一种烟草中敌螨普残留量的检测方法与流程

本发明属于农药残留检测技术技术领域，具体涉及一种烟草中敌螨普残留量的检测方法。

背景技术

敌螨普(dinocap，cas:39300-45-3)是由六种不同的二硝基巴豆酸酯异构体组成的混合物，是一种触杀型杀菌剂，主要用于防治农作物及果蔬中的白粉病，另外还可以作为非内吸性杀螨剂。敌螨普毒性较大，具有致畸性和致癌性，施用不当会在农作物中造成残留，严重影响烟叶品质和安全，因此，各国都制定了相当严格的mrl值，coresta指导性残留限量(grl)规定烟草中敌螨普为0.6mg/kg，中国烟草总公司规定了烟草中敌螨普的最大残留限量(mrl)为0.1mg/kg，因此对其残留的检测非常重要。

由于敌螨普具有热不稳定性和化学不稳定性，容易水解或光解成相应的酚，并且敌螨普的六个同分异构体结构相似，在色谱和质谱上均较难分离，因此，对敌螨普的残留检测一直是农药残留检测领域非常具有挑战性的一项工作。目前国外报道的检测方法主要有气相色谱-ecd法、液相色谱法、液相色谱-质谱联用法。液相色谱法或液相色谱-质谱联用法前处理提取步骤繁琐耗时，需要将敌螨普的六个异构体都完全水解转化为酚，水解时间较长，且由于不能买到敌螨普水解酚的标准品，难于准确定量；使用气相色谱-ecd法分析时选择性、精密度和重现性较差。

基于以上问题，有必要发明一种烟草中敌螨普残留量的检测方法。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种烟草中敌螨普残留量的检测方法。

本发明的目的是这样实现的，包括以下步骤：

1）标准溶液的配制：精确称取敌螨普标准品，溶解定容至棕色容量瓶中，配制成1mg/ml的标准储备液，于-15~-25℃冰箱中避光保存，将标准储备液稀释成系列标准工作溶液，用于制作标准曲线；

2）样品前处理：

提取：称取待测样品至离心管中，加水振荡至样品被水充分浸润后静置8-12min；移取与水等量的1%甲酸-乙腈至离心管中，并以1500-2500r/min速度振荡2～5min；在离心管中分别加入无水硫酸镁、氯化钠、柠檬酸钠、柠檬酸氢二钠，加入量为待测样品：无水硫酸镁：氯化钠：柠檬酸钠：柠檬酸氢二钠=1：2：0.5：0.5：0.25，立即以1500-2500r/min速度振荡2～5min；然后以5000-7000r/min离心3～5min；

净化：移取上清液1ml至1.5ml离心管中，加入50～200mgc18分散吸附剂，旋涡振荡2～5min，以5000～6000r/min离心3～5min，吸取上清液过0.22μm有机相滤膜后上机分析；

3）敌螨普残留量的检测：将经过步骤（2）处理后的样品，采用气相色谱负化学源质谱联用法检测，并结合步骤（1）得到的标准曲线测得敌螨普残留量。

与现有技术相比，本发明的有益效果：

1、本发明创造性的采用快速、简单、可靠的提取方法用于烟草样品中敌螨普的提取，然后加入c18分散吸附剂，采用高灵敏度的气相色谱负化学源质谱联用法测定烟草中敌螨普的残留量，相比现有技术，本发明的检测方法具有样品前处理更简便、灵敏度和准确性更高的特点，能完全满足敌螨普农药残留检测要求。

2、本发明的气相色谱负化学源质谱联用法对含电负性基团的物质具有高选择性和高灵敏度，将quechers法首次应用到烟草样品中敌螨普的提取，加入c18分散吸附剂净化，采用高灵敏度的gc-nci-ms测定烟草中敌螨普，有效提高处理效率和灵敏度。

3、本发明检测方法简单，样品的提取步骤高效、安全、成本低，样品的净化步骤简单快速，净化效果及回收率高，通过对检测过程中前处理的优化以及检测中色谱条件的控制，实现了烟草中敌螨普准确、及时的检测。

4、本发明的色谱方法对敌螨普同分异构体分离效果好，采用负化学源软电离，对敌螨普具有高选择性和高灵敏度，适用于烟草中敌螨普残留量的准确检测。

附图说明

图1为本发明实施例1中烟草空白样品中添加敌螨普及敌螨普标准溶液色谱图。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。

