一种对铜离子不同吸附容量的螺旋藻快速鉴别方法与流程

本发明涉及铜离子不同吸附容量螺旋藻的区分技术领域，尤其涉及一种对铜离子不同吸附容量的螺旋藻快速鉴别方法。

背景技术

随着社会和经济的不断发展，环境问题引起人们的广泛关注，其中重金属污染是引发环境问题的一个重要因素。煤矿、钢铁、冶金等领域在生产活动中都会带来铅、汞、铜、铬等多种重金属污染，对环境造成了严重的影响。常用的化学沉淀法和离子交换法可以去除水体的重金属污染，但是投资大，成本较高，对环境有二次污染；而生物吸附法成本较低，有较好的选择性，吸附量及吸附范围比较大，一般无二次污染。新兴的生物吸附技术可能是解决这些问题的一个有效途径。

早在20世纪末期，国内外科学家通过对微生物吸附回收废水中重金属的研究，发现细菌、藻类、酵母等微生物适合做水中吸附剂。其中螺旋藻一般在微藻工业中应用广泛，价格低廉，容易得到，具有较大的比表面积、高密度的细胞黏质和活性基团，对重金属吸附容量高,更适合做一种优良的生物吸附剂。然而，由于不同种质和营养条件下螺旋藻细胞内的脂类、蛋白、多糖等成分的含量和比例具有明显的差异，而这些组分又与重金属离子的吸附性能密切相关，因此对螺旋藻细胞组分的吸附重金属的分析对筛选高效吸附重金属离子的生物吸附剂具有重要的指导意义。目前螺旋藻组分的分析主要依赖于藻体成分的分离、破碎、提取和含量测定这一常规的检测技术。然而，此类方法操作步骤复杂繁琐、成本较高并且分析耗时较长，很难满足微藻组分快速分析的急切需求。

红外光谱(infraredspectroscopy，ir)是依据分子吸收红外辐射后发生能级的跃迁过程中光谱的振动情况来确定物质基团的结构和化合物的含量等信息。尤其是近十几年随着傅里叶转换技术的快速发展，傅氏转换红外线光谱分析(fouriertransforminfraredspectroscopy，ftir)技术在分类鉴定、生长代谢监测、育种、水环境、食品医药等与微藻相关的领域取得了显著地进展。

可见，随着红外光谱仪的技术进步，基于ftir光谱检测分析方法日趋成熟。且由于其具有简单、快速、实时动态和无损检测等优势，同时也能够结合化学计量学方法对生物体进行多组分分析的特点，目前该没有关于基于ftir光谱技术对不同种质的螺旋藻的铜离子吸附容量进行筛选或鉴别的报道。

技术实现要素：

本发明提出了一种对铜离子不同吸附容量的螺旋藻快速鉴别方法，基于红外光谱，并结合二阶导数处理和主成分分析处理获得定类特征光谱，能够简单、快速地将具有不同的铜离子吸附容量螺旋藻进行鉴别，为寻找能够高效去除污水中重金属的螺旋藻种质提供重要的理论支持和实践意义。

本发明提出的一种对铜离子不同吸附容量的螺旋藻快速鉴别方法，包括如下步骤：

s1、采集红外光谱：采集不同种质螺旋藻的红外光谱；

s2、红外光谱处理：将步骤s1所得红外光谱进行预处理，对预处理后的红外光谱求二阶导数得到二阶导数红外光谱，在二阶导数红外光谱中选取特征光谱数据进行主成分分析；

s3、聚类分析：选取步骤s2主成分分析所得主成分特征值作为不同种质螺旋藻的定类变量，基于所述定类变量将螺旋藻按照铜离子吸附容量的不同聚成不同类别。

优选地，步骤s1中，红外光谱采用傅氏转换红外线光谱分析仪检测获得，扫描次数为128次，测量波数范围为900-4000cm^-1，分辨率为4cm^-1。

优选地，红外光谱采集过程中，将螺旋藻粉与蒸馏水混合制得悬浮液，将悬浮液涂于baf2红外基底上，在50℃条件下烘干过夜，然后利用红外光谱仪进行检测。

优选地，螺旋藻粉制备的具体操作为：将螺旋藻按照10％的比例接种于无菌的z氏培养基进行培养，培养条件为：3000lx光照条件，30±1℃，12h/12h的光暗周期于光照培养箱中进行培养，每天手摇2-3次，至藻体生长到稳定期，取藻液离心10min，离心转速为10000rpm，弃上清，保留沉淀得到藻体，用去离子水离心洗涤藻体，将藻体置于60℃下干燥，然后研磨成均匀，过120目筛子得到螺旋藻粉。

