用于有机磷农药检测的生物传感器及其制备与应用的制作方法

本发明涉及电化学领域，尤其涉及一种用于有机磷农药检测的生物传感器及其制备与应用。

背景技术：

过去几十年来，农药，特别是有机磷农药(ops)，已被广泛用于保护农作物免受昆虫侵害。然而，有机磷农药可以抑制神经突触-乙酰胆碱酯酶(ache)中的酶，导致人体内乙酰胆碱的积累，过度刺激其在突触中的受体并最终损害神经系统，对人类和动物造成危害。因此，高效简单和快速检测各种样品中的ops的变得越来越必要。

目前应用的测定ops水平的方法中，电化学方法具有可靠性高，仪器操作和使用方法简单，结果获取的速度快，灵敏度高以及能够对复杂样品进行测定。但是，当前已经报道过的生物传感器主要的技术特征是在玻碳电极表面涂抹壳聚糖溶液，空气中放置干燥后加上乙酰胆碱酯酶，存在在灵敏度低、检测范围小、稳定性差等缺点。传感器由于不能很好的放大乙酰胆碱酯酶水解乙酰硫代胆碱的电信号，以及不能很好的固定生物酶、长时间保持酶的催化活性而使传感器的灵敏度和稳定性较差。

技术实现要素：

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种用于有机磷农药检测的生物传感器及其制备与应用。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明采用如下技术方案：本发明第一方面提供一种用于有机磷农药检测的生物传感器，包括工作电极、参比电极和对电极，所述工作电极为依次在基底电极表面修饰银纳米线、石墨烯、二氧化钛/壳聚糖复合材料、壳聚糖，而后固定乙酰胆碱酯酶和牛血清白蛋白混合物所得。

进一步的，每平方毫米的工作电极上，所述银纳米线质量为0.0355μg～0.071μg。.可选的，为0.071μg。

进一步的，每平方毫米的工作电极上，所述石墨烯的质量为0.007μg～0.014μg。可选的，为0.014μg。

进一步的，所述二氧化钛/壳聚糖复合材料是由以下方法制成后修饰到银纳米线-石墨烯修饰的电极表面：

a.将钛酸四正丁酯、冰醋酸、去离子水、无水乙醇混合均匀得二氧化钛溶胶凝胶；

b.将壳聚糖溶于水得壳聚糖水溶液；

c.将所述壳聚糖水溶液与所述二氧化钛溶胶凝胶混合制得二氧化钛/壳聚糖复合材料。

优选的，步骤a.中，钛酸四正丁酯、冰醋酸、去离子水、无水乙醇的摩尔比为1：1：4：50。

优选的，步骤b.中，以壳聚糖水溶液的总量为基准计，所述壳聚糖的浓度为0.002g/ml。

优选的，步骤c.中，用于制得二氧化钛/壳聚糖复合材料的二氧化钛溶胶凝胶与所述壳聚糖水溶液的混合体积比为99：1～95：5。包括99：1～97：3、97：3～95：5。具体的，可以是99：1、98：2、97：3、96：4、95：5。优选的，为99：1。

进一步的，所述壳聚糖膜是通过在壳聚糖水溶液中给工作电极通电电镀到电极表面得到的。

优选的，所述壳聚糖膜的电镀在壳聚糖体积分数为0.2％的壳聚糖水溶液中进行，其中，以壳聚糖水溶液总量为基准计。

优选的，电镀条件为电镀电压-2.5v，时间10s～25s。包括10s～15s、15s～20s、20s～25s。例如，可以是10s、11s、12s、13s、14s、15s、16s、17s、18s、19s、20s、21s、22s、23s、24s、25s；优选的，为20s。

进一步的，所述乙酰胆碱酯酶和牛血清白蛋白的混合物是由以下方法制成后修饰到银纳米线-石墨烯-二氧化钛/壳聚糖复合材料-壳聚糖膜修饰的电极表面：

将乙酰胆碱酯酶溶解在牛血清白蛋白水溶液中得到乙酰胆碱酯酶和牛血清白蛋白的混合物。

优选的，以乙酰胆碱酯酶和牛血清白蛋白的混合物为基准计，所述乙酰胆碱酯酶和牛血清白蛋白的浓度比为3mg/ml～5mg/ml：10mg/ml。例如，可以是3mg/ml：10mg/ml、4mg/ml：10mg/ml、5mg/ml：10mg/ml。再优选的，为5mg/ml：10mg/ml。

