贞芪扶正颗粒生产工艺中近红外定量校正模型的构建方法及检测方法与流程

本发明涉及近红外在线检测技术领域，特别涉及贞芪扶正颗粒生产工艺中近红外定量校正模型的构建方法及检测方法。

背景技术：

贞芪扶正由黄芪及女贞子两味药材，经加水煎煮三次、合并煎液，滤过、滤液浓缩，喷雾干燥，加辅料制成颗粒，干燥，分装，即得。贞芪扶正颗粒收载于《中药成方制剂》(第20册)，具有提高人体免疫力，保护骨髓及肾上腺皮质的功能。大量的药学研究和临床应用已经证明其可作为癌症辅助放化疗的“明星”药物。

目前贞芪扶正颗粒产业化生产过程中提取、浓缩环节主要依靠经验，通过固定提取时间或者浓缩时间确定操作终点，再结合高效液相色谱法进行样品处理及检测。

提取工艺是中药生产的关键环节，也是大多数中药制药过程的起点，直接关系到药材的利用率。目前，提取工艺的质量控制主要依靠经验和传统质量分析方法，缺乏有效的指标性成分含量实时监测手段。实际生产中提取时间往往是固定的，基本不考虑原料药材质量差异和工况波动导致的提取终点提前或滞后，易造成不同批次提取液质量的不稳定，导致中药药品批次间的质量差异，以及能源、时间的浪费，药材利用率的降低等。

提取液的浓缩过程是贞芪扶正颗粒生产的关键操作，通过浓缩可以去除大量提取溶剂，提高有效成分浓度，以利于后续的干燥、制粒等过程。另外女贞子中特女贞苷等环烯醚萜苷类不稳定，长时间加热会水解产生红景天苷。目前贞芪扶正颗粒浓缩液各质控指标的判断与测定主要依靠经验和传统的质量分析方法，要经过取样、送检、检测等环节，耗时费力，缺乏指标性成分含量实时监测手段，不利于提高生产效率和浓缩液成分的稳定性。

因此，提供一种贞芪扶正颗粒提取和浓缩过程近红外在线检测方法具有重要的现实意义。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明提供一种贞芪扶正颗粒生产工艺中近红外定量校正模型的构建方法及检测方法。该方法将近红外光谱分析技术引入中药生产的提取和浓缩过程，实现对各指标成分的实时监测以及提取、浓缩过程终点的快速判断，有利于提高中药提取、浓缩过程的质量控制水平，充分保证产品质量稳定、可靠。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种贞芪扶正颗粒生产工艺中近红外定量校正模型的构建方法，取贞芪扶正颗粒，以黄芪甲苷、红景天苷、特女贞苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷作为关键质控指标，分别经高效液相色谱检测和近红外光谱检测，获得相应的高效液相色谱检测结果和近红外光谱结果，经偏最小二乘法获得贞芪扶正颗粒生产工艺中近红外定量校正模型。

近红外(nir)光谱技术作为一种快速的过程分析技术，已经被成功应用于不同的分析领域，如食品、药物、石油等。近红外技术的广泛使用主要得益于其具有快速分析、样品处理简单、无需消耗试剂等特点，是一种快速无损的绿色分析技术。近年来，近红外技术已经越来越多的被应用于中药研究，包括药材产地鉴别、有效组分含量测定和制药过程的在线检测和监控。从近年来研究进展情况看来，近红外光谱分析技术是最有希望在中药生产过程实现在线检测及质量控制的过程分析技术之一。

在本发明的一些具体实施方案中，所述生产工艺包括提取和浓缩。

在本发明的一些具体实施方案中，黄芪甲苷含量采用高效液相色谱法测定，所述高效液相色谱的条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-水(80:20)为流动相；蒸发光散射检测器检测，漂移管的温度为55～85℃，载气流速：0.5～2.5lmin^-1，增益值为6～10。