优选地，步骤s2中，利用基线校正和矢量归一化对步骤s1所得红外光谱进行预处理。

优选地，步骤s2中红外光谱处理在brukeropus6.5软件中完成。

为了研究不同的特征光谱对于不同种质的螺旋藻的鉴别能力，发明人利用brukeropus6.5软件截取不同种质螺旋藻不同波数范围的二阶导数红外光谱进行主成分分析后聚类，分别以900-1200cm^-1、2800-3000cm^-1、1500-1700cm^-1和全谱段900-4000cm^-1作为特征光谱所得三维聚类图分别为图1、图5、图6、图7所示，从聚类结果可以看出特征光谱的波数范围为2800-3000cm^-1、1500-1700cm^-1和全谱段900-4000cm^-1不能很好地将不同螺旋藻进行区分，而900-1200cm^-1波段可以获得很好的聚类效果。

优选地，步骤s2中，特征光谱的波数为900-1200cm^-1。

优选地，主成分分析在eigenvector软件中进行。

优选地，步骤s3中，选取步骤s2主成分分析所得主成分特征值中可信度排名前3个主成分特征值作为螺旋藻的定类变量。

在具体实施例中，以步骤s3中获得螺旋藻的定类变量可以采用不同的聚类方法对不同螺旋藻样品进行聚类分析，如偏最小二乘法、支持向量机、主成分回归分析等；优选地步骤s3中，选取步骤s2主成分分析所得主成分特征值中可信度排名前3个主成分特征值作为螺旋藻的三维坐标值作三维聚类图，将不同种质螺旋藻聚成不同类别；

本发明中直接以可信度排名前3个主成分pc1、pc2和pc3作为三维坐标值作三维聚类图，简单快捷，不需要对数据作进一步的优化处理。

优选地，按照常规方法测定不同螺旋藻样品的铜离子吸附容量，将不同螺旋藻的铜离子吸附容量与聚类结果相对照判定聚类结果的准确性；如果聚类结果将具有相同铜离子吸附容量的同一品质螺旋藻样品聚成一类，且与其他种质螺旋藻能够明显区分开，即表示聚类准确性高，否则认为聚类准确性低。

优选地，铜离子的吸附容量采用双环己酮草酰二腙法测定。

优选地，双环己酮草酰二腙法测定螺旋藻的铜离子吸附容量的具体操作为：(1)取一组比色管分别加入不同浓度的铜标准溶液，加入0.7ml柠檬酸铵水溶液、0.5ml的氨水-氯化铵缓冲溶液、0.1ml乙醛、1.1ml双环己酮草酰二腙醇(bco)溶液，用蒸馏水稀释至5ml，用漩涡混合器混合10min，在545nm处的测定吸光度，绘制铜离子浓度标准曲线；(2)铜离子的吸附实验中分别称取0.04g不同种质的螺旋藻藻粉，溶于40ml的ph为6、浓度为100mg/l的cuso4水溶液，摇床振荡12h后12000rpm离心取上清溶液得到螺旋藻吸附铜离子待测液，按照制备铜离子浓度标准曲线操作测定螺旋藻吸附铜离子待测液；(3)对照铜离子浓度标准曲线得到螺旋藻吸附铜离子待测液中铜离子浓度，并计算不同种质螺旋藻对铜离子的吸附容量。

本发明中，吸附容量是指：单位质量(g)的螺旋藻吸附铜离子的质量(mg)，本发明中螺旋藻吸附铜离子质量的计算方法为：螺旋藻对铜离子的吸附质量＝吸附前的cuso4溶液中铜离子质量-吸附后的螺旋藻吸附铜离子待测液中铜离子质量。

