测定醋酸阿托西班有关物质的方法与流程

本发明涉及化学分析领域，具体而言，涉及一种测定醋酸阿托西班有关物质的方法。

背景技术：

阿托西班作为目前欧洲药物总署批准用于治疗早产的唯一具有子宫特异性的宫缩抑制剂，其作用机制是与催产素竞争子宫肌层、蜕膜、胎膜上的催产素受体，减少催产素的功效，减少肌细胞上的钙离子水平，从而抑制子宫收缩。阿托西班在生产及储存过程中，易产生杂质，而杂质易引起过敏反应、毒性及其他不良反应，但是现有技术中没有对醋酸阿托西班的杂质的分析鉴定方法。

技术实现要素：

本发明提供了一种测定醋酸阿托西班有关物质的方法，其能快速、有效地分离并检测出醋酸阿托西班原料药和注射液中的有关物质。

本发明是这样实现的：

一种测定醋酸阿托西班有关物质的方法，包括以下步骤：

采用球状蛋白亲水改性硅胶为色谱柱填料并对供试品溶液进行上样，而后利用溶液呈酸性的流动相a和有机溶剂为流动相b进行洗脱后进行检测；

其中，洗脱时流动相a和流动相b以体积为60-90：10-40的比例进行洗脱。

本发明的有益效果是：本发明的测定醋酸阿托西班有关物质的方法，选择球状蛋白亲水改性硅胶和溶液呈酸性的流动相a和有机溶剂为流动相b便于醋酸阿托西班有关物质的分离和洗脱，充分揭示了醋酸阿托西班的杂质，能够快速检测醋酸阿托西班有关物质提高产品的安全性，该方法科学、可靠，可控醋酸阿托西班有关物质。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，以下将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为本发明实施例1提供的含有已知杂质的阿托西班的标准品的hplc图谱；

图2为本发明实施例1提供的检测样品结果的hplc图谱；

图3为本发明实施例2提供的检测样品结果的hplc图谱；

图4为本发明实施例3提供的检测样品结果的hplc图谱；

图5为本发明实施例4提供的检测样品结果的hplc图谱；

图6为本发明实施例5提供的检测样品结果的hplc图谱；

图7为本发明灵敏度测试的检测限色谱图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

下面对本发明实施例的测定醋酸阿托西班有关物质的方法进行具体说明。

醋酸阿托西班的分子量为994.19，在醋酸阿托西班生产或者存放的过程中，受到光照、温度、湿度或者酸碱等影响，使得醋酸阿托西班发生聚合反应，得到二聚体或者多聚体，但是得到的聚合物具体的结构无法确定，也无法确定聚合物的分子量，或者聚合物的种类，不利于醋酸阿托西班的鉴定。因此，本发明提供测定醋酸阿托西班有关物质的方法，可以有效对醋酸阿托西班进行分离鉴定。

一种测定醋酸阿托西班有关物质的方法，包括以下步骤：

s1、配置供试品溶液；

将待测样品溶解在混合溶液中得到的供试品溶液，其中，供试品溶液的质量百分数为0.7-1.8mg/ml，优选，为1-1.5mg/ml。供试品溶液采用上述质量百分数能够便于溶液内的各个物质分离，便于后续洗脱得到不同分子量的聚合物和阿托西班。

进一步地，待测样品是阿托西班经过强酸、强光、强碱、高温加热发生强降解反应后自制的待测样品，通过该强降解反应，模拟阿托西班变质的过程，而后可以用于检测分离。

混合溶液是流动相a和所述流动相b按照体积比为60-90:10-40的比例混合后制备得到的溶液。混合溶液与洗脱时的溶剂一致，可以减小溶剂峰，排除溶剂峰对杂质检出的干扰。

s2、洗脱和检测；

采用球状蛋白亲水改性硅胶为色谱柱填料并将其填充进色谱柱内，球状蛋白亲水改性硅胶是硅胶微球表面键合亲水性聚合物以及亲水性二醇基官能团，使得其对不同分子量的高分子聚合物有不同的吸附效果，同时具有良好的稳定性。

进一步地，采用的球状蛋白亲水改性硅胶的分子量为1000-10000，由于醋酸阿托西班的分子量为994.19，阿托西班的二聚体的分子量约在2000左右，而阿托西班的其他多聚物或高分子杂质的分子量也在3000-6000之间，有些聚合物的分子量可达到10000，因此采用上述分子量的球状蛋白亲水改性硅胶能够对醋酸阿托西班以及其聚合物进行良好的分离，更具有专属性。若选择其他分子量更高的硅胶，不能对醋酸阿托西班以及其聚合物进行良好的分离，继而影响检测效果。

