牛膝和酒牛膝的UPLC图谱的建立方法及应用与流程

本发明是关于一种建立牛膝和酒牛膝的uplc图谱的方法以及鉴别牛膝与酒牛膝的应用方法。
背景技术：
：牛膝为苋科植物achyranthesbidentatabl.的干燥根。其性平，味苦、酸，归肝、肾经，具有活血通经、补肝肾、强筋骨，利尿通淋，引血(火)下行之功效。始载于《神农本草经》，列为上品，又名百倍，《广雅》称之为牛茎。牛膝药用历史悠久，《本草纲目》记载“其苗方茎暴节……作穗结子……皆贴茎倒生”。陶弘景释名为“其茎有节似牛膝”，即药名相形之义。《本经》谓其“治寒湿痿痹，四肢拘挛，膝痛不可屈伸，逐血气，伤热火烂，堕胎。久服轻身耐老”。牛膝主要活性成分为甾酮、皂苷、多糖以及多肽类化合物，还含有其他成分如黄酮、有机酸、生物碱、甾醇、氨基酸和挥发油等。牛膝酒炙后能增强活血祛瘀、通经止痛的作用。目前对牛膝与酒牛膝的差异研究多集中于甾酮、皂苷、多糖以及有机酸等某一种或几种活性成分的含量变化。有关牛膝指纹图谱的研究报道屡见不鲜，相关文献例如可参见：张留记,孙丹丹,屠万倩,等.不同产地怀牛膝β-蜕皮甾酮含量测定及指纹图谱研究[j].天然产物研究与开发,2013,25(4):500-505+510；赵变,常珍珍,史彪,等.怀牛膝药材的hplc指纹图谱研究[j].中国药房,2011,22(39):3699-3703；杨柳,张颖,匡海学.牛膝各化学拆分组分指纹图谱研究[j].中医药信息,2015,32(6):16-19；张敏敏,赵恒强,周思多.牛膝中齐墩果酸和β-蜕皮甾酮的hplc法含量测定及指纹图谱研究[j].山东科学,2015,28(5):1-6；等等。这些现有技术文献研究多采用hplc分析法，分析时间较长，亦有文献对牛膝不同炮制品中化学成分进行uplc-q-tof/ms分析，但该方法的色谱峰分离度欠佳，操作较为繁琐。技术实现要素：本发明的一个目的在于提供一种牛膝或酒牛膝的uplc图谱的建立方法，该方法分离色谱条件佳，具有良好的重复性和准确性。本发明的另一目的在于提供一种鉴别样品为牛膝或是酒牛膝的方法。一方面，本发明提供了一种牛膝或酒牛膝的uplc图谱的建立方法，该方法包括：供试品溶液的制备：取牛膝或酒牛膝供试品粉末，加入10％甲醇，超声处理，过滤，取滤液，即得供试品溶液；高效液相色谱仪检测：采用waters高效液相色谱仪，对供试品溶液进行检测，建立uplc图谱。根据本发明的具体实施方案，本发明的牛膝或酒牛膝的uplc图谱的建立方法中，供试品溶液的制备过程中，供试品粉末与乙醇的比例为：0.5g供试品粉末：10％甲醇25ml。优选地，所述供试品粉末过三号筛。根据本发明的具体实施方案，本发明的牛膝或酒牛膝的uplc图谱的建立方法中，供试品溶液的制备过程中，超声处理的条件为：功率300w，频率40khz，超声处理30分钟。根据本发明的具体实施方案，本发明的牛膝或酒牛膝的uplc图谱的建立方法中，高效液相色谱仪检测过程中，以watersuplct3为色谱柱。优选地，watersuplct3规格为：2.1×100mm，1.6μm。。根据本发明的具体实施方案，本发明的牛膝或酒牛膝的uplc图谱的建立方法中，高效液相色谱仪检测时，进样量为1μl。根据本发明的具体实施方案，本发明的牛膝或酒牛膝的uplc图谱的建立方法中，高效液相色谱仪检测过程中，柱温为40℃；检测波长为270nm。根据本发明的具体实施方案，本发明的牛膝或酒牛膝的uplc图谱的建立方法中，高效液相色谱仪检测过程中，以乙腈为流动相a，以0.05％甲酸溶液为流动相b，按以下条件梯度洗脱：0～3min，0％→3.5％a；3～5min，3.5％→15％a；5～10.5min，15％→20％a；10.5～15min，20％→38％a；15～17min，38％→100％a；17～17.01min，100％→0％a；17.01～25min，0％a；流速：0.30ml/min。本发明的牛膝或酒牛膝的uplc图谱的建立方法，所制备得到的供试品溶液稳定性好，uplc检测分离度较好，大大缩短了检测时间，并具有良好的重复性和准确性。