本发明涉及一种电致化学发光传感器的制备方法及应用。属于新型纳米功能材料与生物传感分析技术领域。
背景技术：
四环类抗生素又称氨苄青霉素，是一种β-内酰胺类抗生素，为半合成广谱青霉素，可治疗多种细菌感染。适应症包含呼吸道感染、泌尿道感染、脑膜炎、沙门氏菌感染症，以及心内膜炎。由于其使用方便、成本低廉，多用于治疗鸡敏感菌引起的感染性疾病，如大肠杆菌、沙门氏菌、巴氏杆菌、葡萄球菌和链球菌感染等。2017年10月27日，世界卫生组织国际癌症研究机构公布的致癌物清单中，氨苄青霉素在3类致癌物清单中。因此，开发一种快速、高选择性和灵敏检测四环类抗生素的方法对公共健康非常重要，并有广阔的市场应用前景。
电分析化学传感器包括电化学传感器、电致化学发光传感器、光电化学传感器等，该类传感器具有高特异性选择性、优异的稳定性、优异的重现性、宽检测范围和底部检测限。由于该传感器制备简单、检测方便、灵敏度高、成本低等优点被广泛应用于色谱分离、膜分、固相萃取、药物控释、化学传感等领域。分子印迹聚合物（mip），也称为“塑料抗体”，能够特异性识别并选择性吸附特定的靶分子（即模板分子）。由于分子印迹技术具有许多优点，如有机试剂耐腐蚀性，良好的稳定性，耐高温性和制备简单。因此，在过去的几年中，基于mip与电分析化学传感器相结合的mip电分析化学传感器（mip-ecs）引起了电分析化学领域的热点关注，尤其是小分子污染物的检测。然而，在传统mip-ecs的制备过程中，有着模板分子难洗脱、印迹膜的厚度难控制、再生性差等缺点，限制了分子印迹膜在电分析化学传感器中的应用。这些问题，尤其是分子印迹膜厚度不易控制导致电化学传感器灵敏度降低以及分子印迹膜在洗脱过程中易从电极表面脱落导致稳定性和重现性降低的技术难题，限制了mip_ecs的应用，因此，寻找新的分子印迹聚合物合成方法、新的分子印迹膜电极的修饰方法和分子印迹膜与基底材料的结合方法，来解决mip-ecs的制备及应用难题具有重要的研究意义和市场价值。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种特异性强、制备简单、检测方便、灵敏度高、成本低的四环类抗生素电致化学发光传感器的制备方法，所制备的电致化学发光传感器，制备简单、重现性好、稳定性强，可用于四环类抗生素的快速、灵敏检测。基于此目的，本发明首先在一次性可抛电极上制备了镍铁双金属氮化物纳米片阵列，利用其大的比表面积和对氨基的高吸附活性，以及聚多巴胺的氨基官能团，采用原位生长的方法，相继在镍铁双金属氮化物纳米片阵列上直接相继制备了聚多巴胺薄膜和原位包覆鲁米诺的以四环类抗生素为模板分子的分子印迹聚合物，在将模板分子洗脱以后，原来的模板分子的位置变为了空穴，即洗脱模板分子的分子印迹聚合物，由此，一种四环类抗生素电致化学发光传感器便制备完成。当用于对四环类抗生素进行检测时，将四环类抗生素电致化学发光传感器插入待测溶液中，待测溶液中的四环类抗生素会吸附到nip的空穴中。待测溶液中的四环类抗生素浓度越大，吸附到nip的空穴中四环类抗生素越多。当进行电致化学发光检测时，通过电极的电流强度会随着吸附到nip的空穴中四环类抗生素分子的增多而变小，相应的电致化学发光信号也会随之变小，从而根据电致化学发光的光信号强度减小的程度，能够定性定量待测溶液中的四环类抗生素的浓度。
本发明采用的技术方案如下：
