乙醇液显色,于365nm下观察。结果与分析。各供试品点样后进行展开,经alcl3乙醇液显色后于365nm下观察,从薄层色谱上可以看出,不同提取工艺的成分存在很大差别,提示药渣中存在较多的低极性成分,而水提液能够将大部分水溶性成分提取出来。
可见，现有技术的检测方法均较为简单，精准度不高，不能适应广藿香药材在广泛实际应用和检测鉴别中需求。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题是提供一种程式化、高度精准的广藿香薄层鉴别方法。
为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案如下。
广藿香的薄层鉴别方法，该方法首先进行供试样品的制备，并依照薄层色谱试验法，以石油醚-乙酸乙酯-甲醇-甲酸为展开剂进行图谱展开，最后采用两重鉴别法分别对不同展开剂下得到的图谱进行鉴别，检查待测图谱是否具有第一特征斑点和/或第二特征斑点，鉴定待测样品为广藿香正品、近似品或赝品。
作为本发明的一种优选技术方案，该方法包含如下步骤：
a、供试样品的制备：取广藿香粉末1g，置于锥形瓶中，加乙醇30ml，超声提取30min，滤过，滤液自然挥干或60℃以下蒸至近干，残渣加1ml甲醇溶解，作为供试品溶液；
b、薄层色谱展开：依照薄层色谱试验法，吸取步骤a所得供试品溶液5µl，点于硅胶g薄层板上，以体积比石油醚:乙酸乙酯:甲醇:甲酸=7.50:1.80:1.00:0.125为展开剂，展开、取出、晾干，然后喷以5%三氯化铝乙醇溶液，110℃加热至斑点清晰；
c、两重图谱鉴别法：
c-1、第一重检验：步骤b所得图谱置于日光下观察，察看其在rf=0.77-0.83位置是否具有特征斑点①；如果待察图谱不具有所述特征斑点①，则鉴定所检样品为广藿香赝品，鉴别完毕；如果待察图谱具有所述特征斑点①，则进入c-2步骤；
c-2、第二重检验：对于具有特征斑点①的样品图谱，进一步在紫外光灯下察看其在rf=0.26-0.32位置是否具有特征斑点②，如果待察图谱具有所述特征斑点②，则认定所检样品为广藿香正品，鉴别完毕；如果待察图谱不具有所述特征斑点②，则认定所检样品为广藿香近似品，鉴别完毕。
作为本发明的一种优选技术方案，步骤a中，所述广藿香粉末为广藿香药材或饮片经粉碎所得粗粉。
作为本发明的一种优选技术方案，步骤c-1中，所述日光检视为透光检视，所述rf=0.80。
作为本发明的一种优选技术方案，步骤c-1中，所述特征斑点①为类圆形特征斑点，具有斑点清晰、分离度好的特点。
作为本发明的一种优选技术方案，步骤c-2中，所述紫外光的波长为365nm，所述rf=0.29。
作为本发明的一种优选技术方案，步骤c-2中，所述特征斑点②为类圆形特征斑点，色调一致为淡蓝色。
采用上述技术方案所产生的有益效果在于：本发明提供的全新检测方法及检测程式，具有高精度、适用范围广、检测结果全面的特点，能够快速便捷的对待测样品进行正品、近似品、赝品的分类鉴定，与现有方法相比，是一种全新的、检测效果明显进步的实用方法。
附图说明
图1为实施例3中待测样品在日光下的图谱样貌。
图2为待测样品在紫外光下的图谱样貌。
图中：1-4样品广藿香对照药材；5广藿香水煎液；6百秋李醇对照品；①、②分别指示特征斑点①、②。
具体实施方式
以下实施例详细说明了本发明。本发明所使用的各种原料及各项设备均为常规市售产品，均能够通过市场购买直接获得。
实施例1、样品制备。
a-1、供试样品的制备：取广藿香粉末1g，置于锥形瓶中，加乙醇30ml，超声提取30min，滤过，滤液蒸干（自然挥干或60℃以下蒸至近干），残渣加1ml甲醇使溶解，作为供试品溶液；其中，广藿香粉末为广藿香药材或饮片经粉碎所得粗粉。