其中，柠檬酸铵水溶液中柠檬酸铵的质量浓度为20％，氨水-氯化铵缓冲溶液是将4ml氨水和4g氯化铵溶于100ml去离子水中得到，乙醛的质量浓度为40％，双环己酮草酰二腙醇溶液为0.2gbco溶于50ml去离子水和50ml乙醇的混合溶液中得到。

本发明相比现有技术具有以下优点：利用ftir光谱技术，对已知不同种质螺旋藻的红外光谱，通过二阶导数处理和主成分分析获得不同种质螺旋藻的特异性定类变量对不同种质的螺旋藻进行聚类，结果表明将二阶导数处理和主成分分析处理所得900-1200cm^-1波段的特征光谱对不同种质螺旋藻具有很好的区分和聚类效果。基于本发明的鉴别方法采集红外光谱并获得特征光谱作为不同种质螺旋藻的定类变量，省去了现有技术通过螺旋藻组分分析不同种质螺旋藻吸附铜离子容量过程中分离、破碎、提取和含量测定等复杂的工序，对寻找能够高效去除污水中重金属的新型生物吸附材料提供重要的理论依据和实践意义。

附图说明

图1为本发明中特征光谱的波数为900-1200cm^-1得到的三维聚类图。

图2为本发明中不同种质螺旋藻的傅里叶转换红外光谱图。

图3为本发明中不同种质螺旋藻二阶导数处理后的二阶导数红外光谱图。

图4为本发明中不同种质螺旋藻的铜离子吸附容量曲线。

图5为本发明中特征光谱的波数2800-3000cm^-1得到的三维聚类图。

图6本发明中特征光谱的波数为1500-1700cm^-1得到的三维聚类图。

图7本发明中特征光谱的波数为900-4000cm^-1得到的三维聚类图。

具体实施方式

本发明提出的一种对铜离子不同吸附容量的螺旋藻快速鉴别方法，包括如下步骤：

s1、采集红外光谱：采集不同种质螺旋藻的红外光谱；

s2、红外光谱处理：将步骤s1所得红外光谱进行预处理，对预处理后的红外光谱求二阶导数得到二阶导数红外光谱，在二阶导数红外光谱中选取特征光谱数据进行主成分分析；

s3、聚类分析：选取步骤s2主成分分析所得主成分特征值作为不同种质螺旋藻的定类变量，基于所述定类变量将螺旋藻按照铜离子吸附容量的不同聚成不同类别。

下面，通过具体实施例对本发明的技术方案进行详细说明。

实施例1

一种对铜离子不同吸附容量的螺旋藻快速鉴别方法，包括如下步骤：

s1、采集红外光谱：利用nicolet380(thermoscientific)红外光谱仪采集不同种质螺旋藻的红外光谱，测量时扫描次数为128次，测量范围900-4000cm^-1，分辨率4cm^-1；

s2、红外光谱处理：利用brukeropus6.5软件将步骤s1所得红外光谱进行预处理，对预处理后的红外光谱求二阶导数得到二阶导数红外光谱，在二阶导数红外光谱中选取特征光谱数据利用eigenvector软件进行主成分分析；

s3、聚类分析：选取步骤s2主成分分析所得主成分特征值中作为不同种质螺旋藻的定类变量，基于所述定类变量利用偏最小二乘法将螺旋藻按照铜离子吸附容量的不同聚成不同类别。

实施例2

一种对铜离子不同吸附容量的螺旋藻快速鉴别方法，包括如下步骤：

s1、采集红外光谱：将螺旋藻粉与蒸馏水混合制得悬浮液，取50μl悬浮液涂于baf2红外基底上，在50℃条件下烘干过夜，利用nicolet380(thermoscientific)红外光谱仪采集不同种质螺旋藻的红外光谱，测量时扫描次数为128次，测量范围900-4000cm^-1，分辨率4cm^-1；

s2、红外光谱处理：利用brukeropus6.5软件将步骤s1所得红外光谱进行预处理，对预处理后的红外光谱求二阶导数得到二阶导数红外光谱，在二阶导数红外光谱中选取波数为900-1200cm^-1特征光谱数据利用eigenvector软件进行主成分分析；