1.一种四环类抗生素电致化学发光传感器的制备方法，所述的四环类抗生素电致化学发光传感器由镍铁双金属氮化物纳米片阵列电极nifen-nanoarray上原位生长无模板分子分子印迹聚合物nip得到的；所述的无模板分子分子印迹聚合物nip是不含有模板分子的分子印迹聚合物；所述的不含有模板分子的分子印迹聚合物是由含模板分子分子印迹聚合物mip经过洗脱模板分子得到的；所述的含模板分子分子印迹聚合物mip是含有模板分子的分子印迹聚合物；所述的模板分子是四环类抗生素；
2.技术方案1中所述的镍铁双金属氮化物纳米片阵列电极nifen-nanoarray的制备方法包括以下制备步骤：
（1）将一次性可抛电极分别使用稀盐酸、无水乙醇和去离子进行超声清洗处理，用以去除一次性可抛电极的氧化层和表面杂质；
（2）称取1~3mmolni(no3)2和fe(no3)3的混合物以及3~9mmol尿素co(nh2)2，将其置入50ml烧杯中，加入30ml去离子水搅拌至澄清，然后转移到50ml聚四氟乙烯反应釜中；
（3）将步骤（1）处理好的一次性可抛电极放入步骤（2）中的反应釜里的溶液中，在100~130℃的温度下反应9~12小时，制备得到镍铁双金属层状氢氧化物纳米片阵列前驱体电极；
（4）将步骤（3）得到的镍铁双金属层状氢氧化物纳米片阵列前驱体电极插入氨水中5~30秒后取出，在氨气环境下，加热至340~400℃并保持4~8小时后，继续在氨气环境下自然降到室温，然后将其插入含有多巴胺和过硫酸胺和硝酸钴的磷酸盐缓冲溶液pbs中，在20~40℃的温度下反应4~6小时后，取出并用去离子水浸洗2~4次，制备得到镍铁双金属氮化物纳米片阵列电极nifen-nanoarray；
所述的一次性可抛电极选自下列电极之一：泡沫镍、泡沫铜、纯镍片、纯铜片、纯钴片、纯硅片、导电碳布；所述的ni(no3)2和fe(no3)3的混合物中镍和铁的摩尔比为1：1；
所述的含有多巴胺和过硫酸胺和硝酸钴的磷酸盐缓冲溶液pbs中：多巴胺浓度为2~5mg/ml，过硫酸胺的浓度为3~8mg/ml，磷酸盐缓冲溶液pbs的浓度为0.1mol/l，ph值为7.2~8.5；
3.技术方案1中所述的nifen-nanoarray原位生长的含模板分子分子印迹聚合物mip的制备方法包括以下制备步骤：
（1）分别称取0.25~0.45mmol模板分子和3~5mmol2-甲基丙烯酸maa于安倍瓶中，加入8~15ml乙腈，超声30min至全部溶解；
（2）将15~25mmol乙二醇二甲基丙烯酸酯edma加入到步骤（1）的溶液中，超声30min至混合均匀，得到前驱体混合溶液；
（3）将技术方案2中制备的nifen-nanoarray夹到旋转搅拌器上，插入到步骤（2）中的前驱体混合溶液中，在n2环境和水浴20~40℃的温度下，以5~200转/秒的速度旋转搅拌，同时以1~20滴/秒的速度向混合溶液中同时滴加1mmol/l的鲁米诺溶液1~3ml和1mmol偶氮二异丁腈aibn进行引发聚合，在nifen-nanoarray上得到原位生长的含模板分子分子印迹聚合物mip；
4.技术方案1中所述的nifen-nanoarray原位生长的无模板分子分子印迹聚合物nip的制备步骤为：将技术方案3中得到的在nifen-nanoarray上原位生长的含模板分子分子印迹聚合物mip浸没于洗脱剂中，在室温下将模板分子进行洗脱5~20min，然后取出，即制得无模板分子分子印迹聚合物nip；所述的洗脱剂为甲酸和甲醇的混合液，其中甲酸与甲醇的体积比为9:(1~5)；