本发明所述的烟草中敌螨普残留量的检测方法，包括以下步骤：

1）标准溶液的配制：精确称取敌螨普标准品，溶解定容至棕色容量瓶中，配制成1mg/ml的标准储备液，于-15~-25℃冰箱中避光保存，将标准储备液稀释成系列标准工作溶液，用于制作标准曲线；

2）样品前处理：

提取：称取待测样品至离心管中，加水振荡至样品被水充分浸润后静置8-12min；移取与水等量的1%甲酸-乙腈至离心管中，并以1500-2500r/min速度振荡2～5min；在离心管中分别加入无水硫酸镁、氯化钠、柠檬酸钠、柠檬酸氢二钠，加入量为待测样品：无水硫酸镁：氯化钠：柠檬酸钠：柠檬酸氢二钠=1：2：0.5：0.5：0.25，立即以1500-2500r/min速度振荡2～5min；然后以5000-7000r/min离心3～5min；

净化：移取上清液1ml至1.5ml离心管中，加入50～200mgc18分散吸附剂，旋涡振荡2～5min，以5000～6000r/min离心3～5min，吸取上清液过0.22μm有机相滤膜后上机分析；

3）敌螨普残留量的检测：将经过步骤（2）处理后的样品，采用气相色谱负化学源质谱联用法检测，并结合步骤（1）得到的标准曲线测得敌螨普残留量。

进一步的，步骤（1）中所述的标准储备液的配制方法为精确称取敌螨普标准品0.1g，精确至0.1mg，以甲醇溶解定容至100ml棕色容量瓶，配制成1mg/ml的标准储备液。

进一步的，步骤（1）中所述的标准曲线的制作方法具体为用甲醇将敌螨普标准储备液配制成0.01、0.02、0.05、0.1、0.2和0.5mg/l系列质量浓度的敌螨普标准工作溶液，以峰面积对各浓度进行线性回归，得到标准曲线，所述的标准曲线在敌螨普质量浓度为0.01-0.5mg/l范围内呈良好线性，相关系数r²大于0.99。

进一步的，所述的检测方法还包括添加回收实验，所述的添加回收实验为采用烟草空白样品进行添加回收，将所述的敌螨普标准储备液用于添加回收试验，具体为分别在0.05、0.1、0.5mg/kg3个添加水平下进行加标回收实验，每个添加浓度设6个平行样本，然后进行样品前处理和检测，所述的敌螨普在烟草中的回收率为95.83%～102.34%，相对标准偏差为3.75%～5.30%。

进一步的，步骤（2）中所述的提取具体为称取2g待测样品，精确至0.01g，于50ml具盖离心管中，加入10ml水，振荡至样品被水充分浸润后静置10min；移取10ml1%甲酸-乙腈至离心管中，并置于漩涡混合振荡仪上以2000r/min速度振荡2～5min；在离心管中分别加入4g无水硫酸镁，1g氯化钠，1g柠檬酸钠和0.5g柠檬酸氢二钠，立即于漩涡混合振荡仪上以2000r/min速度振荡2～5min，然后以6000r/min离心3～5min。

进一步的，步骤（2）中所述的净化具体为移取上清液1ml至1.5ml离心管中，加入50mgc18分散吸附剂，旋涡振荡2min，以6000r/min离心3min，吸取上清液过0.22μm有机相滤膜后上机分析。

进一步的，步骤（3）所述的气相色谱负化学源质谱联用法的色谱条件为色谱柱：db-5ms（30m×0.25mm×0.25μm）。

进一步的，步骤（3）所述的质谱仪的分析条件为：负化学离子源（nci），采用选择离子(sim)模式，特征离子为m/z278和m/z279，其中m/z278为定量离子。

进一步的，步骤（3）所述的敌螨普残留量的检出限为0.02mg/kg，定量限为0.07mg/kg。

进一步的，所述的敌螨普标准品的纯度为98%；所述的甲醇、乙腈和甲酸为hplc级；所述的无水硫酸镁为分析纯且使用前在650℃灼烧4小时，贮存于干燥器中备用；所述的氯化钠、柠檬酸钠、柠檬酸氢二钠均为分析纯。