进一步的，所述基底电极选自玻碳电极。

优选的，所述基底电极直径为3mm。

进一步的，所述生物传感器中的参比电极和对电极与工作电极构成三电极系统。

优选的，所述参比电极选自饱和甘汞电极或银氯化银电极(ag/agcl)之任意一种；更优选的，所述参比电极为银/氯化银(ag/agcl)电极。

优选的，所述对电极为铂丝电极。

本发明第二方面提供一种生物传感器的工作电极的制备方法，所述方法为依次在基底电极表面修饰银纳米线、石墨烯、二氧化钛/壳聚糖复合材料，壳聚糖膜，而后固定乙酰胆碱酯酶和牛血清白蛋白的混合物。

进一步的，所述工作电极的制备方法包括如下步骤：

(1)制备二氧化钛/壳聚糖复合材料：

d.将钛酸四正丁酯、冰醋酸、去离子水、无水乙醇混合均匀得二氧化钛溶胶凝胶；

e.将壳聚糖溶于水得壳聚糖水溶液；

f.将所述壳聚糖水溶液与所述二氧化钛溶胶凝胶混合制得二氧化钛/壳聚糖复合材料。

(3)工作电极的修饰及功能化：

g.基底电极表面处理：将基底电极表面进行抛光处理，使其表面光洁；

h.修饰银纳米线、石墨烯：将银纳米线溶液、石墨烯溶液依次涂到步骤g.中处理好的基底电极表面，晾干，得到银纳米线-石墨烯修饰电极；

i.修饰二氧化钛/壳聚糖复合材料：将步骤(1)中制备的二氧化钛/壳聚糖复合材料涂到所述银纳米线-石墨烯修饰电极，晾干，电镀壳聚糖膜，得到银纳米线-石墨烯-二氧化钛/壳聚糖复合材料-壳聚糖修饰电极；

j.固定乙酰胆碱酯酶和牛血清白蛋白的混合物：在所述银纳米线-石墨烯-二氧化钛/壳聚糖复合材料-壳聚糖修饰电极上加乙酰胆碱酯酶和牛血清白蛋白的混合物，晾干，即得工作电极。

进一步的，所述壳聚糖的分子式(c6h11no4)n，单元体的分子量为161.2。

优选的，步骤d.中，钛酸四正丁酯、冰醋酸、去离子水、无水乙醇的摩尔比为1：1：4：50；

优选的，步骤e.中，以壳聚糖水溶液的总量为基准计，所述壳聚糖的浓度为0.002g/ml。

优选的，步骤f.中，用于制得二氧化钛/壳聚糖复合材料的二氧化钛溶胶凝胶与所述壳聚糖水溶液的混合体积比为99：1～95：5。包括99：1～97：3、97：3～95：5，具体的，可以是99：1、98：2、97：3、96：4、95：5。优选的，为99：1。

优选的，步骤g.中，所述基底电极选自玻碳电极。进一步的，所述基底电极直径为3mm。

优选地，步骤g.中，可采用氧化铝粉对所述基底电极进行抛光处理。

优选的，步骤h.中，以银纳米线水溶液的总量为基准计，所述银纳米线浓度为1mg/ml～2mg/ml。包括1mg/ml～1.5mg/ml、1.5mg/ml～2mg/ml。具体的，可以包括1mg/ml、1.2mg/ml、1.4mg/ml、1.5mg/ml、1.6mg/ml、1.8mg/ml、2mg/ml。优选的，为2mg/ml。以石墨烯水溶液的总量为基准计，所述石墨烯的浓度为0.2mg/ml～0.4mg/ml。包括0.2mg/ml～0.3mg/ml、0.3mg/ml～0.4mg/ml。优选的，为0.4mg/ml。

优选的，步骤i.中，所述壳聚糖膜的电镀在壳聚糖体积分数为0.2％的壳聚糖水溶液中进行，其中，以壳聚糖水溶液总量为基准计。

优选的，步骤i.中，电镀条件为电镀电压-2.5v，时间10s～25s。包括10s～15s、15s～20s、20s～25s。例如，可以是10s、11s、12s、13s、14s、15s、16s、17s、18s、19s、20s、21s、22s、23s、24s、25s。优选的，为20s。