5.技术方案1中所述的四环类抗生素电致化学发光传感器的制备步骤为：将技术方案2~4中制得的在nifen-nanoarray上原位生长的无模板分子分子印迹聚合物nip，用去离子水浸洗2~4次，室温下晾干，即制得四环类抗生素电致化学发光传感器；
6.采用技术方案1~5所述的技术方案所制备的四环类抗生素电致化学发光传感器，应用于四环类抗生素的检测，包括如下应用步骤：
（1）标准溶液配制：配制一组包括空白标样在内的不同浓度的四环类抗生素标准溶液；
（2）工作电极修饰：将四环类抗生素电致化学发光传感器为工作电极，插入步骤（1）中配制的不同浓度的四环类抗生素标准溶液，孵化10min后取出，用去离子水浸洗3次；
（3）工作曲线绘制：将饱和甘汞电极电极作为参比电极，铂丝电极作为对电极，与步骤（2）所修饰好的工作电极组成三电极系统，连接到电致化学发光检测设备上；在电解槽中先后加入15ml磷酸盐缓冲溶液pbs和1ml2mmol/l的过氧化氢（h2o2）溶液；用双阶脉冲伏安法对组装的工作电极施加循环电压，检测电致化学发光的光信号强度；空白标样的响应光信号强度记为a0，含有不同浓度的四环类抗生素标准溶液的响应光信号强度记作ai，响应光信号强度降低的差值为δa=a0-ai，δa与四环类抗生素标准溶液的质量浓度c之间成线性关系，绘制δa－c工作曲线；所述的磷酸盐缓冲溶液pbs浓度为10mmol/l，其ph值为7.4；所述的双阶脉冲伏安法检测时的参数设置为：初始电位为0v，脉冲电位为0.9v，脉冲时间为0.1s，脉冲周期为30s；
（4）待测样品中四环类抗生素的检测：用待测样品代替步骤（1）中的四环类抗生素标准溶液，按照步骤（2）和（3）中的方法进行检测，根据响应光信号强度降低的差值δa和工作曲线，得到待测样品中四环类抗生素的含量。
7.技术方案1~6所述的四环类抗生素是下列四环类抗生素之一：金霉素、土霉素、四环素、甲烯土霉素、强力霉素、二甲胺基四环素。
本发明的有益成果
（1）本发明所述的四环类抗生素电致化学发光传感器制备简单，操作方便，实现了对样品的快速、灵敏、高选择性检测，并且成本低，可应用于便携式检测，具有市场发展前景；
（2）本发明首次在镍铁双金属氮化物纳米片阵列电极nifen-nanoarray上原位生长分子印迹聚合物，一方面利用nifen-nanoarray大的比表面积可以生长更多、更均匀的分子印迹聚合物，而且nifen-nanoarray具有优良的电子传递能力，从而大大提高检测灵敏度；另一方面，nifen-nanoarray对过氧化氢具有电催化活性，可以无需加入辣根过氧化物酶即可实现鲁米诺-过氧化氢电致化学发光体系的稳定、高效反应，使得所制备的传感器无需考虑生物酶失活问题，从而使得传感器的使用以及存放能够更加稳定和条件宽松，从而在进一步降低信号背景、提高检测灵敏度的同时，大大降低了检测成本并减少环境污染；
（3）本发明利用氮化物对氨基的高吸附活性以及纳米阵列电极大的比表面积与多巴胺相结合，使得多巴胺在镍铁双金属氮化物纳米片阵列表面原位聚合时，在形成足够薄的聚多巴胺薄膜的同时，均匀覆盖到镍铁双金属氮化物纳米片阵列上，从而为下一步更多更好的聚合分子印迹聚合物做好铺垫；之后利用聚多巴胺对分子印迹聚合物上富含的氨基的强的吸附连接作用，再巧妙地使用nifen-nanoarray作为搅拌器，在分子印迹前驱体混合溶液中进行浸入搅拌，通过控制搅拌速度、聚合反应引发剂的滴加速度和聚合反应温度，在nifen-nanoarray表面直接原位生长可以控制膜厚度的分子印迹聚合物，一方面使得nifen-nanoarray可以牢固负载分子印迹聚合物及鲁米诺，从而显著提高所制备的电致化学发光的稳定性和重现性；另一方面可以有效控制分子印迹聚合物在电极表面的成膜厚度，解决了无法控制分子印迹膜在电极表面成膜厚度无法控制从而导致重现性差的技术难题；此外，更由于本发明的制备方法对成膜厚度的有效控制和鲁米诺的原位定量包覆，可以充分提高分子印迹为基础的电致化学发光的灵敏度和检出限具有重要的科学意义和应用价值。
