一种基于双衍生化技术的游离脂肪酸质谱定性定量分析方法与流程

本发明涉及一种基于双衍生化技术的游离脂肪酸质谱定性定量分析方法，以及其在不同生物样本中游离脂肪酸定性定量分析中的应用。

技术背景

脂肪酸(fattyacid，fa)是指一端含有一个羧基的长脂肪族碳氢链的一系列有机物，碳链长度不等(c4～c36)，按是否含有双键分为饱和和不饱和脂肪酸。fa是最简单的一类脂质化合物，是其他脂质的重要组分。哺乳动物体内脂肪酸的多样性通过以下途径在细胞功能中发挥多种关键作用：例如组成生物膜中各种不同的功能脂质分子；调节膜的流动性和信号分子之间的相互作用，以及为脂质信号分子的产生提供多种前体物质。脂肪酸结构的多样性包括不同的链长、不同的不饱和度、不同的双键位置、是否存在氧化、支链和其他修饰结构。fa组成和结构的改变对膜功能、生物能量效率和细胞信号转导有很大的影响，从而对机体的营养与健康产生影响。

脂肪酸的双键位置与其功能密切相关，脂肪酸根据第一个双键距离甲基端的位置不同，可分为n-3、n-6、n-7和n-9等系列。n-3系列多不饱和脂肪酸(polyunsaturatedfattyacid，pufas)和n-6系列pufas在生物体内都发挥了很重要的作用，很多情况下，这两族pufas在功能上相互协调制约，共同调节生物体的生命活动。但这两族脂肪酸在很多功能上也存在差异，例如，n-6pufas能导致血小板凝集和血栓形成，而n-3pufas则有相反的作用。而且与n-6pufas相比，n-3pufas更能使胰岛素保持较高的敏感性，从而发挥更强的降血糖功能。越来越多的研究表明，脂肪酸的精准结构及其水平与糖、脂代谢异常及其他心血管病的危险因素，如肥胖、高血压等密切相关。游离脂肪酸代谢异常与胰岛素抵抗、高胰岛素血症、高血压、ii型糖尿病等疾病的发生发展相关。

衍生化技术(derivatization)是指待测样品与具有特定基团的衍生化试剂通过定量快速反应生成符合要求的衍生化物，然后通过检测衍生化物的量来间接测定待测样品的量。衍生化后能够改变待测物的检测特性，增加其对检测器的响应，并且能够生成稳定衍生化物改善待测物的不稳定性。同时，衍生化反应能提高选择性，衍生产物的质谱碎裂会高效生成能准确鉴定结构的碎片离子。衍生化技术可提高电离效率，减少复杂样品分析时的电离抑制，进而提高电喷雾质谱分析的灵敏度。衍生化技术适用于生物样品中带有目标官能团的代谢物的准确定性和定量分析。

脂肪酸双键位置的质谱鉴定方法有气相色谱串联质谱法，但该方法需要对样本进行复杂的衍生化反应，并且只能对1个双键进行准确鉴定。另外，还有臭氧解离、电子捕获解离等，这些方法需要改造质谱仪，加上特殊的装置才能发生反应；且谱图复杂繁琐，解谱困难，难以应用于分析复杂样本。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是针对上述现有技术的不足而提供一种基于双衍生化技术的游离脂肪酸质谱定性定量分析方法，解决了不饱和脂肪酸尤其是多不饱和脂肪酸的双键位置难以鉴定，在负离子模式下电离效率低和检测灵敏度不足的困难，实现了高灵敏度、准确的定性量分析。

本发明为解决上述提出的技术问题，所采用的技术方案为：

一种基于双衍生化技术的游离脂肪酸质谱定性定量分析方法，它包括如下步骤：

1)不饱和脂肪酸的光化学衍生化反应：将待测样品中加入内标，然后提取游离脂肪酸，得到游离脂肪酸提取液；所得游离脂肪酸提取液以丙酮作为paternò-büchi(p-b)反应试剂，在紫外光下进行光化学衍生化反应，得到初次衍生后的待测样品溶液；

2)脂肪酸的n，n-二乙基乙二胺衍生化反应：将步骤1)所得初次衍生后的待测样品溶液以n，n-二乙基乙二胺作为衍生试剂进行衍生化反应，得到二次衍生后的待测样品溶液；

