一种心脏肌球蛋白结合蛋白C的定量检测方法及检测试剂盒与流程

本发明涉及生物类免疫体外诊断技术，尤其是涉及一种心脏肌球蛋白结合蛋白c的定量检测方法，本发明还涉及心脏肌球蛋白结合蛋白c的定量检测试剂盒。

背景技术：

急性心肌梗死(acutemyocardialinfarction，ami)是重症心血管疾病，发病原因复杂，近年来其发病率逐年升高，且有年轻化趋势，严重危及患者健康，因此对其进行早期诊治具有重要意义。血清心肌坏死标志物的测定在ami的诊断上发挥重要作用。肌钙蛋白(cardiactroponin，ctn)已经成为诊断ami的首选生物标志物。但是对于心肌炎、肺动脉栓塞等患者，ctn亦会非特异性地升高，且对于发病时间小于6h的患者或缺血症状再发患者，需要重复检测ctn。心脏肌球蛋白结合蛋白c(cardiacmyosinbindingprotein-c，cmybp-c)是心肌细胞特有的粗肌丝结构蛋白，ami时cmybp-c去磷酸化并释放入血，其血液浓度急剧升高，检测血清cmybp-c浓度可以为ami的诊断提供帮助。govindan等的研究提示cmybp-c可以成为一个潜在的心肌坏死标志物，而且其血清浓度较ctn高数倍甚至数十倍，易于检测。

目前，对cmybp-c的检测多采用cmybp-celisa试剂盒，但是存在反应时间长，线性范围窄，灵敏度低的缺陷。cmybp-c免疫化学发光试剂盒则未见报导，因此，提供一种心脏肌球蛋白结合蛋白c的定量检测方法暨制备一种满足临床急性心肌梗死的cmybp-c准确定量检测的试剂盒具有重要的现实意义。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种能准确定量检测心脏肌球蛋白结合蛋白c的方法，本发明同时还提供心脏肌球蛋白结合蛋白c的定量检测试剂盒。

为实现上述目的，本发明可采取下述技术方案：

本发明所述的心脏肌球蛋白结合蛋白c的定量检测方法包括下述步骤：

第一步，取抗体偶联超顺磁微粒与待测样本发生特异性结合反应，得到第一反应物；其中所述的抗体偶联超顺磁微粒为超顺磁微粒与抗cmybp-c单克隆抗体a偶联得到的产物；

第二步，取第一反应物与酶标物发生特异性结合反应，得到第二反应物；其中所述的酶标物为酶与抗cmybp-c单克隆抗体b偶联得到的产物；

第三步，取化学发光底物与第二反应物发生酶促反应，测定发光信号，获得cmybp-c的浓度值。

所述第一步、第二步发生特异性结合反应的温度为37℃，反应时间为5～15min。

所述第三步发生酶促反应的温度为37℃，反应时间为5～15min。

所述抗cmybp-c单克隆抗体a与抗cmybp-c单克隆抗体b均能够识别cmybp-c抗原表位，但抗cmybp-c单克隆抗体a识别抗原的表位与抗cmybp-c单克隆抗体b识别抗原的表位不同。

本发明的检测原理为：当样本中含有抗原cmybp-c时，顺磁微粒偶联抗体与抗原在37℃中进行反应，形成超顺磁微粒偶联抗体—抗原免疫复合物；经过洗涤除去未参加反应的物质，然后再加入抗体偶联的酶结合物，37℃中进行反应，经过洗涤除去未参加反应的抗体偶联的酶结合物，加入与酶对应的化学发光底物，免疫复合物上的酶作用于发光底物，在酶促作用下发光，由全自动化学发光测定仪检测发光信号。

结合上述检测原理，本发明制备了一种定量检测心脏肌球蛋白结合蛋白c的试剂盒：

本发明试剂盒包括抗体偶联酶结合物、化学发光底物和抗体偶联超顺磁微粒、cmybp-c定标品；其中的抗体偶联超顺磁微粒为超顺磁微粒与抗cmybp-c单克隆抗体a偶联得到的产物。

本发明所用的超顺磁微粒为免疫诊断中常用的磁微粒，其粒度为500nm-1um均可，其反应浓度为1～10mg/ml。

本发明采用的超顺磁微粒表面的活性基团为羧基（—cooh）、氨基（—nh2）或苯甲磺酰基。实际制备时，其活性基团优选采用羧基（—cooh），羧基基团的磁微粒在化学交联剂edc（1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐）和nhs（n-羟基琥珀酰亚胺）作用下，与抗cmybp-c单克隆抗体a的氨基基团形成酰胺键而共价结合。

其中用于偶联酶结合物的抗cmybp-c单克隆抗体与偶联磁微粒的抗cmybp-c单克隆抗体为针对cmybp-c不同表位的抗体。

本发明采用的酶结合物为辣根过氧化物酶（hrp）时，化学发光底物采用鲁米诺或异鲁米诺；若酶结合物采用碱性磷酸酶（alp），则化学发光底物采用3-（2-螺旋金刚烷）-4-甲氧基-（3-磷氧酰）-苯基-1，2-二氧环乙烷二钠盐（amppd）。