具体实施方式
实施例1nifen-nanoarray的制备
（1）将一次性可抛电极分别使用稀盐酸、无水乙醇和去离子进行超声清洗处理，用以去除一次性可抛电极的氧化层和表面杂质；
（2）称取1mmolni(no3)2和fe(no3)3的混合物以及3mmol尿素co(nh2)2，将其置入50ml烧杯中，加入30ml去离子水搅拌至澄清，然后转移到50ml聚四氟乙烯反应釜中；
（3）将步骤（1）处理好的一次性可抛电极放入步骤（2）中的反应釜里的溶液中，在100℃的温度下反应12小时，制备得到镍铁双金属层状氢氧化物纳米片阵列前驱体电极；
（4）将步骤（3）得到的镍铁双金属层状氢氧化物纳米片阵列前驱体电极插入含有多巴胺和过硫酸胺的磷酸盐缓冲溶液pbs中，在20℃的温度下反应4小时后，取出并用去离子水浸洗2次，制备得到镍铁双金属氮化物纳米片阵列电极nifen-nanoarray；
其中的一次性可抛电极为泡沫镍；所述的ni(no3)2和fe(no3)3的混合物中镍和铁的摩尔比为1：1；多巴胺浓度为2mg/ml，过硫酸胺的浓度为3mg/ml，磷酸盐缓冲溶液pbs的浓度为0.1mol/l，ph值为7.2。
实施例2nifen-nanoarray的制备
（1）将一次性可抛电极分别使用稀盐酸、无水乙醇和去离子进行超声清洗处理，用以去除一次性可抛电极的氧化层和表面杂质；
（2）称取2mmolni(no3)2和fe(no3)3的混合物以及6mmol尿素co(nh2)2，将其置入50ml烧杯中，加入30ml去离子水搅拌至澄清，然后转移到50ml聚四氟乙烯反应釜中；
（3）将步骤（1）处理好的一次性可抛电极放入步骤（2）中的反应釜里的溶液中，在110℃的温度下反应11小时，制备得到镍铁双金属层状氢氧化物纳米片阵列前驱体电极；
（4）将步骤（3）得到的镍铁双金属层状氢氧化物纳米片阵列前驱体电极插入含有多巴胺和过硫酸胺的磷酸盐缓冲溶液pbs中，在30℃的温度下反应5小时后，取出并用去离子水浸洗3次，制备得到镍铁双金属氮化物纳米片阵列电极nifen-nanoarray；
其中的一次性可抛电极为纯铜片；所述的ni(no3)2和fe(no3)3的混合物中镍和铁的摩尔比为1：1；多巴胺浓度为3.5mg/ml，过硫酸胺的浓度为6.2mg/ml，磷酸盐缓冲溶液pbs的浓度为0.1mol/l，ph值为8.0。
实施例3nifen-nanoarray的制备
（1）将一次性可抛电极分别使用稀盐酸、无水乙醇和去离子进行超声清洗处理，用以去除一次性可抛电极的氧化层和表面杂质；
（2）称取3mmolni(no3)2和fe(no3)3的混合物以及9mmol尿素co(nh2)2，将其置入50ml烧杯中，加入30ml去离子水搅拌至澄清，然后转移到50ml聚四氟乙烯反应釜中；
（3）将步骤（1）处理好的一次性可抛电极放入步骤（2）中的反应釜里的溶液中，在130℃的温度下反应9小时，制备得到镍铁双金属氮化物纳米片阵列前驱体电极；