a-2、广藿香非挥发性部位对照品制备：取广藿香粉剂1g，加30ml水溶解，再用40ml乙酸乙酯萃取两次，每次20ml，合并萃取液，蒸干，残渣加1ml乙醇溶解作为广藿香非挥发性部位对照品溶液，其中，广藿香粉剂为广藿香药材或饮片的水煎提取干膏粉，水煎提取干膏粉的制备方法为：取广藿香原料，加热（一般温度是100℃）回流提取3次，每次0.8-1.2h，过滤，滤液浓缩，蒸干，研成粉末备用。
a-3、百秋李醇对照品的制备：取百秋李醇对照品加乙醇制成2mg/ml的百秋李醇对照品溶液。
实施例2、薄层色谱。
b-1、薄层色谱展开：依照薄层色谱试验法，吸取步骤a-1所得供试品溶液5µl，步骤a-2、a-3所得广藿香非挥发性部位对照品溶液及百秋李醇对照品溶液各10µl，点于同一硅胶g薄层板上，以体积比石油醚:乙酸乙酯:甲醇:甲酸=7.50:1.80:1.00:0.125为展开剂，展开、取出、晾干。
b-2、显色：步骤b-1所得样品喷以5%三氯化铝乙醇溶液，110℃加热至斑点清晰。
实施例3、两重图谱鉴别法。
c-1、第一重检验：参见附图1，步骤b所得百秋李醇对照品及待测样品图谱置于日光下观察；对于百秋李醇对照品，其在f=0.80位置具有特征斑点①，特征斑点①为类圆形特征斑点，色调一致为淡蓝色；与此对比，察看待测品在rf=0.80位置附近是否具有特征斑点①；如果待察图谱不具有所述特征斑点①，则鉴定所检样品为广藿香赝品，鉴别完毕；如果待察图谱具有所述特征斑点①，则进入c-2步骤；
c-2、第二重检验：参见附图2，对于具有特征斑点①的样品图谱以及广藿香非挥发性部位对照品图谱，进一步在紫外光灯下察看，对于广藿香非挥发性部位对照品图谱，其在rf=0.29位置具有特征斑点②，特征斑点②为类圆形特征斑点，具有斑点清晰、分离度好的特点；与此对比，察看待测品在rf=0.29位置附近是否具有特征斑点②，如果待察图谱具有所述特征斑点②，则认定所检样品为广藿香正品，鉴别完毕；如果待察图谱不具有所述特征斑点②，则认定所检样品为广藿香近似品，鉴别完毕。
实施例4、薄层色谱试验法方法。
实施例2中薄层色谱试验法的具体操作方法参照如下内容。
4.1仪器与材料
(1)薄层板按支持物的材质分为玻璃板、塑料板或铝板等；按固定相种类分为硅胶薄层板、键合硅胶板、微晶纤维素薄层板、聚酰胺薄层板、氧化铝薄层板等。固定相中可加入黏合剂、荧光剂。硅胶薄层板常用的有硅g、硅胶gf254、硅胶h、硅胶hf254、g、h表示含或不含膏黏合剂。f254为在紫外光254nm波长下显绿色背景的荧光剂。按固定相粒径大小分为普通薄层板（10-40μm)和高效薄层板(5-10μm)保证色谱质量的前提下，可对薄层板进行特别处理和化学改性以适应分离的要求，可用实验室自制的薄层板。固定相颗粒大小一般要求粒径为10-40μm。玻璃板应光滑、平整，洗净后不附水珠。
(2)点样器一般采用微升毛细管或手动、半自动、全自动点样器材。
(3)展开容器上行展开一般可用适合薄层板大小的专用平底或双槽展开缸，展开时须能密闭。水平展开用专用的水平展开槽。
(4)显色装置喷雾显色应使用玻璃喷雾瓶或专用喷雾器，要求用压缩气体使显色剂呈均匀细雾状喷出；浸渍显色可用专用玻璃器械或用适宜的展开缸代用；蒸气熏蒸显色可用双槽展开缸或适宜大小的干燥器代替。
(5)检视装置为装有可见光、254nm及365nm紫外光光源及相应的滤光片的暗箱，可附加摄像设备供拍摄图像用。暗箱内光源应有足够的光照度。
4.2操作方法
(1)薄层板制备
