一种猪瘟病毒抗体的可视化快速检测试剂盒及其应用的制作方法

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种猪瘟病毒抗体的可视化快速检测试剂盒及其应用。

背景技术：

猪瘟是一种具有高度传染性的疫病，是威胁养猪业的主要传染病之一，其特征是急性，呈败血性变化，实质器官出血，坏死和梗死，中国大部分省都有发生。猪瘟在一年四季都可能发生，以春夏多雨季节为多。其具有传染性强，流行快速的特点。易感动物在抵抗力较弱的情况下容易死亡，进而会给养殖户造成巨大的经济损失，严重阻碍养殖业的发展。

猪瘟的病原是披盖病毒科，瘟病毒属(pestivirus)中的猪瘟病毒。主要通过直接接触，或由于接触污染的媒介物而发病。消化道、鼻腔粘膜和破裂的皮肤均是感染途径。目前对于猪瘟病毒抗体的诊断方法和疫苗免疫效果的评价方法多是在实验室内完成，不适合基层检测。因而需要建立更为灵敏、快捷和简便的可视化的检测方法。

技术实现要素：

有鉴于背景技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种猪瘟病毒抗体的可视化快速检测试剂盒，包括包被酶标板、洗涤液、样品稀释液、底物显色液、酶标二抗、终止液、标准阳性血清和标准阴性血清，所述包被酶标板以猪瘟病毒蛋白e2为包被抗原，所述包被抗原的包被浓度为1.5～3μg/ml。

优选的，所述包被酶标板由封闭液封闭包被抗原制得，所述封闭液为包括40～60g/l脱脂奶粉的pbst缓冲液，所述封闭的时间为15～25min；所述包被酶标板置于2～6℃保存。

优选的，所述洗涤液为包括0.04％～0.06％体积浓度的吐温-20的磷酸盐缓冲液，ph值为7～7.4。

优选的，所述样品稀释液为包括40～60g/l脱脂奶粉的磷酸盐缓冲液。

优选的，所述底物显色液为tmb溶液。

优选的，所述酶标二抗的稀释倍数为1：(15000～25000)。

优选的，所述终止液为0.8～1.2％体积浓度的sds或者1～3mol/l的硫酸溶液。

本发明还提供了上述可视化快速检测试剂盒在对猪瘟病毒抗体进行接种疫苗后的检测中的应用。

优选的，所述应用包括如下步骤：

(1)取待检测的离体样品，用所述样品稀释液对离体样品进行稀释，所述稀释的倍率为1：(30～50)，得到稀释样品；

(2)将所述稀释样品加入到包被酶标板中，20～25℃孵育30～40min，弃反应液，洗涤液洗板，干燥；

(3)将所述酶标二抗加入到步骤(2)所述干燥后的酶标板中，20～25℃孵育30～40min，弃反应液，洗涤液洗板，干燥；

(4)将所述底物显色液加入到步骤(3)所述干燥后的酶标板中，20～25℃显色反应10～20min，判断检测结果。

有益效果：本发明提供了一种猪瘟病毒抗体的可视化快速检测试剂盒，包括包被酶标板、洗涤液、样品稀释液、底物显色液、酶标二抗、终止液、标准阳性血清和标准阴性血清，所述包被酶标板以猪瘟病毒蛋白e2为包被抗原，所述包被抗原的包被浓度为1.5～3μg/ml。本发明提供的试剂盒能用于检测猪瘟病毒的抗体，通过颜色变化来判定结果，具有高效、特异性强、重复性好的优点。本发明提供的试剂盒操作简便、快速、成本低廉，可在室温下可视化检测，适合于在临床应用中进行推广，为猪瘟病毒抗体的快速检测提供可靠的技术手段。

附图说明

图1为本发明实施例2所述特异性检测实验结果图。

具体实施方式

本发明提供了一种猪瘟病毒抗体的可视化快速检测试剂盒，包括包被酶标板、洗涤液、样品稀释液、底物显色液、酶标二抗、终止液、标准阳性血清和标准阴性血清，所述包被酶标板以猪瘟病毒蛋白e2为包被抗原，所述包被抗原的包被浓度为1.5～3μg/ml。

本发明提供的试剂盒包括包被酶标板。在本发明中，所述包被酶标板以猪瘟病毒为包被抗原，在检测时可以将待测样品中的猪瘟病毒抗体特异性捕获。在本发明中，所述包被抗原为猪瘟病毒蛋白e2，包被浓度为1.5～3μg/ml。本发明对所述猪瘟病毒蛋白e2的来源不作特别限定，本领域常规市售产品均可。