（4）将步骤（3）得到的镍铁双金属层状氢氧化物纳米片阵列前驱体电极插入含有多巴胺和过硫酸胺的磷酸盐缓冲溶液pbs中，在40℃的温度下反应6小时后，取出并用去离子水浸洗4次，制备得到镍铁双金属层状氢氧化物纳米片阵列电极nifen-nanoarray；
其中的一次性可抛电极为导电碳布；所述的ni(no3)2和fe(no3)3的混合物中镍和铁的摩尔比为1：1；多巴胺浓度为5mg/ml，过硫酸胺的浓度为8mg/ml，磷酸盐缓冲溶液pbs的浓度为0.1mol/l，ph值为8.5。
实施例4四环类抗生素电致化学发光传感器的制备方法
（1）分别称取0.25mmol模板分子和3mmol2-甲基丙烯酸maa于安倍瓶中，加入8ml乙腈，超声30min至全部溶解；
（2）将15mmol乙二醇二甲基丙烯酸酯edma加入到步骤（1）的溶液中，超声30min至混合均匀，得到前驱体混合溶液；
（3）将实施例1中制备的nifen-nanoarray夹到旋转搅拌器上，插入到步骤（2）中的前驱体混合溶液中，在n2环境和水浴20℃的温度下，以200转/秒的速度旋转搅拌，同时以1滴/秒的速度向混合溶液中同时滴加1mmol/l的鲁米诺溶液1ml和1mmol偶氮二异丁腈aibn进行引发聚合，在nifen-nanoarray上得到原位生长的含模板分子分子印迹聚合物mip；
（4）将步骤（3）得到的在nifen-nanoarray上原位生长的含模板分子分子印迹聚合物mip浸没于洗脱剂中，在室温下将模板分子进行洗脱5min，然后取出，即制得无模板分子分子印迹聚合物nip；继续用去离子水浸洗2次，室温下晾干，即制得四环类抗生素电致化学发光传感器；
其中的洗脱剂为甲酸和甲醇的混合液，其中甲酸与甲醇的体积比为9:1。
实施例5四环类抗生素电致化学发光传感器的制备方法
（1）分别称取0.35mmol模板分子和4mmol2-甲基丙烯酸maa于安倍瓶中，加入12ml乙腈，超声30min至全部溶解；
（2）将18mmol乙二醇二甲基丙烯酸酯edma加入到步骤（1）的溶液中，超声30min至混合均匀，得到前驱体混合溶液；
（3）将技术方案2中制备的nifen-nanoarray夹到旋转搅拌器上，插入到步骤（2）中的前驱体混合溶液中，在n2环境和水浴30℃的温度下，以60转/秒的速度旋转搅拌，同时以10滴/秒的速度向混合溶液中同时滴加1mmol/l的鲁米诺溶液2ml和1mmol偶氮二异丁腈aibn进行引发聚合，在nifen-nanoarray上得到原位生长的含模板分子分子印迹聚合物mip；
（4）将步骤（3）得到的在nifen-nanoarray上原位生长的含模板分子分子印迹聚合物mip浸没于洗脱剂中，在室温下将模板分子进行洗脱10min，然后取出，即制得无模板分子分子印迹聚合物nip；继续用去离子水浸洗3次，室温下晾干，即制得四环类抗生素电致化学发光传感器；
其中的洗脱剂为甲酸和甲醇的混合液，其中甲酸与甲醇的体积比为9:3。
实施例6四环类抗生素电致化学发光传感器的制备方法
（1）分别称取0.45mmol模板分子和5mmol2-甲基丙烯酸maa于安倍瓶中，加入15ml乙腈，超声30min至全部溶解；
（2）将25mmol乙二醇二甲基丙烯酸酯edma加入到步骤（1）的溶液中，超声30min至混合均匀，得到前驱体混合溶液；
（3）将技术方案2中制备的nifen-nanoarray夹到旋转搅拌器上，插入到步骤（2）中的前驱体混合溶液中，在n2环境和水浴40℃的温度下，以5转/秒的速度旋转搅拌，同时以20滴/秒的速度向混合溶液中同时滴加1mmol/l的鲁米诺溶液3ml和1mmol偶氮二异丁腈aibn进行引发聚合，在nifen-nanoarray上得到原位生长的含模板分子分子印迹聚合物mip；