在本发明的一些具体实施方案中，对照品溶液的制备：取黄芪甲苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每lml含50μg的溶液，即得。

在本发明的一些具体实施方案中，供试品溶液的制备为：取在线采集提取液，静置室温，离心，取上清液，滤过，取续滤液，即得。

在本发明的一些具体实施方案中，测定法：分别精密吸取对照品溶液10μl、20μl，供试品溶液20μl，注入液相色谱仪，测定，用外标两点法对数方程计算，即得。

在本发明的一些具体实施方案中，红景天苷、特女贞苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量采用高效液相色谱法测定，所述高效液相色谱的条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-水为流动相，梯度洗脱；毛蕊异黄酮葡萄糖苷检测波长为210～300nm，特女贞苷的检测波长210～300nm，红景天苷的检测波长230～350nm；流速为0.5～1.5ml·min^-1，进样量为2～15μl，柱温20～40℃；

按照梯度程序进行梯度洗脱：

在本发明的一些具体实施方案中，对照品溶液制备：分别取红景天苷对照品、毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品及特女贞苷对照品适量，精密称定，置于10ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成每1ml分别含红景天苷30μg、毛蕊异黄酮葡萄糖苷10μg、特女贞苷100μg的混合对照品溶液。

在本发明的一些具体实施方案中，提取液样品溶液制备方法：取在线采集提取液，静置室温，离心，取上清液，滤过，取续滤液，即得。

在本发明的一些具体实施方案中，浓缩液样品溶液制备方法：取在线采集浓缩液，静置室温，精密吸取1ml，于2～25ml容量瓶中，加水，溶解，定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。在本发明的一些具体实施方案中，测定法：分别精密吸取对照品溶液及供试品溶液各5μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

在本发明的一些具体实施方案中，所述近红外光谱检测包括光谱采集、光谱预处理的步骤；

所述光谱采集为：取贞芪扶正颗粒生产工艺中的提取液或浓缩液，在25℃±5℃条件下，采用漫反射内置光源采集近红外光谱，以空气为参比背景，扫描次数为200～400，扫描光谱范围为1100～2300nm，波长增量1.0～3.0nm，每隔15s自动在线采谱1次。

在本发明的一些具体实施方案中，所述光谱预处理为：采用一阶导数九点平滑法对原始光谱进行预处理。

在本发明的一些具体实施方案中，所述获得贞芪扶正颗粒生产工艺样品近红外定量校正模型具体为：采用偏最小二乘法(pls)、交叉-验证法(cross-validation)，用unscrambler定量分析软件，将预处理后光谱数据与样品hplc含量数据关联，建立各指标的校正模型。

在本发明的一些具体实施方案中，贞芪扶正颗粒提取过程黄芪甲苷nir模型中，内部验证直线方程为y＝0.9493x+0.0023，外部验证直线方程为y＝0.9077x+0.0042，其中x为化验值，y为预测值，内部验证决定系数r²＝0.9743，外部验证决定系数r²＝0.9511；rmsec＝0.0053，rmsep＝0.0073；

贞芪扶正颗粒提取过程红景天苷nir模型中，内部验证直线方程为y＝0.9330x+0.0022，外部验证直线方程为y＝0.8874x+0.0037，其中x为化验值，y为预测值，内部验证决定系数r²＝0.9659，外部验证决定系数r²＝0.9436；rmsec＝0.0046，rmsep＝0.0058；；

贞芪扶正颗粒提取过程毛蕊异黄酮葡萄糖苷nir模型中，内部验证直线方程为y＝0.9426x+0.0011，外部验证直线方程为y＝0.8562x+0.0027，其中x为化验值，y为预测值，内部验证决定系数r²＝0.9709，外部验证决定系数r²＝0.9265；rmsec＝0.0028，rmsep＝0.0044；