3)采集数据：将步骤2)所得二次衍生后的待测样品溶液进行质谱分析，选择73da中性丢失扫描-增强离子扫描作为质谱扫描模式，采集游离脂肪酸衍生物的谱图和谱峰数据；

4)定性分析：根据步骤3)所得谱图和谱峰数据，确定对应各脂肪酸衍生物的准分子离子峰；同时对于存在双键位置异构体的不饱和脂肪酸，其所含双键的位置不同，其分别对应的衍生产物在质谱碰撞诱导解离中分别产生不同m/z的诊断离子，确定存在双键位置异构体的不饱和脂肪酸中所含双键的位置，从而对待测样品中的游离脂肪酸实现定性分析；

5)绘制标准曲线：a、选择脂肪酸标准品并用溶剂稀释成一系列浓度的标准溶液，分别加入内标后，在与步骤1)、步骤2)相同的条件下进行两次衍生化反应，得到标准样品的进样溶液；将标准样品的进样溶液按照与步骤3)相同的条件进行质谱分析，采集游离脂肪酸衍生物的谱图和谱峰数据；b、对存在双键位置异构体的不饱和脂肪酸，以标准溶液中不饱和脂肪酸双键位置异构体的浓度比值为横坐标，所对应二次衍生产物诊断离子的强度比值为纵坐标，建立诊断离子强度比值与不饱和脂肪酸浓度比值之间的标准曲线；

6)定量分析：由于p-b反应的产率并非100％，且每种不饱和脂肪酸的p-b衍生产率存在差异，因此，定量采用单独的deea反应方法减少方法的定量误差。而单独的deea反应产物也可采用与二次衍生相同的采集数据方式，根据步骤3)所得谱图中游离脂肪酸衍生物与内标衍生物的准分子离子峰强度比值，结合内标的浓度，对待测样品中的游离脂肪酸进行定量分析；待测样品中存在双键位置异构体的不饱和脂肪酸，根据内标定量得到异构体的总量，然后，根据所对应二次衍生产物的诊断离子强度比值，结合诊断离子强度比值与不饱和脂肪酸浓度比值之间的标准曲线，对待测样品中存在各个双键位置异构体进行定量分析。

按上述方案，所述待测样品为人细胞、血液和小鼠肝脏等生物样品。如动物(包括人)的体液(如尿、血、唾液、胆汁、胃液、淋巴液及生物体的其他分泌液等)、毛发、肌肉和一些组织器官(如胸腺、胰腺、肝、肺、脑、胃、肾等)等。

按上述方案，所述步骤5)中，选取生物样本中常见的脂肪酸的标准品。标准溶液为一种或几种游离脂肪酸的混合溶液，且所述标准溶液中游离脂肪酸的浓度范围在0～400nmol/l，内标的浓度范围在50-200nmol/l。

按上述方案，步骤1)将待测样品(即生物样品)中加入内标和pbs缓冲溶液，内标的终浓度为50-200nmol/l，经离心处理后丢弃水上层；然后加入dpbs缓冲溶液和甲醇，用盐酸酸化，最终盐酸浓度达到25mm；接着加入异辛烷后，离心分层后去上层，氮吹干；最后用丙酮与水的混合溶液复溶，加入色谱级乙醇后置于250-270nm紫外汞灯下发生p-b反应。

按上述方案，所述步骤2)中的衍生化反应中，添加衍生试剂n，n-二乙基乙二胺时，还需要加入2-氯-1-甲基吡啶鎓碘化物(2-chloro-1-methylpyridiniumiodide，cmpi)和三乙胺(triethylamine，tea)作为催化剂，反应温度40℃，反应时间10min。其中，在该衍生化体系中，衍生试剂n,n-二乙基乙二胺的浓度为1μmol/ml，催化剂三乙胺的浓度为0.6μmol/ml，催化剂2-氯-1-甲基吡啶鎓碘化物的浓度为1μmol/ml。

按上述方案，步骤2)所得二次衍生后的待测样品溶液和步骤5)所得标准样品的进样溶液一般经过干燥、复溶、纯化等预处理过程再进行质谱分析。

按上述方案，所述步骤3)中，质谱分析时，采用注射针泵进样，进样流速为5-30μl/min，其质谱分析条件为美国appliedbiosystems公司4000q-trap质谱检测器。电喷雾电离源(electrosprayionization，esi)：正离子模式；质谱扫描模式：73da中性丢失扫描(73daneutrallossscan)-增强离子扫描(enhancedproductionscan,epi)；离子源气体1(ionsourcegas1,gs1)：20psi；离子源气体2(ionsourcegas1，gs1)：20psi；碰撞能(collisionenergy，ce)：35ev-50ev；去簇电压(declusteringpotential，dp)：40ev；入口电压(entrancepotential，ep)：5v；碰撞室输出电压(collisioncellexitpotential，cxp)：10v；质量范围：200-650m/z。

