多肽SLE2018-V003在诊断系统性红斑狼疮试剂盒中的应用的制作方法

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种多肽sle2018-v003在诊断系统性红斑狼疮试剂盒(组合物)中的应用。
背景技术：
：系统性红斑狼疮(systemiclupuserythematosus，sle)是一种临床表现为多系统损害的自身免疫介导的自身免疫性疾病(autoimmunediseases，ads)，常引起多器官系统的不可逆损害，严重影响患者的寿命和生活质量。系统性红斑狼疮疾病的发生率在0.02％～0.07％范围内，城市人群的发病率更高，患者年龄主要分布在15～45岁，且女性患者居多，男女发病比例约为1:9(lupus2006.15(5):308–318.)。对系统性红斑狼疮的流行率、病理机制和其生物标志物的研究是系统性红斑狼疮研究的三个重要方面。系统性红斑狼疮的临床表现具有多样性，血清学和免疫学指标变异性很大。该自身免疫疾病涉及多器官，包括皮肤、肾脏、脑，除了这些器官外往往伴有关节的损伤，因此免疫反应是全身性的。引起自身免疫应答的自身组织成分被称为自身抗原，包括隐藏的自身抗原(在胚胎期从未与自身淋巴细胞接触过，机体不能识别为自身物质)和修饰的自身抗原(在感染、药物、烧伤、电离辐射等因素影响下，自身组织的构象发生改变，成为自身抗原)。机体产生自身抗原时，由于将其识别为异己部分，产生对应的自身抗体进行抵抗。这些自身抗原或自身抗体在疾病表型显现的前期往往已经产生，并且表达量通常随着病情的演化呈现出一定的趋势。根据这一特点，这些自身抗原或自身抗体可被当做诊断疾病的生物标志物。生物标志物是一种测量工具，科研人员利用生物标志物诊断疾病的发生、复发、预后，并用于治疗效果的动态评估。及时对系统性红斑狼疮的诊断仍是一个巨大的挑战，能早期准确地诊断出系统性红斑狼疮的生物标志物是关键。优良的系统性红斑狼疮生物标志物应该具备的条件是：能准确地对系统性红斑狼疮进行诊断；诊断过程对患者无不良反应。目前，疾病生物标志物主要包括基因水平标志物、细胞水平标志物和血清水平标志物等。对于系统性红斑狼疮，已知的免疫靶标(或是自身抗原)主要为细胞核组分，包括ds-dna染色体相关蛋白，ro蛋白(ssa)，la蛋白(ssb)及sm蛋白。对于系统性红斑狼疮的诊断，自1971年美国风湿病学会(americancollegeofrheumatology，acr，1988年前称americanrheumatismassociation，ara)首次制定了系统性红斑狼疮诊断标准以来，系统性红斑狼疮的临床诊断标准就在不断完善中。在1982年的修订中首次增加了血清学指标(抗核抗体、抗ds-dna抗体和抗sm抗体)，并在制订过程中采用生物统计分析，经验证后用于临床诊断。1997年的修订中，增加了“抗心磷脂抗体阳性和狼疮抗凝物阳性”这一标准，虽然未经过验证，但血清学标志物一直是研究重点。(jnephroldialytransplant[j]vol.22no.2apr.2013:153-157.)血清蛋白组学是寻找系统性红斑狼疮的有效手段之一。在自身免疫病发生、发展的过程中，自身抗体表达量的变化会影响血清蛋白质组的组成，这在血清生物标志物的发现中具有重要价值。因此，越来越多科研人员将目光定格在血清蛋白质标志物的研究上，力求在蛋白质组学层面上寻找生物标志物，建立诊断、预后、药效评估的多参数模型。目前已有的系统性红斑狼疮标志物包括抗核抗体(anas)、抗ds-dna抗体和抗sm抗体等。抗核抗体作为该病的标志物在病人体内普遍存在，在诊断标准中，抗核抗体的标准指未用药物诱发“药物性狼疮”情况下，免疫荧光或相当于该法的其他实验抗核抗体滴度异常；抗dsdna抗体的血清水平与疾病活动度和肾功能损害显著相关，通过检测抗dsdna抗体水平可以预测疾病的复发，并且在疾病恶化前能够检测到更高水平的抗dsdna抗体。(medicalrecapitulate[j]，aug.2015,vol.21,no.16:2956-2958.)虽然抗核抗体高度灵敏，但却在其他自身免疫病病人血清中出现，如系统性硬化症、肌炎、自身免疫性溶血性贫血、类风湿和多发性硬化症(arthritis&rheumatismvol.47,no.4,august15,2002:434–444.)；抗dsdna抗体和抗sm抗体虽然在诊断系统性红斑狼疮中特异性更加显著，但并不是普遍出现在病人血清中(arthritis&rheumatismvol.47,no.5,october15,2002:546–555)。抗核抗体等自身抗体能预示疾病的发生，但特异性的缺乏阻碍了它们成为可用的预测性生物标志物。自身抗体因其在自身免疫疾病发病机制的中心地位，仍然是疾病早期诊断的研究热点。科研人员希望找到特异性显著，灵敏度高的自身抗体作为生物标志物，这样不仅能探测疾病的发生，还能对疾病严重程度进行区分。对准确高效的生物标志物的追求促使生物标志物筛选方法层出不穷。在这个高通量技术不断发展的时代，科研人员通过建库的方式，以期在大量候选物中找出在病人和健康人血清中差异性显著的化学分子。