优选的，步骤j.中，以乙酰胆碱酯酶和牛血清白蛋白混合物总量为基准计，乙酰胆碱酯酶和牛血清白蛋白浓度比为：3mg/ml～5mg/ml：10mg/ml。例如，可以是3mg/ml：10mg/ml、4mg/ml：10mg/ml、5mg/ml：10mg/ml。优选的，为5mg/ml：10mg/ml。

本发明第三方面提供一种用于有机磷农药检测的生物传感器，由上述方法制得。

本发明第四方面提供如本发明第一方面或第三方面所述生物传感器在检测有机磷农药中的用途。

本发明第五方面，提供一种检测有机磷农药的方法，为采用如发明第一方面或第三方面所述生物传感器对样品中的有机磷农药进行检测。

本发明第一方面提供的生物传感器，将其中的乙酰胆碱酯酶换成其他生物酶，就可以检测其他底物，不需要对其结构进行改造。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

(1)引入石墨烯和银纳米线两种纳米线材料，有效的放大传感信号，提高传感器的灵敏度。

(2)使用氧化钛-壳聚糖混合材料，既可以为生物酶的固定提供良好的支撑，又可以很好的保持酶的活性。提高酶的固定效率，也进一步提高传感器的灵敏度和稳定性。

(3)所有使用的材料都是具有良好生物兼容性的材料，不会影响酶的活性，并且可以使酶的活性长期稳定保持。

本发明所述生物传感器具有良好的灵敏度、特异性、重复性及稳定性。

附图说明

图1：本发明所述的生物传感器的工作电极的制备流程图。

图2：本发明所述的生物传感器的稳定性检测结果图。

图3：本发明所述的生物传感器的灵敏性检测结果图。

图4：本发明所述实施例1中的生物传感器实际应用中dpv检测结果图。其中a曲线是未浸泡菜叶样品的电极的测试结果，b曲线是经过浸泡处理的测试结果。

图5：本发明所述实施例4种类1中的生物传感器实际应用中dpv检测结果图。其中a曲线是未浸泡菜叶样品的电极的测试结果，b曲线是经过浸泡处理的测试结果。

图6：本发明所述实施例4种类2中的生物传感器实际应用中dpv检测结果图。其中a曲线是未浸泡菜叶样品的电极的测试结果，b曲线是经过浸泡处理的测试结果。

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

须知，下列实施例中未具体注明的工艺设备或装置均采用本领域内的常规设备或装置；所有压力值和范围都是指绝对压力。

此外应理解，本发明中提到的一个或多个方法步骤并不排斥在所述组合步骤前后还可以存在其他方法步骤或在这些明确提到的步骤之间还可以插入其他方法步骤，除非另有说明；还应理解，本发明中提到的一个或多个设备/装置之间的组合连接关系并不排斥在所述组合设备/装置前后还可以存在其他设备/装置或在这些明确提到的两个设备/装置之间还可以插入其他设备/装置，除非另有说明。而且，除非另有说明，各方法步骤的编号仅为鉴别各方法步骤的便利工具，而非为限制各方法步骤的排列次序或限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容的情况下，当亦视为本发明可实施的范畴。

实施例1制备生物传感器

1.试剂与仪器

1.1试剂

乙酰胆碱酯酶(取自电鳗)，乙酰硫代胆碱来自sigma公司，壳聚糖(高粘度，>400mpa.s)，牛血清白蛋白来自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，其他实验中所用到的试剂(分析纯)均来自国药集团化学试剂有限公司。

2.工作电极的制备

具体步骤如图1所示：

2.1制备二氧化钛/壳聚糖复合材料：钛酸四正丁酯、冰醋酸、去离子水、无水乙醇按照摩尔比1：1：4：50的比例混合均匀得氧化钛溶胶凝胶；壳聚糖1g溶于100ml冰醋酸体积分数为1％的冰醋酸水溶液，持续搅拌得澄清透明的壳聚糖水溶液，所得壳聚糖溶液为质量分数1％的水溶液；将壳聚糖水溶液用去离子水稀释至0.002％，取1体积壳聚糖水溶液与99体积氧化钛溶胶凝胶混合，得氧化钛-壳聚糖二氧化钛/壳聚糖复合材料。