在本发明的一些实施方案中，比较了牛膝和酒牛膝的uplc图谱，发现5-羟甲基糠醛为牛膝在酒炙中新产生的化合物之一。据此可用于鉴别牛膝或是酒牛膝。从而，另一方面，本发明还提供了一种鉴别样品为牛膝或是酒牛膝的方法，该方法包括：供试品溶液的制备：取牛膝或酒牛膝供试品粉末，加入10％甲醇，超声处理，过滤，取滤液，即得供试品溶液；检测供试品溶液中是否存在5-羟甲基糠醛，检测出5-羟甲基糠醛则鉴别样品为酒牛膝。优选地，所述检测方法为高效液相色谱仪检测法。本发明还提供了一种鉴别样品为牛膝或是酒牛膝的方法，该方法包括：按照本发明所述的牛膝或酒牛膝的uplc图谱的建立方法制备样品的供试品溶液并建立uplc图谱；根据样品的uplc图谱的特征峰，鉴别样品为牛膝或是酒牛膝。本案发明人在研究中，按照本发明所述的方法建立了大量牛膝及酒牛膝的uplc图谱，进行分析研究发现，相比于牛膝，酒牛膝的uplc图谱中，以β-蜕皮甾酮为参照峰，相对保留时间在0.27±10％、0.37±10％、0.41±10％范围内会出现特征峰，具体地，会出现相对峰面积为1.260～13.851(相对保留时间0.27±10％)、0.080～11.361(相对保留时间0.37±10％)和/或0.100～2.671(相对保留时间0.41±10％)范围内的特征峰。据此，根据本发明的具体实施方案，本发明的鉴别样品为牛膝或是酒牛膝的方法可包括：分析uplc图谱中，以β-蜕皮甾酮为参照峰，相对保留时间在0.27±10％至0.41±10％范围内是否出现特征峰，出现一种或多种特征峰则鉴别样品为酒牛膝。优选更具体地，分析uplc图谱中，以β-蜕皮甾酮为参照峰，相对保留时间在0.27±10％、0.37±10％、0.41±10％范围内出现相对峰面积为1.260～13.851、0.080～11.361和/或0.100～2.671范围内的任一特征峰则鉴别样品为酒牛膝。综上所述，本发明提供了牛膝或酒牛膝的uplc图谱的建立方法，所制备得到的供试品溶液稳定性好，uplc检测分离度较好，大大缩短了检测时间，并具有良好的重复性和准确性。本发明还提供了鉴别样品为牛膝或是酒牛膝的方法，该鉴别方法能简便且准确可靠地区分牛膝与酒牛膝。附图说明图1为27批不同来源/批次牛膝药材重叠色谱图。图2为牛膝药材对照特征图谱。其中，峰5(s)：β-蜕皮甾酮。图3为27批酒牛膝饮片重叠色谱图。图4为酒牛膝饮片对照特征图谱。其中，峰5(s)：β-蜕皮甾酮。具体实施方式下面通过具体实施例对本发明的方法进行说明，以使本发明技术方案更易于理解、掌握，但本发明并不局限于此。实施例11试剂材料仪器：waters超高效液相色谱仪(沃特世公司，watersh-class)，pda检测器(沃特世公司)；empower工作站；万分之一天平(梅特勒-托利多公司，me204e)；百万分之一天平(梅特勒-托利多公司，xp26)；超纯水机(默克公司，milli-qdirect8/16system)；超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司，kq5500de)；uplct3(2.1×100mm，1.6μm)，电陶炉(杭州九阳，h22-x3)。试剂：乙醇(天津市富宇精细化工有限公司)、甲醇(天津市富宇精细化工有限公司)、甲酸(天津市科密欧化学试剂有限公司)、乙腈(默克股份有限公司)、甲醇(默克股份有限公司)为色谱级；水为超纯水(默克股份有限公司，milli-qdirect)，黄酒。试药：β-蜕皮甾酮(中国食品药品检定研究院，含量：98.40％，批号：111638-201706)。2方法与结果2.1牛膝uplc特征图谱2.1.1色谱条件以watersuplct3(2.1×100mm，1.6μm)为色谱柱；进样量：1μl；柱温：40℃；检测波长：270nm；以乙腈为流动相a，以0.05％甲酸溶液为流动相b，按梯度洗脱(0～3min，0％→3.5％a；3～5min，3.5％→15％a；5～10.5min，15％→20％a；10.5～15min，20％→38％a；15～17min，38％→100％a；17～17.01min，100％→0％a；17.01～25min，0％a)，流速：0.30ml/min。