本发明提出了一种基于双衍生化技术的脂肪酸的质谱分析方法，采用低压汞灯作为光源，以丙酮作为patenò-büchi(p-b)反应试剂进行p-b反应游离脂肪酸；反应后，丙酮分子加合到不饱和游离脂肪酸的c＝c上形成氧杂环丁烷；然后继续选择衍生试剂n，n-二乙基乙二胺(n，n-diethyl-1，2-ethanediamine，deea)标记游离脂肪酸，脂肪酸中的羧基与衍生试剂中的氨基发生酰胺化反应，引入一个易电离的正电荷基团[-nh2(ch2)2n(ch3)2]⁺，将带负电荷的脂肪酸转化为带正电荷的脂肪酸衍生化产物。质谱分析脂肪酸衍生化产物时，在碰撞诱导裂解(collisioninduceddissociation，cid)反应中，乙二胺基的c-n键极易断裂，产生一个m/z73的中性片段(nh-(ch2ch3)2)，因此使用质谱73da中性丢失扫描(73daneutrallossscan，nls73)模式，就可以得到脂肪酸衍生物的准分子离子质谱图，依据脂肪酸衍生物的准分子离子峰强度，可以实现简单快速游离脂肪酸的定性定量分析；此外，双衍生产物在cid下，可选择性地碎裂氧杂环丁烷，高效产生诊断离子，且诊断离子之间相差26da,从而快速准确地判断出不饱和脂肪酸的中所含双键的位置，用于不饱和脂肪酸的中所含双键的位置鉴定及双键位置异构体的定性定量分析。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

首先，本发明利用所建立的方法对实际样品中游离脂肪酸进行精准定性和定量分析，若单独使用光化学衍生化，只能对双键数目小于3的不饱和脂肪酸进行结构鉴定，且分析灵敏度低；而只使用n，n-二乙基乙二胺与脂肪酸发生酰胺化缩合，只能提高分析灵敏度，不能获取双键位置的准确信息。而本发明采用的二次衍生方法，可以增加诊断离子的峰强度，从而实现一次衍生pb反应无法实现的多个双键位置的判断。因此，本发明将两者有机结合解决了不饱和脂肪酸尤其是多不饱和脂肪酸的双键位置难以鉴定，以及脂肪酸在负离子模式下电离效率低和检测灵敏度不足的困难，实现了高灵敏度、准确的定性定量分析。

第二，针对多不饱和脂肪酸中双键数目大于3时，诊断离子谱图复杂，难以做到准确鉴定。本发明采用两种衍生化方法，首先是光化学衍生化方法使丙酮分子加到c＝c上形成氧杂环丁烷，这种反应具有方向性，会生成两种氧杂环丁烷；再使用n，n-二乙基乙二胺与脂肪酸发生酰胺化缩合，解决了原本在负离子模式下检测灵敏度不足的困难，成功地在正离子模式下检测到衍生化产物，并提高能鉴定双键位置的碎片的质谱响应，从而使诊断离子的质谱响应更高，诊断离子信息更丰富并具有特征性，谱图便于解析，可实现不饱和脂肪酸以及多不饱和脂肪酸的精准结构分析。

综上，本发明的方法操作简单，能够实现游离脂肪酸结构的精准定性，能够实现脂肪酸的高效、准确分析，并解决了游离脂肪酸在负离子模式下电离难、检测灵敏度不足等问题。

附图说明

图1(a)是质谱分析18种脂肪酸标准品((c17:1n-7、c18:3n-3、c18:3n-6、c18:2n-6、c18:1n-9、c18:1n-7、c20:1n-9、c20:2n-9、c20:3n-6、c20:4n-6、c20:5n-3、c22:1n-9、c22:6n-3、c24:1n-9)经n，n-二乙基乙二胺(n，n-diethyl-1，2-ethanediamine，deea)衍生产物的质谱73da中性丢失正离子模式(+nls73da)质谱图；