上样完成后利用溶液呈酸性的流动相a和有机溶剂为流动相b进行洗脱，洗脱时流动相a和流动相b以体积为60-90：10-40的比例进行洗脱。在该范围内对阿托西班中的聚合物与高分子杂质与阿托西班主成分的分离效果更好，均能满足分离度大于1.5的要求，且各成分的峰形较好，理论板数也高。对阿托西班中的聚合物与高分子杂质的能够得到更有效的控制与检测。当流动相组分或比例不在以上范围内，则阿托西班中的聚合物与高分子杂质与阿托西班不能完全分离，且各成分的峰形较差，理论板数较低。无法有效的控制和检测其聚合物。

进一步地，流动相a为ph为2.0-5.0的强碱弱酸盐或者在水溶液中不完全电离的酸。

进一步地，强碱弱酸盐为强碱弱酸盐缓冲溶液；

优选，0.01-1mol/ml磷酸盐缓冲液或者0.01-1mol/ml醋酸盐溶液；

在水溶液中不完全电离的酸为一元酸或者多元酸；

优选，所述一元酸为质量百分数为1.0～5.0％冰醋酸或者0.01～2.0％三氟乙酸，所述多元酸为0.01～2.0％磷酸。

采用上述酸性溶液，基线噪音小，有利于杂质的检出。而利用枸橼酸缓冲盐或者其他溶剂作为流动相a则容易造成基限噪音大，不利于杂质的检出。同时，采用上述酸性溶液可以快速浸润固定相表面，继而使得各物质间分离良好，各峰理论塔板数较高。

进一步地，流动相b为氰类溶剂或者醇类溶剂，

优选，所述氰类溶剂为乙腈，所述醇类溶剂为一元醇溶剂，更优选为甲醇或者异丙醇。

采用上述流动相b与流动相a组分进行混合分析时，色谱系统易容易平衡，稳定性较好，色谱柱的压力较低，对阿托西班中的聚合物与高分子杂质与阿托西班主成分的分离效果更好，均能满足分离度大于1.5的要求，且各成分的峰形较好，理论板数也高。对阿托西班中的聚合物与高分子杂质的能够得到更快速的、有效的控制与检测的同时，还能够保护色谱柱，延长色谱柱的使用寿命。如果采用其他有机溶剂，则会导致色谱系统难于平衡，甚至无法达到平衡，尤其是色谱柱本身对有机溶剂有一定选择性，因此对色谱柱具有一定的损害，因而选择甲醇或乙腈或异丙醇为流动相b是非常重要的。

进一步地，在进行测试过程中，本发明还增设了保护柱，采用tsk-gelguardcolummswxl保护柱，采用的填料技术与检测用色谱柱相一致，保护柱不仅对样品检测不会产生影响，而且在样品分析量大时，避免伤柱子，延长色谱柱的寿命，保证了检测数据的准确性与重现性的同时，也降低了色谱柱损耗的成本。

同时利用高效液相分析进行检测，检测波长为210-230nm。利用高效液相分析进行检测时流速为0.4-1.1ml/min，柱温为20～40℃，进样量为20μl。

s3、参照图谱；

进一步地，醋酸阿托西班内聚合物的结构不能确定，其分子量等信息也不能确定，因此本发明实施例通过设置参照图谱，便于快速找到高分子杂质的分子量。

具体地，在对所述供试品溶液进行检测前，利用含有已知杂质的阿托西班的标准品进行分析，得到参照图谱；对含有已知杂质的阿托西班的标准品的检测操作与本发明实施例s1和s2的操作一致，而后得到参照图谱。

而后将待测样品检测得到的检测图谱与参照图谱进行对比，继而判定供试品溶液内聚合物的分子量。

进一步地，已知杂质包括多个杂质，且多个所述杂质的分子量均为1500-6000。

进一步地，多个所述杂质为人胰岛素、胸腺肽α1和生长抑素中的任意一种。采用上述物质作为参照杂质，可以更快速更便捷的对阿托西班的标准品进行检测，且也更利于判定聚合物的分子量。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