所述mybp-c定标品为浓度分别为0ng/ml、0.05ng/ml、0.5ng/ml、2ng/ml、10ng/ml和50ng/ml的mybp-c的溶液。

本发明的方法学模式为夹心法，其优点在于：与cmybp-celisa试剂盒相比，本发明的检测方法以及制备的试剂盒可大大提升其检测灵敏度和线性范围。通过对本发明制备的试剂盒进行方法学评价，其分析灵敏度为0.05ng/ml，检测范围0.1-50ng/ml，与临床ami患者具有较高的相关性和符合率。

附图说明

图1是本发明试剂盒定标品的标准曲线图。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明做更加详细的说明，以便于本领域技术人员的理解，但是下述实施例并不限制本发明保护范围。

实施例1制备定量检测心脏肌球蛋白结合蛋白c的试剂盒（酶结合物采用辣根过氧化物酶）

1、制备抗体偶联超顺磁微粒

取表面活性基团为羧基基团的超顺磁微粒（直径为1um～3um），用包被缓冲液(50mmol/l、ph7.6的磷酸盐缓冲液)洗涤5次，加入10%戊二醛活化；洗涤后与稀释至100-500μg/ml的cmybp-c抗体进行包被，震荡反应2h；洗涤，然后再用含有50mmol/l乙酸的ph4.4、0.02mol/l的缓冲液封闭1h；封闭液移除后加入含有0.5%吐温-20、1%bsa、0.1%procline300的ph7.4、0.02mol/l磷酸盐缓冲液进行储存，2～8℃保存备用。

2、制备抗体偶联辣根过氧化物酶（hrp）结合物

称取5mghrp溶解于1ml蒸馏水中，加入0.06mol/lnaio4水溶液(10ml双馏水＋128mgnaio4)0.5ml，混匀，置4℃30min。将上述溶液装入透析袋中，对1mmph4.4的醋酸钠缓冲液透析，4℃过夜；加入含5mg纯化cmybp-c抗体的水溶液1ml，混匀，并装入透析袋，用0.05mol/lph9.5的碳酸盐缓冲液，缓缓搅拌透析6h，使之结合；缓慢加入nabh4溶液(5mg/ml)0.2ml，混匀，置于4℃2h；.在以上溶液中缓慢加入等体积的饱和硫酸铵溶液，混匀，4℃30min，离心，去上清，沉淀以少许0.02mol/lph7.4的pbs溶液复溶，装入透析袋，以同样液体在4℃透析除盐过夜；次日取出离心，以除去不溶物，即得酶－抗体结合物，以0.02mol/lph7.4pbs溶液稀释后，分装成1ml/瓶，低温保存。

3、制备cmybp-c定标品

用标准品缓冲液(10mm磷酸盐缓冲液，1％casein，ph7.4)将人源化mybp-c蛋白配置成浓度为0ng/ml、0.05ng/ml、0.5ng/ml、2ng/ml、10ng/ml和50ng/ml，每瓶1ml分装，经冻干处理后，4℃保存备用。

4、制备化学发光底物

发光底物a液：含0.1m鲁米诺；

发光底物b液：含0.5％h2o2。

实施例2本发明试剂盒的检测方法

采用全自动化学发光免疫分析仪，以实施例1制备的试剂盒为检测工具：仪器依次加入25μl的样品、20μl的cmybp-c抗体包被的磁颗粒以及100μl的辣根过氧化物酶标记的cmybp-c抗体，反应15min后，进行磁分离，仪器将反应混合物送入暗室，依次加入发光底物a液(含0.1m鲁米诺)及b液(含0.5％h2o2)进行发光反应，最后记录发光强度，从标准曲线计算出被测样品的cmybp-c含量。

采用上述方法对cmybp-c定标品进行检测，绘制出的标准曲线如图1所示。

实施例3本发明试剂盒的性能测试

1、灵敏度检测

参照clsiep17-a文件推荐实验方案，计算cmybp-c化学发光免疫试剂盒的灵敏度，求得的灵敏度为0.05ng/ml。

2、线性检测

对浓度为0ng/ml、0.05ng/ml、0.5ng/ml、2ng/ml、10ng/ml和50ng/ml标准品做线性分析，计算线性相关系数，r²＝0.99，该试剂盒对cmybp-c样品检测的线性范围为0.1-50ng/ml。

3、精密度检测

取浓度为0.1ng/ml及20ng/ml两个cmybp-c样品，每个样本每个浓度各做5个平行，用三批试剂盒进行检测，计算试剂盒批内及批间差，结果如下表1、表2、表3。

表10.1ng/ml样品批内精密性

表220ng/ml样品批内精密性

表3批间精密性

表明该试剂盒批内及批间差均小于10％。