2.1.2对照品溶液的制备取β-蜕皮甾酮对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含β-蜕皮甾酮25μg溶液，即得。2.1.3供试品溶液的制备取本品粉末(过三号筛)约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入10％甲醇25ml，称定重量，超声处理(功率300w，频率40khz)30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。2.2牛膝特征图谱方法学验证2.2.1精密度实验取牛膝供试品溶液，按“2.1”项色谱条件下重复进样6次。以β-蜕皮甾酮为参照峰，计算相对保留时间及相对峰面积，结果表明，3个共有峰的相对保留时间与相对峰面积rsd均小于3％，表明仪器精密度良好。2.2.2稳定性试验取牛膝供试品溶液，按“2.1”项所述色谱条件分别在0、2、4、6、8、12h进样分析。以β-蜕皮甾酮为参照峰，计算相对保留时间及相对峰面积，结果表明，3个共有峰的相对保留时间与相对峰面积rsd均小于3％，表明该样品在12h内稳定。2.2.3重复性试验取牛膝供试品溶液6份，按“2.1.3”项供试品溶液的配制方法处理，按“2.1”项所述色谱条件测定。以β-蜕皮甾酮为参照峰，计算相对保留时间及相对峰面积，结果表明，3个共有峰相对保留时间与相对峰面积rsd均小于3％。表明该方法重复性良好。2.3酒牛膝炮制取净牛膝段，照酒炙法(《中国药典》2015年版四部通则0213)炒干。工艺参数：取净牛膝段，加入辅料黄酒搅匀，药材与辅料比为10∶1，闷润12～13小时，置锅内130～145℃下翻炒，翻炒至黄酒被吸进，约15分钟，炒至表面颜色略深，取出，晾干。2.4样品测定取27批牛膝药材样品及酒牛膝饮片样品，按“2.1.3”项下确定的供试品溶液制备方法，制备供试品溶液，按“2.1”项下确定的色谱条件，进样测定，使用《中药色谱指纹图谱相似度评价软件》对27批牛膝药材及酒牛膝饮片特征图谱进行共有峰标识，并生产对照图谱。27批牛膝药材重叠色谱图见图1，牛膝药材对照特征图谱见图2，27批酒牛膝饮片重叠色谱图见图3，酒牛膝饮片对照特征图谱见图4。相对峰面积见表1、表2。表1：27批牛膝药材特征图谱测定结果(相对峰面积)表2：27批酒牛膝饮片特征图谱测定结果(相对峰面积)27批牛膝与酒牛膝特征图谱相对峰面积范围见表3。表3：牛膝药材与酒牛膝饮片特征峰相对峰面积范围峰号牛膝药材酒牛膝饮片峰10.098～0.3260.271～0.799峰2-1.260～13.851峰3-0.080～11.361峰4-0.100～2.671峰5(s)1.0001.000峰60.194～0.3400.153～0.239峰70.259～0.3050.273～0.315由表3结果可知，峰2、峰3和峰4是酒牛膝与牛膝特征图谱差异。峰2、峰3与峰4为牛膝在酒炙中新产生的化合物，经指认，峰3为5-羟甲基糠醛。在鉴别样品为牛膝或是酒牛膝时，可分析uplc图谱中，以β-蜕皮甾酮为参照峰，相对保留时间在0.27±10％至0.41±10％范围内是否出现特征峰(峰2、峰3和/或峰4)，出现一种或多种特征峰则鉴别样品为酒牛膝。优选更具体地，分析uplc图谱中，以β-蜕皮甾酮为参照峰，相对保留时间在0.27±10％、0.37±10％、0.41±10％范围内出现相对峰面积为1.260～13.851(峰2)、0.080～11.361(峰3)和/或0.100～2.671(峰4)范围内的任一特征峰则鉴别样品为酒牛膝。本发明的方法重现性良好，准确可靠，能快速、全面反映酒牛膝炮制前后的差异，为牛膝和酒牛膝的质量控制提供依据。当前第1页12