图1(b)为c18:1n-9和n-7异构体诊断离子强度与不饱和脂肪酸浓度比例之间的标准曲线。

图2是分析c18:1n-9经双衍生后产物的二级质谱图。

图3(a)、3(b)和3(c)分别是人胃癌细胞样品中游离脂肪酸衍生产物的质谱图、c18:1衍生产物的二级谱图和各游离脂肪酸含量图。

图4(a)、4(b)和4(c)分别是人血浆样品中游离脂肪酸衍生产物的质谱图、c18:1衍生产物的二级谱图和各游离脂肪酸含量图。。

图5(a)、5(b)和5(c)分别是小鼠肝脏中样品中游离脂肪酸衍生产物的质谱图、c18:1衍生产物的二级谱图和各游离脂肪酸含量图。

本发明中用到的脂肪酸缩写说明：

c14:0，肉豆蔻酸；c16:1n-7，棕榈油酸；c16:0，棕榈酸；c17:0，十七烷酸；c18:3n-3，α-亚麻酸；c18:3n-6，γ-亚麻酸；c18:2n-6，亚油酸；c18:1n-9，油酸；c18:1n-7，异油酸；c18:0，硬脂酸；c20:0，花生酸；c22:1n-9芥酸；c24:1n-9神经酸。

具体实施方式

为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换均属于本发明的范围。

下述实施例中，标准曲线的建立步骤如下：

1)配置标准液：将脂肪酸标准品分别用氯仿甲醇(2:1，v/v)配成10mg/ml的贮存溶液，然后用乙腈分别稀释到400nmol/l；分别取不同体积的400nmol/l脂肪酸标准品溶液，并加入25μl400nmol/l内标(internalstandard，is)c17:1n-7，氮吹干后，加入950μl丙酮/水(60/40，v/v)溶液，再加入50μl色谱级乙醇补足到总体积1ml和，涡旋10s混匀后，配成浓度分别为0.1nmol/l,0.5nmol/l,1nmol/l,3nmol/l,5nmol/l,10nmol/l,25nmol/l,50nmol/l,100nmol/l,150nmol/l,200nmol/l,400nmol/l的脂肪酸标准液；

2)不饱和脂肪酸的光化学衍生化反应

将上述各脂肪酸标准液在254nm低压汞灯下反应60min，p-b反应完成；

3)脂肪酸p-b反应产物的n，n-二乙基乙二胺衍生化反应：

脂肪酸经p-b反应后，加入50μl20μmol/ml的2-氯-1-甲基吡啶鎓碘化物(cmpi)和30μl20μmol/ml三乙胺(tea)，涡旋60s；然后再加入50μl20μmol/ml的衍生试剂n，n-二乙基乙二胺(deea)，40℃超声5min，衍生化反应完成；

衍生化反应后所得溶液用氮气吹干，然后用1ml的氯仿复溶，涡旋30s后，加入体积比为10:90:20的甲酸：水：氯仿溶液1ml，涡旋2min，弃上层溶剂；重复此操作5次，再氮气吹干，并用1ml的色谱纯乙腈复溶，然后经过2μm的有机相滤膜过滤，得到标准样品的进样溶液；

4)质谱分析以及建立标准曲线：

步骤3)中所得标准样品的进样溶液，注射针泵进样，进样流速为20μl/min，进行质谱分析，其质谱分析条件为美国appliedbiosystems公司4000q-trap质谱检测器。电喷雾电离源(electrosprayionization，esi)：正离子模式；质谱扫描模式：73da中性丢失扫描-增强离子扫描(epi)；离子源气体1(gs1)：20psi；离子源气体2(gs1)：20psi；碰撞能(ce)：35ev-50ev；去簇电压(dp)：40ev；入口电压(ep)：5v；碰撞室输出电压(cxp)：10v；质量范围：200-650m/z。

采集的游离脂肪酸衍生物的谱图和谱峰数据如图1(a)所示；并对存在双键位置异构体的不饱和脂肪酸，以标准溶液中不饱和脂肪酸双键位置异构体的浓度比值为横坐标，所对应衍生产物诊断离子的强度比值为纵坐标，建立诊断离子强度比值与不饱和脂肪酸浓度比值之间的标准曲线；如图1(b)所示，即为c18:1n-9和n-7异构体诊断离子强度与不饱和脂肪酸浓度比例之间的标准曲线。

采集的游离脂肪酸c18:1的衍生产物的二级谱图如图2所示，衍生产物的质荷比为439，在碰撞诱导裂解(collisioninduceddissociation，cid)反应中，乙二胺基的c-n键极易断裂，丢失m/z73的中性片段(nh-(ch2ch3)2)，产生质荷比为366.2的碎片，并且选择性地碎裂氧杂环丁烷，高效产生诊断离子(m/z198.1,224.1)，且诊断离子之间相差26da，从而快速准确地判断出不饱和脂肪酸的中所含双键的位置为c18:1n9。