本实施例提供一种测定醋酸阿托西班有关物质的方法，包括以下步骤：

称取醋酸阿托西班(进行了强降解实验后的醋酸阿托西班)，加混合溶液溶解并稀释制成每1ml中含醋酸阿托西班1.0mg的溶液，作为供试品溶液；精密量取供试品溶液适量，用混合溶液稀释制成每1ml中含醋酸阿托西班10μg的溶液，作为进样溶液。进样并记录色谱图。

分别取人胰岛素(分子量5808)对照品、胸腺肽α1(分子量3108)对照品、生长抑素(分子量1638)对照品和醋酸阿托西班对照品，分别加混合溶液溶解并稀释制成每lml中含人胰岛素、胸腺肽α1、生长抑素均为100μg/ml以及阿托西班1mg/ml的溶液即得到含有已知杂质的阿托西班的标准品。

其中，混合溶液中流动相a和流动相b的比例为90:10，流动相a为质量百分数为5.0％冰醋酸，流动相b为乙腈。

采用球状蛋白亲水改性硅胶为色谱柱填料并将其填充进色谱柱内即得tosohtsk-gelg2000swxl色谱柱，采用的球状蛋白亲水改性硅胶的分子量为1000-10000，而后分别对供试品溶液含有已知杂质的阿托西班的标准品进行上样和洗脱。其中流动相a为质量百分数为5.0％冰醋酸，流动相b为乙腈，流动相a和流动相b的比例为90:10；柱温为20～40℃；流速：1.0ml/min，进样量为20μl。检测结果参见图1和图2。

同时，在检测时，利用tsk-gelguardcolummswxl柱为保护柱，采用的填料技术与检测用色谱柱相一致。

根据图1和图2可知，聚合物与高分子杂质均在阿托西班峰之前出峰，并且均能够和阿托西班主峰达到基线分离，专属性强。同时，对比图1和图2可知，聚合物的分子量大概是2000。

实施例2-5

实施例2-5提供的测定醋酸阿托西班有关物质的方法与实施例1的操作基本一致，区别在于操作条件发生变化。

实施例2：色谱条件：供试品溶液的质量百分数为1.5mg/ml，流动相a和流动相b的体积比为80:20，流动相a为ph为2.0的1mol/ml磷酸盐溶液，流动相b为甲醇，流速为1.1ml/min，柱温为21～37℃；检测波长为225nm。

实施例3：色谱条件：供试品溶液的质量百分数为1.8mg/ml，流动相a和流动相b的体积比为60:40，流动相a为2.0％磷酸，流动相b为异丙醇，流速为0.5ml/min，柱温为30～39℃；检测波长为230nm。

实施例4：色谱条件：供试品溶液的质量百分数为0.7mg/ml，流动相a和流动相b的体积比为75:25，流动相a为ph为5.0的0.01mol/ml醋酸盐缓冲液，流动相b为甲醇，流速为0.8ml/min，柱温为22～29℃；检测波长为215nm。

实施例5：色谱条件：供试品溶液的质量百分数为1.0mg/ml，流动相a和流动相b的体积比为70:30，流动相a为0.01％三氟乙酸，流动相b为乙腈，流速为0.4ml/min，柱温为28～30℃；检测波长为220nm。

实施例2-实施例5的检测图谱参见图3-6，对比图3和图1可知，聚合物的分子量约为2000，对比图4和图1可知，聚合物的分子量约为4000，对比图5和图1可知，聚合物的分子量约为4500，对比图6和图1可知，聚合物的分子量约为2000。

灵敏度测试

将待测样品加入混合溶液稀释后，取20μl注入液相色谱仪，记录色谱图，直至主峰峰高为基线噪音的10倍，而后测得定量限约为2ng，结果参见图7。

本发明实施例提供的供试品浓度为1.0mg/ml，定量限为0.05μg/ml，定量限约为供试品浓度的0.005％，都低于报告限度0.05％，杂质灵敏度较高，说明本发明提供的色谱条件具有较高的灵敏度。

综上所述，本发明的测定醋酸阿托西班有关物质的方法，选择球状蛋白亲水改性硅胶和溶液呈酸性的流动相a和有机溶剂为流动相b便于醋酸阿托西班有关物质的分离和洗脱，充分揭示了醋酸阿托西班的杂质，能够快速检测醋酸阿托西班有关物质提高产品的安全性，该方法科学、可靠，可控醋酸阿托西班有关物质。

以上所述仅为本发明的优选实施方式而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。