实施例1

1、仪器与试剂：bruker450gc-300ms气相色谱-串联质谱仪（美国bruker公司），millipore超纯水机（美国milliporesimplicity公司），eppendorf5804高速离心机（德国eppendorf公司），talboys数显型多管式旋涡混合器（上海安谱科学仪器公司）。甲醇、乙腈、甲酸，hplc级，美国fisher公司。无水硫酸镁，分析纯。用前应在650℃灼烧4小时，贮存于干燥器中备用。氯化钠、柠檬酸钠、柠檬酸氢二钠，分析纯。敌螨普标准品(纯度为98%，德国dr公司提供)。

2、烟草中敌螨普残留量的检测方法：

1）标准溶液的配制：分别精确称取敌螨普标准品(精确至0.1mg)，以甲醇溶解定容至100ml棕色容量瓶，配成1mg/l的单一标准储备液，于-20℃冰箱中避光保存，用于制作标准曲线和定量检测。

2）样品前处理：称取约2g样品，精确至0.01g，于50ml具盖离心管中，加入10ml水，振荡至样品被水充分浸润后静置10min。移取10ml1%甲酸-乙腈至离心管中，并置于漩涡混合振荡仪上以2000r/min速度振荡2min。将离心管在冰箱冷冻室（-18℃）中冷冻保存10min后，取出。在离心管中分别加入4g无水硫酸镁，1g氯化钠，1g柠檬酸钠和0.5g柠檬酸氢二钠，立即于漩涡混合振荡仪上以2000r/min速度振荡2min，以防止无水硫酸镁遇水反应造成局部过热并结块，然后以6000r/min离心3min。移取上清液1ml至1.5ml离心管中，加入50mgc18分散吸附剂，旋涡振荡2min，以6000r/min离心3min，吸取上清液过0.22μm有机相滤膜后上机分析。

3）敌螨普残留量的检测：敌螨普残留量的检测：将经过步骤（2）处理后的样品，采用气相色谱负化学源质谱联用法检测，并结合步骤（1）得到的标准曲线测得敌螨普残留量。

色谱-质谱分析条件：色谱柱：db-5ms（30m×0.25mm×0.25μm）；进样量：1μl，分流比20:1；进样口：250℃；升温程序：100℃保持2min，10℃/min升至280℃，保持6min；载气：氦气，1.0ml/min，负化学离子源（nci），反应气：甲烷，采用选择离子(sim)模式，特征离子为m/z278和m/z279，其中m/z278为定量离子。

3、结果与分析：

1）线性范围和检出限（标准曲线的制作）：

用甲醇将敌螨普配制成0.01、0.02、0.05、0.1、0.2和0.5mg/l系列质量浓度的敌螨普标准工作液，以峰面积对各种农药的浓度进行线性回归，在0.01-0.5mg/l范围内呈良好线性，曲线方程为y=2.1011e⁵x-1.94e⁵，相关系数r²为0.9923，分别以3倍和10倍信噪比（s/n）来确定其检出限和定量限，得出敌螨普在烟草中的检出限为0.02mg/kg，定量限为0.07mg/kg。

2）回收率、精密度和基质效应（添加回收试验）：

采用烟草空白样品进行添加回收和精密度实验。分别在0.05、0.1、0.5mg/kg3个添加水平下进行加标回收实验，每个添加浓度设6个平行样本，按本实验方法进行样品处理和测定，结果见表1，敌螨普在烟草中的回收率为95.83%～102.34%，相对标准偏差为3.75%～5.30%，方法的回收率和精密度都较好。如图1烟草空白样品中添加敌螨普及敌螨普标准溶液色谱图。

表1敌螨普在烟草中的加标回收率、精密度(n=6)

3）提取溶剂的选择：乙腈是常用的农药残留提取试剂，乙腈提取液干扰物较其他有机试剂少。在烟草空白基质中加入0.1mg/kg的敌螨普，混匀后放置2h后，分别比较了乙腈、1％甲酸－乙腈溶液、1％乙酸－乙腈溶液对于目标农药的提取效率。实验结果表明，1％甲酸－乙腈溶液作为提取溶剂的回收率最高(99.03%)，乙腈的提取效率其次（92.67%），1％乙酸－乙腈溶液的提取效率最差（90.52%），综合考虑，选用1％甲酸-乙腈作为本实验的提取溶剂。