s3、聚类分析：选取步骤s2主成分分析所得主成分特征值中可信度排名前3个主成分特征值pc1、pc2和pc3作为不同种质螺旋藻的三维坐标值作三维聚类图；

螺旋藻粉制备的具体操作为：将螺旋藻按照10％的比例接种于无菌的z氏培养基进行培养，培养条件为：3000lx光照条件，30±1℃，12h/12h的光暗周期于光照培养箱中进行培养，每天手摇2-3次，至藻体生长到稳定期，取藻液离心10min，离心转速为10000rpm，弃上清，保留沉淀得到藻体，用去离子水离心洗涤藻体，将藻体置于60℃下干燥，然后研磨成均匀，过120目筛子得到螺旋藻粉；

不同种质螺旋藻的傅里叶转换红外光谱图如图2所示，不同种质螺旋藻二阶导数处理后的二阶导数红外光谱图如图3所示；本实施例以波数为900-1200cm^-1作为特征光谱的得到的三维聚类图如图1所示；

按照双环己酮草酰二腙法测定本实施例中不同种质螺旋藻样品的铜离子的吸附容量，具体操作为：(1)取一组比色管分别加入不同浓度的铜标准溶液，加入0.7ml柠檬酸铵水溶液、0.5ml的氨水-氯化铵缓冲溶液、0.1ml乙醛、1.1ml双环己酮草酰二腙醇溶液(bco)，用蒸馏水稀释至5ml，用漩涡混合器混合10min，在545nm处的测定吸光度，绘制铜离子浓度标准曲线；(2)铜离子的吸附实验中分别称取0.04g不同种质的螺旋藻藻粉，溶于40ml的ph为6、浓度为100mg/l的cuso4水溶液，摇床振荡12h后12000rpm离心取上清溶液得到螺旋藻吸附铜离子待测液，按照制备铜离子浓度标准曲线操作测定螺旋藻吸附铜离子待测液；(3)对照铜离子浓度标准曲线得到螺旋藻吸附铜离子待测液中铜离子浓度，并计算不同种质螺旋藻对铜离子的吸附容量，得到的不同种质螺旋藻的铜离子吸附容量曲线如图4所示；

比较图4和图1可知，实施例1所述对铜离子不同吸附容量的螺旋藻快速鉴别方法的聚类结果与螺旋藻的铜离子吸附容量相吻合，证明本发明鉴别方法能够有效地将不同螺旋藻按照其铜离子吸附容量的差异进行区分，且图1吸附容量曲线中吸附容量排名前4种螺旋藻rh44、xs58、ah53、rz22和吸附容量排名后5种螺旋藻hs7、rn3、ws47、yh46、an8(前4类的吸附容量大于后5种)在图1中的三维分类图中存在明显的分界，说明本发明选用定类特征变量能够有效将铜离子吸附容量高的种质螺旋藻筛选出来。

对照例1

一种不同种质螺旋藻鉴别方法，包括如下步骤：

s1、采集红外光谱：将螺旋藻粉与蒸馏水混合制得悬浮液，取50μl悬浮液涂于baf2红外基底上，在50℃条件下烘干过夜，利用nicolet380(thermoscientific)红外光谱仪采集不同种质螺旋藻的红外光谱，测量时扫描次数为128次，测量范围900-4000cm^-1，分辨率4cm^-1；

s2、红外光谱处理：利用brukeropus6.5软件将步骤s1所得红外光谱进行预处理，对预处理后的红外光谱求二阶导数得到二阶导数红外光谱，在二阶导数红外光谱中选取波数为2800-3000cm^-1特征光谱数据利用eigenvector软件进行主成分分析；

s3、聚类分析：选取步骤s2主成分分析所得主成分特征值中可信度排名前3个主成分特征值pc1、pc2和pc3作为不同种质螺旋藻的三维坐标值作三维聚类图；

螺旋藻粉制备的具体操作为：将螺旋藻按照10％的比例接种于无菌的z氏培养基进行培养，培养条件为：3000lx光照条件，30±1℃，12h/12h的光暗周期于光照培养箱中进行培养，每天手摇2-3次，至藻体生长到稳定期，取藻液离心10min，离心转速为10000rpm，弃上清，保留沉淀得到藻体，用去离子水离心洗涤藻体，将藻体置于60℃下干燥，然后研磨成均匀，过120目筛子得到螺旋藻粉。