贞芪扶正颗粒提取过程特女贞苷nir模型中，内部验证直线方程为y＝0.9724x+0.0196，外部验证直线方程为y＝0.9300x+0.0533，其中x为化验值，y为预测值，内部验证决定系数r²＝0.9861，外部验证决定系数r²＝0.9739，rmsec＝0.0866，rmsep＝0.1187。

在本发明的一些具体实施方案中，贞芪扶正颗粒浓缩过程黄芪甲苷nir模型中，内部验证直线方程为y＝0.9409x+0.0112，外部验证直线方程为y＝0.8653x+0.0255，其中x为化验值，y为预测值，内部验证决定系数r²＝0.9700，外部验证决定系数r²＝0.9241；rmsec＝0.0161，rmsep＝0.0025；；

贞芪扶正颗粒浓缩过程红景天苷nir模型中，内部验证直线方程为y＝0.9292x+0.0153，外部验证直线方程为y＝0.8500x+0.0324，其中x为化验值，y为预测值，内部验证决定系数r²＝0.9640，外部验证决定系数r²＝0.9227；rmsec＝0.0198，rmsep＝0.0287；

贞芪扶正颗粒浓缩过程毛蕊异黄酮葡萄糖苷nir模型中，内部验证直线方程为y＝0.9705x+0.0027，外部验证直线方程为y＝0.9047x+0.0080，其中x为化验值，y为预测值，内部验证决定系数r²＝0.9851，外部验证决定系数r²＝0.9642；rmsec＝0.0083，rmsep＝0.0129；

贞芪扶正颗粒浓缩过程特女贞苷nir模型中，内部验证直线方程为y＝0.9500x+0.1517，外部验证直线方程为y＝0.8873x+0.3497，其中x为化验值，y为预测值，内部验证决定系数r²＝0.9747，外部验证决定系数r²＝0.9418；rmsec＝0.2384，rmsep＝0.3583。

在以上技术方案的基础上，本发明还提供了一种贞芪扶正颗粒生产工艺的检测方法，按照所述的构建方法获得贞芪扶正颗粒近红外定量校正模型，将贞芪扶正颗粒生产工艺中待测样品的近红外光谱数据导入所述贞芪扶正颗粒近红外定量校正模型，获得所述待测样品中黄芪甲苷、红景天苷、特女贞苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷的含量，将近红外光谱分析技术引入中药生产的提取和浓缩过程，实现对各指标成分的实时监测以及提取、浓缩过程终点的快速判断，有利于提高中药提取、浓缩过程的质量控制水平，充分保证产品质量稳定、可靠。

近红外(nir)光谱主要是有机分子的倍频与合频吸收光谱，物质分子中的c-h、n-h、o-h和c-o等基团的基频振动的倍频与合频吸收在近红外区，信息含量丰富，因此近红外技术比较适合于分析与这些基团有直接或间接关系的成分，中药中很多功效成分如黄酮类及萜苷类物质都包含有这些基团，因此通过化学计量学的方法，建立中药有机物质的近红外数学模型，可达到快速地测定中药中有机物质的含量，降低检测成本的目的。与传统分析技术相比，近红外光谱分析技术具有诸多优点，它能在几分钟甚至数十秒内，仅通过对被测样品完成一次近红外光谱的采集测量，即可完成其多项性能指标的测定。光谱测量时不需要对分析样品进行前处理；分析过程中不消耗其它材料或破坏样品；分析重现性好、成本低。对于质量监控和在线监测是十分经济且快速的。

本发明将近红外光谱分析技术引入中药生产的提取和浓缩过程，实现对各指标成分的实时监测以及提取、浓缩过程终点的快速判断，有利于提高中药提取、浓缩过程的质量控制水平，充分保证产品质量稳定、可靠。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1示混合对照品hplc色谱图；

