赶黄草总黄酮含量测定方法与流程

本发明属于中药质量控制领域，涉及一种赶黄草及其不同部位总黄酮的含量测定方法。

二、背景技术

赶黄草是虎耳草科扯根菜属植物扯根菜penthorumchinensepursh.的干燥地上部分，为苗族民间草药，主产于四川、贵州、湖南等地，为泸州古蔺道地药材。赶黄草又名扯根菜、水泽兰、水杨柳、山黄鳝。赶黄草性平、味苦、微辛、无毒、归肝、肾经。具有清热解毒、退黄化湿、活血散瘀、利水消肿之功效，广泛用于治疗各型肝炎、胆囊炎、脂肪肝等。

赶黄草含黄酮类、木脂素类、香豆素类、苯乙酮类、鞣质类、三萜类、有机酸类、酯类和挥发油等化学成分，其中以黄酮类化合物居多，是其主要成分，也是其功效成分。赶黄草中的黄酮类化合物主要由乔松素及其苷、槲皮素及其苷、山奈酚及其苷、柚皮素及其苷等组成。赶黄草总黄酮具有抗氧化、抗肝纤维化、缓解体力疲劳、治疗酒精性肝损伤和非酒精性脂肪肝等作用。

目前虽有赶黄草总黄酮的含量测定报道，但都是以芦丁为对照，以nano2-al(no3)3-naoh显色，利用可见分光光度法，在510nm处测定吸光度，再通过芦丁标准曲线计算赶黄草总黄酮的含量(1.中国实验方剂学杂志，2012，18(18)：38-41；2.吉林畜牧兽医，2018，39(6)：5-9；3.泸州医学院学报，2010，33(4)：370-372)，该方法中赶黄草总黄酮的吸收光谱图与芦丁存在极大差异，而且最大吸收波长也不一致(图1)，因而其合理性及测定结果准确性有待商榷。

为使赶黄草总黄酮含量测定更具合理及结果更准确，本发明以乔松素(或其7位羟基衍生物)为对照，以alcl3显色，利用紫外分光光度法建立赶黄草总黄酮含量测定方法。并对赶黄草(含茎、叶、花，下同)及其茎、叶、花等不同部位的总黄酮含量进行测定并比较，旨在为赶黄草合理开发和综合利用提供依据。

三、

技术实现要素：

本发明旨在建立一种合理测定赶黄草总黄酮的含量方法。本发明方法简便，准确，重复性好，为赶黄草及其不同部位质量控制提供了依据。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

1.对照品溶液的配制精密称取乔松素(或其7位羟基衍生物)对照品12.5mg，加甲醇溶解，转移至25ml容量瓶中，甲醇定容，即得浓度为0.5mg·ml^-1的对照品溶液。

2.供试品溶液的制备精密称取待检药材约1g至25ml圆底烧瓶中，加入10ml的55％乙醇溶液，加热回流提取3次，每次1.5h，过滤，合并滤液，减压浓缩，真空干燥得赶黄草提取物。提取物精密称定，以甲醇溶解后，转移至50ml容量瓶，加甲醇定容，即得供试品溶液。

3.标准曲线的绘制分别精密移取乔松素(或其7位羟基衍生物)对照品溶液0.0，0.2，0.4，0.8，1.2，1.6，2.0ml于10ml容量瓶中，加入1ml的1％三氯化铝甲醇溶液，甲醇定容至刻度，室温放置10min，于310nm处测其吸光度，以浓度c(mg·ml)为横坐标，吸光度a为纵坐标，绘制标准曲线，进行线性回归分析。

4.赶黄草及其不同部位总黄酮含量测定

精密移取供试品1ml于10ml容量瓶中，加入4ml的1％三氯化铝甲醇溶液，甲醇定容至刻度，室温放置10min。采用紫外分光光度法，于310nm处测其吸光度，根据标准曲线计算样品中总黄酮的含量。

以本发明测定赶黄草总黄酮含量，具有如下优势和进步：

1.与文献测定赶黄草总黄酮含量方法比较，本发明采用的方法更具合理性，测定结果更准确。文献都以芦丁为对照，以nano2-al(no3)3-naoh显色，采用可见分光光度法测定赶黄草总黄酮的含量，但由于赶黄草总黄酮的吸收光谱图与芦丁存在极大差异，而且最大吸收波长也不一致(图1)，因而其合理性及测定结果准确性有待商榷。本发明以乔松素为优选对照品，1％alcl3显色，采用紫外分光光度法测定，乔松素的吸收光谱图和赶黄草总黄酮基本相似，且都在310nm处有最大吸收(图2)，因此本发明更具合理性，测定结果更准确。

2.本发明通过对赶黄草及其茎、叶、花等不同部位总黄酮含量的测定比较，发现赶黄草及其不同部位总黄酮含量差别较大，赶黄草花的总黄酮含量最高，其次为赶黄草，再其次为叶，最低的为茎。因此确定了花期为最佳采收期，工业加工赶黄草应该重视叶和花的比例。如在流通或使用过程中，已将赶黄草粉碎，或已弃去花和叶，从外观无从辨认药材采收期的时候，即可采用本发明检测方法对药材的总黄酮含量进行对比，以便确认所使用药材采收时期是否合理，品质是否较好，这就为该药材合理开发利用及质量控制提供可借鉴的科学依据。