对照例2

一种不同种质螺旋藻的鉴别方法，包括如下步骤：

s1、采集红外光谱：将螺旋藻粉与蒸馏水混合制得悬浮液，取50μl悬浮液涂于baf2红外基底上，在50℃条件下烘干过夜，利用nicolet380(thermoscientific)红外光谱仪采集不同种质螺旋藻的红外光谱，测量时扫描次数为128次，测量范围900-4000cm^-1，分辨率4cm^-1；

s2、红外光谱处理：利用brukeropus6.5软件将步骤s1所得红外光谱进行预处理，对预处理后的红外光谱求二阶导数得到二阶导数红外光谱，在二阶导数红外光谱中选取波数为1500-1700cm^-1特征光谱数据利用eigenvector软件进行主成分分析；

s3、聚类分析：选取步骤s2主成分分析所得主成分特征值中可信度排名前3个主成分特征值pc1、pc2和pc3作为不同种质螺旋藻的三维坐标值作三维聚类图；

螺旋藻粉制备的具体操作为：将螺旋藻按照10％的比例接种于无菌的z氏培养基进行培养，培养条件为：3000lx光照条件，30±1℃，12h/12h的光暗周期于光照培养箱中进行培养，每天手摇2-3次，至藻体生长到稳定期，取藻液离心10min，离心转速为10000rpm，弃上清，保留沉淀得到藻体，用去离子水离心洗涤藻体，将藻体置于60℃下干燥，然后研磨成均匀，过120目筛子得到螺旋藻粉。

对照例3

一种不同种质的螺旋藻鉴别方法，包括如下步骤：

s1、采集红外光谱：将螺旋藻粉与蒸馏水混合制得悬浮液，取50μl悬浮液涂于baf2红外基底上，在50℃条件下烘干过夜，利用nicolet380(thermoscientific)红外光谱仪采集不同种质螺旋藻的红外光谱，测量时扫描次数为128次，测量范围900-4000cm^-1，分辨率4cm^-1；

s2、红外光谱处理：利用brukeropus6.5软件将步骤s1所得红外光谱进行预处理，对预处理后的红外光谱求二阶导数得到二阶导数红外光谱，在二阶导数红外光谱中选取波数为全谱段900-4000cm^-1特征光谱数据利用eigenvector软件进行主成分分析；

s3、聚类分析：选取步骤s2主成分分析所得主成分特征值中可信度排名前3个主成分特征值pc1、pc2和pc3作为不同种质螺旋藻的三维坐标值作三维聚类图；

螺旋藻粉制备的具体操作为：将螺旋藻按照10％的比例接种于无菌的z氏培养基进行培养，培养条件为：3000lx光照条件，30±1℃，12h/12h的光暗周期于光照培养箱中进行培养，每天手摇2-3次，至藻体生长到稳定期，取藻液离心10min，离心转速为10000rpm，弃上清，保留沉淀得到藻体，用去离子水离心洗涤藻体，将藻体置于60℃下干燥，然后研磨成均匀，过120目筛子得到螺旋藻粉。

对照例1、对照例2、对照例3所述不同种质螺旋藻鉴别方法所得三维聚类图分别为图5、图6、图7所示，比较可知，特征光谱的波数范围为2800-3000cm^-1(对照例1)、1500-1700cm^-1(对照例2)和全谱段900-4000cm^-1(对照例3)不能很好地将不同螺旋藻进行区分，相应的实施例1中以900-1200cm^-1波段可以获得很好的聚类效果，能够准确地对不同铜离子吸附容量的螺旋藻进行鉴别。另外，基于生物学分析可知，2800-3000cm^-1主要归属于藻细胞中的脂类和类胡萝卜素，1500-1700cm^-1主要归属于蛋白质的酰胺i和酰胺ii，而1200-900cm^-1主要归属细胞成分中多糖，由于螺旋藻对铜离子的吸附位点主要与细胞壁中的多糖活性基团有关，这也说明本发明中选取1200-900cm^-1用于区分不同铜离子吸附容量螺旋藻种质的合理性。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。