图2示提取液hplc色谱图；

图3示黄芪甲苷对照品hplc色谱图；

图4示提取液hplc色谱图；

图5示提取过程nir原始光谱；

图6示提取过程nir预处理光谱；

图7示提取-红景天苷nir建模结果图；

图8示提取-特女贞苷nir建模结果图；

图9示提取-毛蕊异黄酮葡萄糖苷nir建模结果图；

图10示提取-黄芪甲苷nir建模结果图；

图11示混合对照品hplc色谱图；

图12示浓缩液hplc色谱图；

图13示黄芪甲苷对照品hplc色谱图；

图14示浓缩液hplc色谱图；

图15示浓缩过程nir原始光谱；

图16示浓缩过程nir预处理光谱；

图17示mvr浓缩-红景天苷nir建模结果图；

图18示mvr浓缩-特女贞苷建模结果图；

图19示mvr浓缩-毛蕊异黄酮葡萄糖苷建模结果图；

图20示mvr浓缩-黄芪甲苷建模结果图。

具体实施方式

本发明公开了一种贞芪扶正颗粒生产工艺中近红外定量校正模型的构建方法及检测方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明提供了一种贞芪扶正颗粒有效成分的近红外光谱在线检测方法，检测步骤如下：

(1)确定对照品采用高效液相色谱法测定贞芪扶正颗粒样品中的有效成分黄芪甲苷、红景天苷、特女贞苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷的含量，并以此含量为对照值。

(2)近红外安装与光谱采集在生产过程工艺关键点进行近红外监测系统安装，分别采集各工艺点药液的近红外光谱，对各原始光谱进行预处理，用unscrambler定量分析软件，采用偏最小二乘法、交叉-验证法，分别建立各工艺点被测药液中有效成分与吸收光谱之间关系的数学模型，进行模型预测，并与对照值对比，要求误差小于10％。

(3)在线检测有效成分含量通过近红外监测系统分别采集各工艺点药液的近红外光谱后，用相应的近红外数学模型进行分析计算，得到各工艺点药液中有效成分含量。

(4)工艺监控及优化通过所检测的数据，确定自动调配系统的程序数据并对工艺进行监控、调整和优化，确定提取浓缩终点。

试剂与仪器：

多功能提取罐，brimroseluminar3060型近红外在线监测系统，snap32光谱分析软件，unscrambler光谱建模软件，lc-20at全自动高效液相色谱仪，lc-20ac全自动高效液相色谱仪，acec18色谱柱，计时器等；

色谱乙腈、甲醇，甲醇(分析纯)、红景天苷、特女贞苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、黄芪甲苷对照品等。

本发明提供的贞芪扶正颗粒生产工艺中近红外定量校正模型的构建方法及检测方法中所用原料及试剂均可由市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1提取、浓缩过程nir在线质量控制研究

1.1实验材料

1.1.1对照品

特女贞苷对照品(中国食品药品检定院，111926-201404)、红景天苷对照品(中国食品药品检定院，110818-201206)、毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品(中国食品药品检定院，111920-201505)、黄芪甲苷对照品(中国食品药品检定院，110781-201515)。

1.1.2试剂

色谱甲醇，购自fisher；甲醇(分析纯)，购自北京化工厂；水为超纯水；氮气(高纯氮气，长春新光气体制造有限公司)。

1.2仪器设备

dt-3m³多功能提取罐，brimroseluminar3060型近红外在线监测系统，snap32光谱分析软件，unscrambler光谱建模软件，岛津lc-20at全自动高效液相色谱仪，岛津lc-20ac全自动高效液相色谱仪。

1.2实验方法

1.2.1样品收集

1.2.1.1提取过程质量控制模型

全程在线采集水提取过程的nir光谱，样品采集时间点累积覆盖提取全过程，依据实际生产情况，详细记录采样时间。各采样点采集50ml提取液，静至室温，密封，于4℃储存，备用。