实施例1人胃癌细胞中游离脂肪酸的定性和定量分析

一种基于双衍生化技术的人胃癌细胞中游离脂肪酸质谱定性定量分析方法，具体步骤如下：

1)取数量为一百万的细胞于16mm×125mm玻璃管中，加入150μl10μmol/l的c17:1(n-7)和1mlpbs，离心2分钟，3000转/分，后丢弃水上层；然后加入1mldpbs，再加入2ml甲醇，用盐酸酸化，盐酸最终浓度达到25mm；接着加入1ml异辛烷后，在3000转/分下离心1分钟，分层，将上层移至10mm×75mm玻璃管中，氮吹干；脂肪酸提取物用1ml丙酮:水(6:4)复溶后，取50μl稀释液氮吹干，最后用950μl丙酮:水(6:4)复溶，加入50μl乙醇，用于后续光化学衍生化反应和n，n-二乙基乙二胺衍生化反应。

2)按与获取上述标准曲线相同的步骤2)和步骤3)进行两次衍生反应，然后按照与步骤4)相同的条件进行质谱分析。

3)图3(a)、3(b)分别是人胃癌细胞样品中游离脂肪酸衍生产物的质谱图、c18:1衍生产物的二级谱图，用来确定人胃癌细胞样品中所含有的游离脂肪酸；然后，再结合图1(b)中给出了校准曲线，得到人胃癌细胞样品中各游离脂肪酸含量如图3(c)所示。

实施例2人血浆中游离脂肪酸的定性和定量分析

人血浆中游离脂肪酸的定性和定量分析：取10μl于16mm×125mm玻璃管中，加入150μl10μmol/l的c17:1(n-7),加入1mlpbs，离心2分钟，3000转/分，后丢弃水上层。在细胞中加入1mldpbs，然后加入2ml甲醇，用盐酸酸化，最终浓度达到25mm。加入1ml异辛烷后，将样品在3000转/分下离心1分钟，分层，将上层移至10mm×75mm玻璃管中,氮吹干，用于衍生化反应。脂肪酸提取物用1ml丙酮:水(6:4)复溶后，取50μl稀释液氮吹干，用950μl丙酮:水(6:4)复溶，加入50μl乙醇，用于后续光化学衍生化反应和n，n-二乙基乙二胺衍生化反应。

2)按与获取上述标准曲线相同的步骤2)和步骤3)进行两次衍生反应，然后按照与步骤4)相同的条件进行质谱分析。

3)图4(a)、4(b)分别是人血浆样品中游离脂肪酸衍生产物的质谱图、c18:1衍生产物的二级谱图，用来确定人血浆样品中所含有的游离脂肪酸；然后，再结合图1(b)中给出了校准曲线，得到人血浆样品中各游离脂肪酸含量如图4(c)所示。

实施例3小鼠肝脏中游离脂肪酸的定性和定量分析

小鼠肝脏中游离脂肪酸的定性和定量分析：取1mg于16mm×125mm玻璃管中，加入100μl40μmol/l的c17:1(n-7),加入1mlpbs，离心2分钟，3000转/分，后丢弃水上层。在细胞中加入1mldpbs，然后加入2ml甲醇，用盐酸酸化，最终浓度达到25mm。加入1ml异辛烷后，将样品在3000转/分下离心1分钟，分层，将上层移至10mm×75mm玻璃管中,氮吹干，用于衍生化反应。脂肪酸提取物用1ml丙酮:水(6:4)复溶后，取50μl稀释液氮吹干，用950μl丙酮:水(6:4)复溶，加入50μl乙醇，用于后续光化学衍生化反应和n，n-二乙基乙二胺衍生化反应。

2)按与获取上述标准曲线相同的步骤2)和步骤3)进行两次衍生反应，然后按照与步骤4)相同的条件进行质谱分析。

3)图5(a)、5(b)分别是小鼠肝脏中样品中游离脂肪酸衍生产物的质谱图、c18:1衍生产物的二级谱图，用来确定小鼠肝脏样品中所含有的游离脂肪酸；然后，再结合图1(b)中给出了校准曲线，得到小鼠肝脏样品中各游离脂肪酸含量如图5(c)所示。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干改进和变换，这些都属于本发明的保护范围。