4）分散吸附剂的选择：

分别称取50、100、150、200mg的c18吸附剂和psa吸附剂于2.0ml离心管中，在烟草空白基质中加入0.1mg/kg的敌螨普，按照样品前处理提取步骤提取，取上清液1ml至装有不同吸附剂的离心管，考察2种吸附剂对敌螨普的回收率影响和净化效果。实验结果表明：psa作为弱阴离子交换剂，对脂肪酸、有机酸、有机碳水化合物等极性化合物有较强的吸附作用，它的吸附作用随着吸附剂用量增加而加强，因此除杂较净，但对敌螨普的回收率均低于50%。c18对脂类具有较好的净化效果，并且对敌螨普有较好的回收率，随着吸附剂用量增加，去杂效果和敌螨普的回收率并无明显变化，综合考虑两种吸附剂的去杂质效果和对目标化合物的吸附情况，选择50～200mgc18吸附剂对提取液进行净化。

实施例2

一种烟草中敌螨普残留量的检测方法，包括以下步骤：

1）标准溶液的配制：精确称取敌螨普标准品0.1g，精确至0.1mg，以甲醇溶解定容至100ml棕色容量瓶，配制成1mg/ml的标准储备液，于-15℃冰箱中避光保存，将标准储备液稀释成系列标准工作溶液，用于制作标准曲线；

所述的标准曲线的制作方法具体为用甲醇将敌螨普标准储备液配制成0.01、0.02、0.05、0.1、0.2和0.5mg/l系列质量浓度的敌螨普标准工作溶液，以峰面积对各浓度进行线性回归，得到标准曲线，所述的标准曲线在敌螨普质量浓度为0.01-0.5mg/l范围内呈良好线性，相关系数r²大于0.99；

2）样品前处理：

提取：称取待测样品至离心管中，加水振荡至样品被水充分浸润后静置8min；移取与水等量的1%甲酸-乙腈至离心管中，并以1500r/min速度振荡5min；在离心管中分别加入无水硫酸镁、氯化钠、柠檬酸钠、柠檬酸氢二钠，加入量为待测样品：无水硫酸镁：氯化钠：柠檬酸钠：柠檬酸氢二钠=1：2：0.5：0.5：0.25，立即以1500r/min速度振荡5min；然后以5000r/min离心5min；

净化：移取上清液1ml至1.5ml离心管中，加入50mgc18分散吸附剂，旋涡振荡2min，以5000r/min离心5min，吸取上清液过0.22μm有机相滤膜后上机分析；

3）敌螨普残留量的检测：将经过步骤（2）处理后的样品，采用气相色谱负化学源质谱联用法检测，并结合步骤（1）得到的标准曲线测得敌螨普残留量。

所述的气相色谱负化学源质谱联用法的色谱条件为色谱柱：db-5ms（30m×0.25mm×0.25μm）。所述的质谱仪的分析条件为：负化学离子源（nci），采用选择离子(sim)模式，特征离子为m/z278和m/z279，其中m/z278为定量离子。

所述的敌螨普标准品的纯度为98%；所述的甲醇、乙腈和甲酸为hplc级；所述的无水硫酸镁为分析纯且使用前在650℃灼烧4小时，贮存于干燥器中备用；所述的氯化钠、柠檬酸钠、柠檬酸氢二钠均为分析纯。

所述的检测方法还包括添加回收实验，所述的添加回收实验为采用烟草空白样品进行添加回收，将所述的敌螨普标准储备液用于添加回收试验，具体为分别在0.05、0.1、0.5mg/kg3个添加水平下进行加标回收实验，每个添加浓度设6个平行样本，然后进行样品前处理和检测，结果证明，本方法的回收率和精密度都较好。

实施例3

一种烟草中敌螨普残留量的检测方法，包括以下步骤：

1）标准溶液的配制：精确称取敌螨普标准品0.1g，精确至0.1mg，以甲醇溶解定容至100ml棕色容量瓶，配制成1mg/ml的标准储备液，于-25℃冰箱中避光保存，将标准储备液稀释成系列标准工作溶液，用于制作标准曲线；

所述的标准曲线的制作方法具体为用甲醇将敌螨普标准储备液配制成0.01、0.02、0.05、0.1、0.2和0.5mg/l系列质量浓度的敌螨普标准工作溶液，以峰面积对各浓度进行线性回归，得到标准曲线，所述的标准曲线在敌螨普质量浓度为0.01-0.5mg/l范围内呈良好线性，相关系数r²大于0.99；

2）样品前处理：

提取：称取待测样品至离心管中，加水振荡至样品被水充分浸润后静置12min；移取与水等量的1%甲酸-乙腈至离心管中，并以2500r/min速度振荡2min；在离心管中分别加入无水硫酸镁、氯化钠、柠檬酸钠、柠檬酸氢二钠，加入量为待测样品：无水硫酸镁：氯化钠：柠檬酸钠：柠檬酸氢二钠=1：2：0.5：0.5：0.25，立即以2500r/min速度振荡2min；然后以7000r/min离心3min；