1.2.1.2浓缩过程质量控制模型

提取液浓缩过程采用mvr效浓缩设备，全程在线采集nir光谱，浓缩温度达到80℃时开始计时，实时采集nir光谱，样品采集时间点累积覆盖浓缩全过程，依据实际生产情况，详细记录采样时间，浓缩至相对密度约1.05-1.10(70-80℃)停止采集。各采样点取10ml浓缩液，密封，于4℃储存，备用。

1.2.2指标检测方法

①红景天苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、特女贞苷检测方法

照髙效液相色谱法(通则0512)测定

色谱条件及系统适应性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇为流动相a，水为流动相b，按照下表规定进行梯度洗脱；柱温为30℃；毛蕊异黄酮葡萄糖苷检测波长为250nm，特女贞苷的检测波长224nm，红景天苷的检测波长275nm。

表1色谱梯度洗脱条件

混合对照品溶液的制备取各对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含红景天苷26.4μg.、特女贞苷105.2μg、毛蕊异黄酮葡萄糖苷6.6μg的混合对照品溶液。

提取液样品溶液制备方法：取在线采集提取液，静置室温，离心，取上清液，滤过，取续滤液，即得。

浓缩液样品溶液制备方法：取在线采集浓缩液，静置室温，精密吸取1ml，于5ml容量瓶中，加水，溶解，定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

测定法精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5μl，注入高效液相色谱仪，测定。

②黄芪甲苷检测方法

照髙效液相色谱法(通则0512)测定

色谱条件及系统适应性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-水(80：20)为流动相；蒸发光散射器检测，漂移管的温度为75℃，载气流速：1.5l.min-¹，增益值为8。理论板数按黄芪甲苷峰计算应不低于4000。

对照品溶液的制备取黄芪甲苷对照品适量，加甲醇制备成每1ml含黄芪甲苷45μg的溶液。

提取液样品溶液制备方法：取在线采集提取液，静置室温，离心，取上清液，滤过，取续滤液，即得。

浓缩液样品溶液制备方法：取在线采集浓缩液，静置室温，精密吸取1ml，于5ml容量瓶中，加水，溶解，定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

测定法分别精密吸取对照品溶液10μl、20μl，供试品溶液20μl，注入液相色谱仪，测定，以外标两点法计算对数方程，即得。

1.2.3光谱采集

打开光谱采集系统1100～2300nm，波长增量1.0nm，扫描次数200。执行采集命令后nir检测设备每隔15s自动在线采谱1次。

1.2.4光谱预处理

在建立模型前，需要消除噪音和基线漂移等因素对光谱采集的影响。利用snap软件中的光谱处理程序，采用一阶导数9点平滑法(savitzky-golay)对原始光谱进行预处理，消除颜色差别等因素引起的光谱基线偏移和漂移。1.2.5建立pls数学模型

采用pls法将各指标测定结果与经过预处理光谱进行关联，利用unscrambler定量分析软件，以偏最小二乘法(pls)和交叉-验证法(cross-validation)建立各指标校正模型。

采用光谱影响值(leverage)和化学值误差(residual)等统计量检验，剔除nir光谱与各指标测定结果的异常值，并根据模型主要参数：内外部验证决定系数(r²)、校正均方根偏差(rmsec)、预测均方根偏差(rmsep)等，进行筛选选优化，确定各指标nir检测模型。

1.2.6模型验证

利用已建立的各指标模型，随机抽取未参与建模的样品进行分析，验证样品与建模样品光谱采集参数设置的一致性，获得各指标的预测结果，计算预测值与实测值偏差，验证模型准确性。偏差值计算公式如下：