（4）将步骤（3）得到的在nifen-nanoarray上原位生长的含模板分子分子印迹聚合物mip浸没于洗脱剂中，在室温下将模板分子进行洗脱20min，然后取出，即制得无模板分子分子印迹聚合物nip；继续用去离子水浸洗4次，室温下晾干，即制得四环类抗生素电致化学发光传感器；
其中的洗脱剂为甲酸和甲醇的混合液，其中甲酸与甲醇的体积比为9:5。
实施例7实施例1~6制备的四环类抗生素电致化学发光传感器，应用于四环类抗生素的检测，步骤如下：
（1）标准溶液配制：配制一组包括空白标样在内的不同浓度的四环类抗生素标准溶液；
（2）工作电极修饰：将四环类抗生素电致化学发光传感器为工作电极，插入步骤（1）中配制的不同浓度的四环类抗生素标准溶液，孵化10min后取出，用去离子水浸洗3次；
（3）工作曲线绘制：将饱和甘汞电极电极作为参比电极，铂丝电极作为对电极，与步骤（2）所修饰好的工作电极组成三电极系统，连接到电致化学发光检测设备上；在电解槽中先后加入15ml磷酸盐缓冲溶液pbs和1ml2mmol/l的过氧化氢（h2o2）溶液；用双阶脉冲伏安法对组装的工作电极施加循环电压，检测电致化学发光的光信号强度；空白标样的响应光信号强度记为a0，含有不同浓度的四环类抗生素标准溶液的响应光信号强度记作ai，响应光信号强度降低的差值为δa=a0-ai，δa与四环类抗生素标准溶液的质量浓度c之间成线性关系，绘制δa－c工作曲线；所述的磷酸盐缓冲溶液pbs浓度为10mmol/l，其ph值为7.4；所述的双阶脉冲伏安法检测时的参数设置为：初始电位为0v，脉冲电位为0.9v，脉冲时间为0.1s，脉冲周期为30s；
（4）待测样品中四环类抗生素的检测：用待测样品代替步骤（1）中的四环类抗生素标准溶液，按照步骤（2）和（3）中的方法进行检测，根据响应光信号强度降低的差值δa和工作曲线，得到待测样品中四环类抗生素的含量。
实施例8实施例1~6制备的四环类抗生素电致化学发光传感器，按照实施例7的检测步骤应用于不同四环类抗生素的检测，线性范围和检测限见表1：
表1四环类抗生素的检测技术指标
实施例9猪尿样品中四环类抗生素的检测
准确移取猪尿样品，加入一定质量浓度的四环类抗生素标准溶液，以未加入四环类抗生素的猪尿样品为空白，进行加标回收实验，以实施例1~6制备的四环类抗生素电致化学发光传感器，按照实施例7的步骤进行检测，测定猪尿样品中四环类抗生素的回收率，检测结果见表2：
表2猪尿样品中四环类抗生素的检测结果
表2检测结果可知，结果的相对标准偏差（rsd）小于3.0%，平均回收率为99.0~100.8%，表明本发明可用于猪尿中多种四环类抗生素的检测，方法的灵敏度高、特异性强，结果准确可靠。
实施例10羊尿样品中四环类抗生素的检测
准确移取一定羊尿样品，加入一定质量浓度的四环类抗生素标准溶液，以未加入四环类抗生素的羊尿样品为空白，进行加标回收实验，以实施例1~6制备的四环类抗生素电致化学发光传感器，按照实施例7的步骤进行检测，测定羊尿样品中四环类抗生素的回收率，检测结果见表3：
表3羊尿样品中四环类抗生素的检测结果
表3检测结果可知，结果的相对标准偏差（rsd）小于3.1%，平均回收率为99.0~101.4%，表明本发明可用于羊尿中多种四环类抗生素的检测，方法的灵敏度高、特异性强，结果准确可靠。