净化：移取上清液1ml至1.5ml离心管中，加入200mgc18分散吸附剂，旋涡振荡5min，以6000r/min离心3min，吸取上清液过0.22μm有机相滤膜后上机分析；

3）敌螨普残留量的检测：将经过步骤（2）处理后的样品，采用气相色谱负化学源质谱联用法检测，并结合步骤（1）得到的标准曲线测得敌螨普残留量。

所述的气相色谱负化学源质谱联用法的色谱条件为色谱柱：db-5ms（30m×0.25mm×0.25μm）。所述的质谱仪的分析条件为：负化学离子源（nci），采用选择离子(sim)模式，特征离子为m/z278和m/z279，其中m/z278为定量离子。

所述的敌螨普标准品的纯度为98%；所述的甲醇、乙腈和甲酸为hplc级；所述的无水硫酸镁为分析纯且使用前在650℃灼烧4小时，贮存于干燥器中备用；所述的氯化钠、柠檬酸钠、柠檬酸氢二钠均为分析纯。

所述的检测方法还包括添加回收实验，所述的添加回收实验为采用烟草空白样品进行添加回收，将所述的敌螨普标准储备液用于添加回收试验，具体为分别在0.05、0.1、0.5mg/kg3个添加水平下进行加标回收实验，每个添加浓度设6个平行样本，然后进行样品前处理和检测，结果证明，本方法的回收率和精密度都较好。

实施例4

一种烟草中敌螨普残留量的检测方法，包括以下步骤：

1）标准溶液的配制：精确称取敌螨普标准品0.1g，精确至0.1mg，以甲醇溶解定容至100ml棕色容量瓶，配制成1mg/ml的标准储备液，于-20℃冰箱中避光保存，将标准储备液稀释成系列标准工作溶液，用于制作标准曲线；

所述的标准曲线的制作方法具体为用甲醇将敌螨普标准储备液配制成0.01、0.02、0.05、0.1、0.2和0.5mg/l系列质量浓度的敌螨普标准工作溶液，以峰面积对各浓度进行线性回归，得到标准曲线，所述的标准曲线在敌螨普质量浓度为0.01-0.5mg/l范围内呈良好线性，相关系数r²大于0.99；

2）样品前处理：

提取：称取待测样品至离心管中，加水振荡至样品被水充分浸润后静置10min；移取与水等量的1%甲酸-乙腈至离心管中，并以2000r/min速度振荡4min；在离心管中分别加入无水硫酸镁、氯化钠、柠檬酸钠、柠檬酸氢二钠，加入量为待测样品：无水硫酸镁：氯化钠：柠檬酸钠：柠檬酸氢二钠=1：2：0.5：0.5：0.25，立即以2000r/min速度振荡3min；然后以6000r/min离心4min；

净化：移取上清液1ml至1.5ml离心管中，加入100mgc18分散吸附剂，旋涡振荡3min，以5500r/min离心4min，吸取上清液过0.22μm有机相滤膜后上机分析；

3）敌螨普残留量的检测：将经过步骤（2）处理后的样品，采用气相色谱负化学源质谱联用法检测，并结合步骤（1）得到的标准曲线测得敌螨普残留量。

所述的气相色谱负化学源质谱联用法的色谱条件为色谱柱：db-5ms（30m×0.25mm×0.25μm）。所述的质谱仪的分析条件为：负化学离子源（nci），采用选择离子(sim)模式，特征离子为m/z278和m/z279，其中m/z278为定量离子。

所述的敌螨普标准品的纯度为98%；所述的甲醇、乙腈和甲酸为hplc级；所述的无水硫酸镁为分析纯且使用前在650℃灼烧4小时，贮存于干燥器中备用；所述的氯化钠、柠檬酸钠、柠檬酸氢二钠均为分析纯。

所述的检测方法还包括添加回收实验，所述的添加回收实验为采用烟草空白样品进行添加回收，将所述的敌螨普标准储备液用于添加回收试验，具体为分别在0.05、0.1、0.5mg/kg3个添加水平下进行加标回收实验，每个添加浓度设6个平行样本，然后进行样品前处理和检测，结果证明，本方法的回收率和精密度都较好。