2.2工作电极的修饰及功能化：

2.2.1玻碳电极表面处理：玻碳电极(gce)的直径为3mm，在使用前分别用0.3μm和0.05μm的氧化铝粉抛光至镜面，随后用去离子水，超声清洗。最后用去离子水冲洗干净，在室温下氮气干燥。

2.2.2修饰银纳米线、石墨烯：将4μl浓度为2mg/ml的银纳米线水溶液、4μl浓度为0.4mg/ml的石墨烯水溶液依次小心地滴涂在处理干净的玻碳电极表面。然后，在室温下将修饰的玻碳电极过真空干燥(不过夜)得到银纳米线-石墨烯修饰电极。

2.2.3修饰二氧化钛/壳聚糖复合材料：将预先制备好的二氧化钛/壳聚糖复合材料(4μl)小心涂到银纳米线、石墨烯修饰电极表面，然后，在室温下(不过夜)，晾干形成银纳米线、石墨烯、二氧化钛/壳聚糖复合材料修饰电极表面；然后放入壳聚糖浓度为0.2％的壳聚糖水溶液中，在-2.5v电压下，电镀20秒，在电极形成壳聚糖膜，得到银纳米线-石墨烯-二氧化钛/壳聚糖复合材料-壳聚糖修饰电极；

2.2.4固定乙酰胆碱酯酶和牛血清白蛋白混合物：在所述银纳米线-石墨烯-二氧化钛/壳聚糖复合材料-壳聚糖修饰电极上加乙酰胆碱酯酶和牛血清白蛋白浓度比为：5mg/ml：10mg/ml的乙酰胆碱酯酶和牛血清白蛋白混合物，湿气环境中过夜，(此处要过夜)晾干，即得工作电极。

实施例2生物传感器性能分析

1.稳定性实验

1.1试剂

乙酰胆碱酯酶(取自电鳗)，乙酰硫代胆碱来自sigma公司，壳聚糖(高粘度，>400mpa.s)，牛血清白蛋白来自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，其他实验中所用到的试剂(分析纯)均来自国药集团化学试剂有限公司。

1.2检测仪器

mchi660e电化学工作站购自上海辰华仪器有限公司。

1.3电化学测量方法

电化学实验采用差分脉冲伏安法(dpv)。dpv检测中，底液为1mm的atcl(乙酰硫代胆碱)/1xpbs(ph7.0)缓冲液，检测电压0.2v至1.0v，脉冲周期为0.02s，振幅0.05v，脉冲宽度为0.005s，静置时间为10min。所有的实验都在室温(25摄氏度)下进行。

1.4检测原理

乙酰胆碱酯酶可以催化分解乙酰硫代胆碱，产物硫代胆碱会发生不可逆的氧化。利用差分脉冲伏安法可以表征该催化分解过程中的产物，会在0.6v附近产生一个明显的氧化峰。同一个电极，其稳定性可以表现在，多次不同时间的测量结果一致。

1.5实验步骤

制作好的电极，首先在pbs缓冲液中用循环伏安法循环测试，直至出现稳定的测试结果，再用1mm的atcl(溶剂也是pbs缓冲液)进行dpv测试。dpv测试的孵化时间为10分钟，测试环境为室温环境。每次测试三组数据，测试完成后将电极浸泡再pbs缓冲液中，放置与4摄氏度的环境中保存。随后，每过4天取出电极，待其温度恢复至室温，继续测试三组dpv。

1.6结果分析

如图2所示，每条曲线都在0.6v附近有明显的氧化峰，表明电极已经催化了底物，且不同时间的测试结果几乎一致，表明不同时间电极的催化水平都是几乎一致的。由此可知，将传感器放在4摄氏度的环境保存一个月，其对乙酰胆碱的催化能力无明显变化。

2.灵敏性实验

2.1试剂

乙酰胆碱酯酶(取自电鳗)，乙酰硫代胆碱来自sigma公司，壳聚糖(高粘度，>400mpa.s)，牛血清白蛋白来自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，其他实验中所用到的试剂(分析纯)均来自国药集团化学试剂有限公司。