市售薄层临用前一般应在110℃活化30分钟。聚酰胺薄膜不需活化。铝基片薄层板、塑料薄层板可根据需要剪裁，但须注意剪裁后的薄层板底边的固定相层不得有破损。如在存放期间被空气中杂质污染，使用前可用三氯甲烷、甲醇或二者的混合溶剂在展开缸中上行展开预洗，晾干，110℃活化，置干燥器中备用。
自制薄层板除另有规定外，将1份固定相和3份水(或加有黏合剂的水溶液，如0.2%-0.5%羟甲基纤维素钠水溶液，或为规定浓度的改性剂溶液）在研钵中按同一方向研磨混合，去除表面的气泡后，倒入涂布器中，在玻板上平稳地移动涂布器进行涂布（厚度为0.2-0.3mm)，取下涂好薄层的玻板，置水平台上于室温下晾干后，在110℃烘30分钟，随即置于有干燥剂的干燥箱中备用。使用前检查其均匀度，在反射光及透视光下检视，表面应均匀、平整、光滑，并且无麻点、无气泡、无破损及污染。
(2)点样除另有规定外，在洁净干燥的环境中，用专用毛细管或配合相应的半自动、自动点样器械点样于薄层板上。一般为圆点状或窄细的条带状，点样基线距底边10-15mm,高效板一般基线离底边8-lomm，圆点状直径一般不大于4mm，高效板一般不大于2mm。接触点样时注意勿损伤薄层表面。条带宽度一般为5-10mm，高效板条带宽度一般为4-8mm,可用专用半自动或自动点样器械喷雾法点样。点间距离可视斑点扩散情况以相邻斑点互不干扰为宜，一般不少于8mm，高效板供试品间隔不少于5mm。
(3)展开将点好供试品的薄层板放人展开缸中，浸入展开剂的深度为距原5mm为宜，密闭。除另有规定外，一般上行展开8-15cm，髙效薄层板上行展开5-8cm。溶剂前沿达到规定的展距，取出薄层板，晾干，待检测。
展开前如需要溶剂蒸气预平衡，可在展开缸中加人适量的展开剂，密闭，一般保持15-30分钟。溶剂蒸气预平衡后，应迅速放人载有供试品的薄层板，立即密闭，展开。如需使展开缸达到溶剂蒸气饱和的状态，则须在展开缸的内壁贴与展开缸高、宽同样大小的滤纸，一端浸入展开剂中，密闭一定时间，使溶剂蒸气达到饱和再如法展开。
必要时，可进行二次展开或双向展开，进行第二次展开前，应使薄层板残留的展开剂完全挥干。
(4)显色与检视有颜色的物质可在可见光下直接检视，无色物质可用喷雾法或浸溃法以适宜的显色剂显色，或加热显色，在可见光下检视。有荧光的物质或显色后可激发产生荧光的物质可在紫外光灯（365nm或254nm)下观察荧光斑点。对于在紫外光下有吸收的成分，可用带有荧光剂的薄层板（如硅胶gf254板），在紫外光灯（254nm)下观察荧光板面上的荧光物质淬灭形成的斑点。
(5)记录薄层色谱图像一般可采用摄像设备拍摄，以光学照片或电子图像的形式保存。也可用薄层色谱扫描仪扫描或其他适宜的方式记录相应的色谱图。
4.3系统适用性试验
按品种项下要求对实验条件进行系统适用性试验，即用供试品和标准物质对实验条件进行试验和调整，应符合规定的要求。
(1)比移值(rf)系指从基线至展开斑点中心的距离与从基线至展开剂前沿的距离的比值。
(2)分离度（或称分离效能）鉴别时，供试品与标准物质色谱中的斑点均应清晰分离。
4.4测定法
鉴别按品种项下规定的方法，制备供试品溶液和对照标准溶液，在同一薄层板上点样、展开与检视，供试品色谱图中所显斑点的位置和颜色（或荧光)应与标准物质色谱图的斑点一致。
综上所述，本发明提供的全新检测方法及检测程式，具有高精度、适用范围广、检测结果全面的特点，能够快速便捷的对待测样品进行正品、近似品、赝品的分类鉴定，与现有方法相比，是一种全新的、检测效果明显进步的实用方法。
上述描述仅作为本发明可实施的技术方案提出，不作为对其技术方案本身的单一限制条件。