四、附图说明

图1为芦丁及赶黄草总黄酮吸收光谱图

图中：1.芦丁2.赶黄草总黄酮

图2为乔松素及赶黄草总黄酮吸收光谱图

图中：1.乔松素2.赶黄草总黄酮

五、具体实施方式

现结合实施实例和附图对本发明做进一步详细说明。实施例仅限于说明本发明，而非对本发明的限制。

实施例1

1.仪器与试药

1.1试验材料赶黄草及其茎、叶、花山古蔺宏安药业有限公司提供，经西南医科大学税丕先教授鉴定为赶黄草(penthorumchinensepursh.)及其茎、叶、花。使用前置于60℃烘箱中烘干至恒重，粉碎过四号筛，得赶黄草及其各部位粗粉。芦丁标准品(批号：153-18-4，贵州迪大生物有限公司)；乔松素标准品(批号：480-39-7，成都普思生物科技股份有限公司)；三氯化铝、甲醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠均为分析纯，水为超纯水。

1.2主要仪器设备shimadzu2450型紫外可见分光光度计，日本岛津公司；hh-w三用恒温水箱，江苏省金坛市医疗仪器厂；十万分之一分析天平，梅特勒-托利多仪器有限公司；uph-1-20l超纯水系统，优普系列纯水器。

2.方法与结果

2.1溶液配制

2.1.1对照品溶液的配制精密称取乔松素12.5mg，加甲醇溶解，转移至25ml容量瓶中，甲醇定容，即得浓度为0.5mg·ml^-1的乔松素对照品溶液。

2.1.2供试品溶液的制备分别精密称取赶黄草及其茎、叶、花干品粉末各约1g至25ml圆底烧瓶中，加入10ml的55％乙醇溶液，加热回流提取3次，每次1.5h，过滤，合并滤液，减压浓缩，真空于燥得赶黄草提取物。提取物精密称定，以甲醇溶解后，转移至50ml容量瓶，加甲醇定容，即得供试品溶液。

2.2标准曲线的绘制分别精密移取乔松素对照品溶液0，0.2，0.4，0.8，1.2，1.6，2.0ml于10ml容量瓶中，加入4ml的1％三氯化铝甲醇溶液，甲醇定容至刻度，室温放置10min，于310nm处测其吸光度，以浓度c(mg/ml)为横坐标，吸光度a为纵坐标，绘制标准曲线，进行线性回归分析。其标准曲线的回归方程为：a＝8.6331c+0.004，相关系数r＝0.9999，表明乔松素在0～0.1mg·ml^-1浓度范围内线性关系良好。

2.3样品测定精密移取供试品1ml于10ml容量瓶中，加入4ml的1％三氯化铝甲醇溶液，甲醇定容至刻度，室温放置10min，于310nm处测其吸光度，根据标准曲线计算样品中总黄酮的含量。

2.4方法学考察

2.4.1精密度实验精密移取乔松素对照品溶液1ml于10ml容量瓶中，加入4ml的1％三氯化铝甲醇溶液，甲醇定容至刻度，室温放置10min，于310nm处测其吸光度，连续测6次，rsd为0.07％，结果表明仪器精密度良好。

2.4.2稳定性实验精密移取赶黄草茎样品溶液1ml于10ml容量瓶中，按照“2.3”项的操作方法于0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0h测定其吸光度，rsd为0.38％，结果表明供试品溶液在3.0h内稳定性良好。

2.4.3重复性试验取赶黄草茎6份，各约1g，精密称定，按“2.1.2”项制备供试品溶液，按“2.3”项操作并测定其吸光度，rsd为1.23％，表明方法重复性良好。

2.4.4加样回收试验取已知含量(总黄酮含量为2.47％)的赶黄草茎粗粉约0.5g，共9份，精密称定。分别按已知总黄酮含量的80，100和120％的3个水平加入乔松素对照品，按“2.1.2”项下的方法制备供试液，按“2.3”项操作并测定其吸光度，根据标准曲线计算总黄酮含量。以测定值与供试品中总黄酮含量的差值，除以加入对照品的量计算加样回收率，加样平均回收率为98.93％，相对标准偏差rsd为2.45％，结果见表1。

表1加样回收试验测定结果

2.5不同部位赶黄草中总黄酮的含量测定

精密称取赶黄草及其茎、叶、花粗粉约1g，各3份，按“2.1.2”项下的方法制备供试液，按“2.3”项操作并测定其吸光度，根据标准曲线计算总黄酮含量，结果见表2。赶黄草及其茎、叶、花中总黄酮含量分别为3.61，2.47，8.90和11.3％。

表2赶黄草及其不同部位赶黄草中总黄酮的含量(n＝3)

3.分析与讨论

赶黄草总黄酮的含量测定，几乎都以芦丁为对照，以nano2-al(no3)3-naoh显色，采用可见分光光度法测定，但由于赶黄草总黄酮的吸收光谱图与芦丁存在极大差异，而且最大吸收波长也不一致，因而其合理性及结果准确性有待商榷。而本实施例以乔松素做对照品，1％alcl3显色，采用紫外分光光度法测定，乔松素的吸收光谱图和赶黄草总黄酮基本相似，且都在310nm处有最大吸收，因此本实施例更具合理性以及测定结果更具准确性。

本实施例对赶黄草及其茎、叶、花以料液比1∶10(g/ml)的55％的乙醇加热回流提取3次，每次提取1.5h。经检测，赶黄草及其茎、叶、花中总黄酮含量分别为3.61，2.47，8.90和11.28％。赶黄草及其不同部位总黄酮含量差别较大，赶黄草花的总黄酮含量最高，其次为赶黄草，再其次为叶，最低的为茎。因此确定了花期为最佳采收期，工业加工赶黄草应该重视叶和花的比例。如在流通或使用过程中，已将赶黄草粉碎，或已弃去花和叶，从外观无从辨认药材采收期的时候，即可采用本发明检测方法对药材的总黄酮含量进行对比，以便确认所使用药材采收时期是否合理，品质是否较好，这就为该药材合理开发利用及质量控制提供可借鉴的科学依据。