2.2检测仪器

chi660e电化学工作站购自上海辰华仪器有限公司。

2.3检测原理

根据米氏方程的双倒数模型

来表征传感器的对底物乙酰胆碱的催化性能。其中icat是dpv的氧化峰峰值电流，catcl是底物浓度，km是米氏常数。根据数据拟合的线性方程来计算km。

2.4实验步骤

将制作好的电极，先在pbs缓冲液中，用cv(循环伏安法)持续循环测试，直至出现稳定的测试结果；之后在不同浓度的底物底物中dpv测试，每个浓度测试三次；测试的结果，选择每组曲线的氧化峰峰值电流以及每组曲线对应的底物浓度数据，拟合2.3的米氏双倒数方程，计算km的数值。

2.5结果分析

如图3所示，由图中所得的数据，将每个曲线的氧化峰峰值电流及其对应的底物浓度取倒数，进行线性方程的拟合，再依据2.3中方程，计算得km的值为0.315mm，km值小，灵敏度高。

实施例3传感器运用于实际样品检测

(一)样品前处理：购买的新鲜蔬菜菜叶，洗净干燥后，剪碎研磨，取研磨液离心，取上清液用pbs缓冲液稀释十倍待用。

(二)检测：在实际样品中添加少量的ddvp；将实施例1中电极浸入样品中孵化10分钟；取出电极，在1mm浓度的atcl中dpv检测。

(三)检测原理：有机磷农药对乙酰胆碱酯酶有很强的抑制作用，经过抑制的乙酰胆碱酯酶其催化性能会得到降低。

(四)结果分析：如图4所示，a曲线是未浸泡菜叶样品的电极的测试结果，b曲线是经过浸泡处理的测试。结果表明经过浸泡处理，曲线的氧化峰峰值电流明显降低，表明电极的催化性能经浸泡处理后明显降低。根据公式inhibit％＝(1-icat’/icat⁰)×100％算得抑制率为29.58％。

实施例4

本发明还参照实施例1制备了其他种类的生物传感器，并检测了其稳定性及灵敏性，而后进行了实际样品检测实验。

种类1、与实施例1中的生物传感器的不同之处在于：步骤2.1中，取5体积壳聚糖水溶液与95体积氧化钛溶胶凝胶混合，得氧化钛-壳聚糖二氧化钛/壳聚糖复合材料；步骤2.2.2中，将4μl浓度为1mg/ml的银纳米线水溶液、4μl浓度为0.2mg/ml的石墨烯水溶液依次小心地滴涂在处理干净的玻碳电极表面；步骤2.2.3中，电镀10s；步骤2.2.4中，加在所述银纳米线-石墨烯-二氧化钛/壳聚糖复合材料-壳聚糖修饰电极上加乙酰胆碱酯酶和牛血清白蛋白浓度比为：3mg/ml：10mg/ml的乙酰胆碱酯酶和牛血清白蛋白混合物；其余皆相同。

(1)采用与实施例2相同的方法检测种类1生物传感器的其稳定性及灵敏性，km的值为3.625mm。

(2)采用与实施例3相同的方法使用种类1进行了实际样品检测实验，结果如图5所示，计算得抑制率为16.10％。

种类2、与实施例1中的生物传感器的不同之处在于：步骤2.1中，取3体积壳聚糖水溶液与97体积氧化钛溶胶凝胶混合，得氧化钛-壳聚糖二氧化钛/壳聚糖复合材料；步骤2.2.2中，将4μl浓度为1.5mg/ml的银纳米线水溶液、4μl浓度为0.3mg/ml的石墨烯水溶液依次小心地滴涂在处理干净的玻碳电极表面；步骤2.2.3中，电镀25s；步骤2.2.4中，加在所述银纳米线-石墨烯-二氧化钛/壳聚糖复合材料-壳聚糖修饰电极上加乙酰胆碱酯酶和牛血清白蛋白浓度比为：4mg/ml：10mg/ml的乙酰胆碱酯酶和牛血清白蛋白混合物；其余皆相同。

(1)采用与实施例2相同的方法检测种类1生物传感器的其稳定性及灵敏性，km的值为1.985mm。

(2)采用与实施例3相同的方法使用种类1进行了实际样品检测实验，结果如图6所示，计算得抑制率为21.15％

综上所述，存储实验证明，将传感器放在4摄氏度的环境保存一个月，其对乙酰胆碱的催化能力无明显变化。灵敏性实验证明，本传感器的灵敏性较高。在实际检测中，效果良好。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。