本发明使用封闭液将包被抗原封闭到包被酶标板中。在本发明中，所述封闭液优选为含有脱脂奶粉的pbst缓冲液。所述脱脂奶粉在pbst缓冲液中的浓度优选为40～60g/l，更优选为50g/l。所述封闭的时间优选为15～25min，更优选为20min。本发明对所述pbst缓冲液和所述脱脂奶粉的来源不作特别限定，本领域常规市售产品均可。在本发明的实施例中，所述pbst、脱脂奶粉均购买自sigma。将所述包被抗原封闭到酶标板后，本发明优选对包被酶标板保存。所述保存的温度优选为2～6℃，更优选为4℃；所述保存优选在密封袋中进行。

本发明提供的试剂盒包括酶标二抗。在本发明中，所述酶标二抗能和酶标板上捕获的猪瘟病毒抗体发生特异性的结合，并且能和显色液发生显色反应。在本发明中，所述酶标二抗购于sigma。本发明优选在检测时对酶标二抗进行稀释。在本发明中，所述酶标二抗的稀释倍数优选为1：(15000～25000)，更优选为1：20000。

本发明提供的试剂盒还包括洗涤液、样品稀释液、底物显色液和终止液。在本发明中，所述洗涤液优选为含有吐温-20的磷酸盐缓冲液。所述吐温-20在磷酸盐缓冲液中的体积浓度优选为0.04％～0.06％，更优选为0.05％。所述磷酸盐缓冲液的ph值优选为7～7.4，更优选为7.2。在本发明中，所述样品稀释液优选为含有脱脂奶粉的磷酸盐缓冲液。所述脱脂奶粉在磷酸盐缓冲液中的浓度优选为40～60g/l，更优选为50g/l。在本发明中，所述底物显色液优选为tmb溶液(3,3',5,5'-四甲基联苯胺溶液)购于sigma。在本发明中，所述终止液优选为sds或者硫酸溶液。所述sds的体积百分数优选为0.8％～1.2％，更优选为1％。所述硫酸溶液的浓度优选为1～3mol/l，更优选为2mol/l。本发明对所述磷酸盐缓冲液、吐温-20、tmb溶液、sds溶液的来源不作特别限定，本领域常规市售产品均可。在本发明的实施例中，所述磷酸盐缓冲液、吐温-20、tmb溶液和sds均购买自sigma。

本发明提供的试剂盒还优选包括标准阳性血清和标准阴性血清。所述标准阳性血清为猪瘟病毒阳性猪血清；所述标准阴性血清为猪瘟病毒阴性猪血清；所述标准阳性血清和标准阴性血清可在检测过程中用于对照试验的待检测样品。在本发明的实施例中，所述猪瘟病毒阳性猪血清和猪瘟病毒阴性猪血清均由兰州兽医研究所提供。

本发明提供的试剂盒能用于检测猪瘟病毒的抗体，通过颜色变化来判定结果，具有高效、特异性强、重复性好的优点。

本发明对所述试剂盒的制备方法没有特别限定。各组分采用本发明所述原料配制得到相应浓度的溶液即得。

本发明还提供了上述可视化快速检测试剂盒在对猪瘟病毒抗体进行接种疫苗后的检测中的应用。所述应用优选包括如下步骤：

(1)取待检测的离体样品，用所述样品稀释液对离体样品进行稀释，所述稀释的倍率为1：(30～50)，得到稀释样品；

(2)将所述稀释样品加入到包被酶标板中，20～25℃孵育30～40min，弃反应液，洗涤液洗板，干燥；

(3)将所述酶标二抗加入到步骤(2)所述干燥后的酶标板中，20～25℃孵育30～40min，弃反应液，洗涤液洗板，干燥；

(4)将所述底物显色液加入到步骤(3)所述干燥后的酶标板中，20～25℃显色反应10～20min，判断检测结果。

本发明第(1)步先取待检测的离体样品，用所述样品稀释液对离体样品进行稀释。在本发明中，所述稀释的倍率优选为1：(30～50)，更优选为1：40.稀释后得到稀释样品。

本发明第(2)步将所述稀释样品加入到包被酶标板中孵育。在本发明中，所述孵育的温度优选为20～25℃。所述孵育的时间优选为30～40min，更优选为35min。孵育后弃反应液，洗涤液洗板，所述洗板的次数优选为2～3次。洗板后干燥，所述干燥的方式优选为吸水纸拍干。