1.3结果

1.3.1提取过程nir在线质量控制研究

1.3.1.1指标检测结果

如图1～图4所示。

1.3.1.2光谱采集及预处理

按照样品采集时间，从提取在线采集光谱中挑选对应光谱，得到的光谱图，见图5。

在建立模型前，采用savitzky-golay法对原始光谱进行预处理，消除噪音和基线漂移等对光谱信息的影响，预处理光谱见图6。

1.3.1.3模型建立

采用提取过程各指标测定结果与nir光谱相结合，利用unscrambler定量分析软件建立提取过程各指标nir模型，见图7～10。

贞芪扶正颗粒提取过程黄芪甲苷nir模型中，内部验证直线方程为y＝0.9493x+0.0023，外部验证直线方程为y＝0.9077x+0.0042，其中x为化验值，y为预测值，内部验证决定系数r²＝0.9743，外部验证决定系数r²＝0.9511；rmsec＝0.0053，rmsep＝0.0073；

贞芪扶正颗粒提取过程红景天苷nir模型中，内部验证直线方程为y＝0.9330x+0.0022，外部验证直线方程为y＝0.8874x+0.0037，其中x为化验值，y为预测值，内部验证决定系数r²＝0.9659，外部验证决定系数r²＝0.9436；rmsec＝0.0046，rmsep＝0.0058；；

贞芪扶正颗粒提取过程毛蕊异黄酮葡萄糖苷nir模型中，内部验证直线方程为y＝0.9426x+0.0011，外部验证直线方程为y＝0.8562x+0.0027，其中x为化验值，y为预测值，内部验证决定系数r²＝0.9709，外部验证决定系数r²＝0.9265；rmsec＝0.0028，rmsep＝0.0044；

贞芪扶正颗粒提取过程特女贞苷nir模型中，内部验证直线方程为y＝0.9724x+0.0196，外部验证直线方程为y＝0.9300x+0.0533，其中x为化验值，y为预测值，内部验证决定系数r²＝0.9861，外部验证决定系数r²＝0.9739，rmsec＝0.0866，rmsep＝0.1187。

1.3.2浓缩过程nir在线质量控制研究

1.3.2.1指标检测结果

依照样品采集方案，对mvr浓缩罐进行在线采集提取液浓缩过程样品。如图11～14所示。

1.3.2.2光谱采集及预处理

按照样品采集时间，从浓缩在线采集光谱中挑选对应光谱，得到115例样品的光谱图，见图15。

在建立模型前，采用savitzky-golay法对原始光谱进行预处理，消除噪音和基线漂移等对光谱信息的影响，预处理光谱见图16。

1.3.2.3模型建立

采用浓缩过程各指标测定结果与nir光谱相结合，利用unscrambler定量分析软件建立浓缩过程各指标nir模型，见图17～20。

在本发明的一些具体实施方案中，贞芪扶正颗粒浓缩过程黄芪甲苷nir模型中，内部验证直线方程为y＝0.9409x+0.0112，外部验证直线方程为y＝0.8653x+0.0255，其中x为化验值，y为预测值，内部验证决定系数r²＝0.9700，外部验证决定系数r²＝0.9241；rmsec＝0.0161，rmsep＝0.0025；

贞芪扶正颗粒浓缩过程红景天苷nir模型中，内部验证直线方程为y＝0.9292x+0.0153，外部验证直线方程为y＝0.8500x+0.0324，其中x为化验值，y为预测值，内部验证决定系数r²＝0.9640，外部验证决定系数r²＝0.9227；rmsec＝0.0198，rmsep＝0.0287；

贞芪扶正颗粒浓缩过程毛蕊异黄酮葡萄糖苷nir模型中，内部验证直线方程为y＝0.9705x+0.0027，外部验证直线方程为y＝0.9047x+0.0080，其中x为化验值，y为预测值，内部验证决定系数r²＝0.9851，外部验证决定系数r²＝0.9642；rmsec＝0.0083，rmsep＝0.0129；

贞芪扶正颗粒浓缩过程特女贞苷nir模型中，内部验证直线方程为y＝0.9500x+0.1517，外部验证直线方程为y＝0.8873x+0.3497，其中x为化验值，y为预测值，内部验证决定系数r²＝0.9747，外部验证决定系数r²＝0.9418；rmsec＝0.2384，rmsep＝0.3583。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。