本发明第(3)步将所述酶标二抗加入到步骤(2)所述干燥后的酶标板中进一步孵育。在本发明中，所述进一步孵育的温度优选为20-25℃，更优选为25℃。所述进一步孵育的时间优选为30～40min，更优选为40min。进一步孵育后弃反应液，洗涤液洗板，所述洗板的次数优选为2～3次。洗板后干燥，所述干燥的方式优选为吸水纸拍干。

本发明第(4)步将所述底物显色液加入到步骤(3)所述干燥后的酶标板中显色。在本发明中，所述显色的温度优选为20-25℃，更优选为25℃。所述显色反应的时间优选为10～20min，更优选为20min。显色反应结束后判断检测结果。在本发明中，所述检测结果的判断优选通过加入sds终止液，肉眼观察进行判断：蓝色为阳性，无色为阴性。

本发明提供的试剂盒操作简便、快速、成本低廉，可在室温下可视化检测，适合于在临床应用中进行推广，为猪瘟病毒抗体的快速检测提供可靠的技术手段。

下面结合实施例对本发明提供的一种猪瘟病毒抗体的可视化快速检测试剂盒及其应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

1、包被酶标板的制作及样品稀释液、洗涤液、终止液的配制

配制0.05mol/l碳酸盐缓冲液作为包被液：na3abo31.59g，nahco32.93g，加蒸馏水定容至1000ml，ph为9.6。使用包被液稀释猪瘟病毒抗原e2，稀释度为2.0μg/ml。将稀释后的猪瘟病毒抗原加入到酶标板中，每孔加100μl体积。然后用50g/l脱脂奶粉pbst封闭20min，得到包被酶标板。装入密封袋，4℃保存备用。

配制含有50g/l脱脂奶粉的磷酸盐缓冲液，作为样品稀释液；

配制含0.05％tween-20的0.01mol/lph为7.2的磷酸盐缓冲液作为洗涤液：nacl8.5g，nah2po4·2h2o0.356g，nah2po4·12h2o2.772g，将其混合后，再用蒸馏水溶解并定容至1000ml，再向其中加入0.5ml吐温-20；

配制1％的sds或者2mol/l的硫酸溶液作为终止液。

2、样品检测

(1)取待检测血清样品，使用样品稀释液，以1:40倍稀释血清；

(2)取出已包被并封闭好的elisa板条(包被酶标板)，每孔中加入100μl的稀释血清；同时设置添加标准阳性血清和标准阴性血清(a型口蹄疫病毒)的对照组，于室温(20-25℃)孵育1h，弃去孔内液体，每孔用洗涤液洗3次并拍打，弃尽孔内液体；

(3)取酶标二抗(购买sigma)，使用样品稀释液，以1:20000倍稀释酶标二抗。然后将稀释后的酶标二抗加入到酶标板中，每孔中加入100μl，于室温(20-25℃)孵育40min，弃去反应孔中液体，每孔用洗涤液洗3次并拍打，弃尽孔内液体；

(4)向酶标板每孔中加入100μl底物tmb显色液，室温下(20-25℃)避光显色反应20min，加入100μlsds终止液；肉眼观察颜色，蓝色为阳性，无色为阴性。也可以加硫酸终止液，用酶标仪在450nm波长读取各孔od值，判定结果。

实施例2

试剂盒的特异性试验：按实施例1的方法分别检测已知的口蹄疫病毒、乙脑病毒、猪圆环病毒、猪细小病毒、伪狂犬病毒、蓝耳病病毒和猪瘟病毒阳性血清样品，阴性为无色，阳性为蓝色。

检测结果如图1所示。图1从左至右依次为口蹄疫病毒(1号)、猪瘟病毒阳性血清样品(2号)、乙脑病毒(3号)、猪圆环病毒(4号)、猪细小病毒(5号)、伪狂犬病毒(6号)、猪瘟病毒阳性血清样品(7号)和蓝耳病病毒(8号)。图1结果表明：本发明实施例1提供的试剂盒对猪流行性腹泻病毒、口蹄疫病毒、乙脑病毒、猪圆环病毒、猪细小病毒、伪狂犬病毒和蓝耳病病毒阳性血清样品检测结果呈无色，对猪瘟病毒阳性血清样品检测结果呈蓝色。说明本发明的试剂盒用于检测猪瘟病毒的抗体，具有高效、灵敏特异性和重复性均良好的优点。且操作简便、快速、成本低廉，可以在室温下可视化检测，适合于在临床应用中进行推广，为猪瘟病毒抗体的快速检测提供可靠的技术手段。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。