2013年，jiexiaquan等通过合成拟肽库作为自身抗原的替代物，筛出了针对系统性红斑狼疮特异性为97.5％，灵敏度为70％的化合物标志物(journalofimmunologicalmethods402(2014)23–34.)。除了化学合成的拟肽以外，可作为候选物的还有蛋白质和多肽。蛋白质芯片自出现以来已成为探究生物分子-蛋白质相互作用和筛选生物标志物的有力工具，它通过一定方式将大量蛋白质分子按照预设排列顺序点制并固定在固相载体表面形成微阵列，将待分析样品与芯片进行孵育，洗去未能与芯片上蛋白质结合的成分，然后用荧光标记的抗体进行孵育，最后在荧光扫描仪下读取各点的荧光信号值。血清中蛋白质的含量非常不均一，而自身抗体往往丰度都很低，普通质谱难以解决不同样品中自身抗体表达差异巨大的问题，但是蛋白质芯片则以其全局性、无偏性、高通量的特点可克服常规质谱的缺陷。利用蛋白质芯片可以在短时间内确定病人与健康人之间的差异，高效地寻找血清标志物。多肽展示库技术种类繁多，从表达载体来看，有噬菌体展示库、细菌展示库、酵母展示库、细胞展示库等；从表达物质种类来看，有cdna库、mrna库、多肽库等。相比于其他展示技术，噬菌体展示的最大优点即高通量和多样性。噬菌体展示库是上个世纪80年代发展起来的一项高通量筛选技术。21世纪以来，随着高通量测序技术的兴起，噬菌体展示库技术迎来了新的发展高潮。噬菌体展示库通过将基因信息和蛋白质联系在一起，研究蛋白质与蛋白质，蛋白质与多肽，蛋白质与dna的相互作用。目前已有的噬菌体展示库包括组学肽库和随机肽库，采用噬菌体展示库已实现了成千上万样本的平行分析。2010年，hbenjaminlarman等人通过将人类蛋白质组表达于t7噬菌体中，构建了第一个人类蛋白质组噬菌体展示库，通过该展示库筛选出副肿瘤性神经系统疾病自身抗体(naturebiotechnology.vol29,no.6june2011:535-541)。在这之后，噬菌体展示库以其高通量的优点配合目前发展的二代测序技术，完成了许多血清学方面的探测工作。随机肽库的淘选加上二代测序技术可用于表位的确定，也可用于确定自身抗原等其他免疫相关蛋白的相互作用情况。2015年，christiansena等人通过将噬菌体展示库与二代测序结合的方法探测花生过敏患者血清中ige与自身抗原的作用表位(scirep.12913(2015))。类似的工作还有很多，但是通过随机肽库筛选系统性红斑狼疮的生物标志物未见报道，因此，我们通过高通量的噬菌体展示库技术来筛选在病人和正常人中区分度高的多肽，以期得到对系统性红斑狼疮更有效的早期诊断标志物。技术实现要素：针对现存的技术问题以及更准确的系统性红斑狼疮血清标志物发现的需要，本发明提供一种多肽sle2018-v003在诊断系统性红斑狼疮试剂盒中的应用，来定性检测人血清中抗该多肽的igg抗体的水平，作为辅助系统性红斑狼疮诊断的一种手段，有望大大提高系统性红斑狼疮早期诊断的敏感性和特异性。为达到上述目的，本发明所采用的技术方案如下：第一方面，本发明涉及一种多肽sle2018-v003，其氨基酸序列为istvytgltekd。第二方面，本发明涉及一种多肽sle2018-v003在制备诊断系统性红斑狼疮组合物中的用途。第三方面，本发明涉及一种诊断系统性红斑狼疮的诊断试剂盒，所述试剂盒包含多肽sle2018-v003。该试剂盒采用临床广泛使用的elisa技术，应用间接法定性检测人血清中抗多肽sle2018-v003的igg抗体。具体原理是：用合成的多肽sle2018-v003抗原(噬菌体展示库筛选出的可与系统性红斑狼疮病人血清特异性反应的多肽sle2018-v003抗原)通过环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯(smcc)连接在牛血清白蛋白(bsa)上包被微孔板，制成固相抗原，往包被抗原的微孔中依次加入待测血清，再加入含有辣根过氧化物酶(hrp)标记的anti-humanigg抗体的酶标试剂，形成多肽sle2018-v003-抗体-酶标二抗复合物，经过彻底洗涤后加酶底物溶液3,3',5,5'-四甲基联苯胺(tmb)显色。tmb在hrp酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色，用颜色的深浅判断反应终点，并通过od450值检测样品中特异性识别多肽sle2018-v003的igg抗体水平。该试剂盒使用时：将多肽sle2018-v003抗原通过包被缓冲液稀释后包被在酶标板上的微孔内制成固相抗原，加入封闭液。将标准品与待测血清样品用样品稀释液后加入各自的抗原测定孔中，每孔加入含有辣根过氧化物酶(hrp)标记的anti-humanigg抗体的酶标试剂，经洗涤液彻底洗涤后加酶底物溶液显色，酶底物溶液反应时间到后加入酸性终止液。所述酶底物溶液在hrp酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色，利用颜色的深浅来检测样品中抗多肽sle2018-v003的igg抗体的水平。优选的，所述多肽是从m13噬菌体随机多肽库中淘选而来。噬菌体外合成后通过环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯(smcc)连接在牛血清白蛋白(bsa)上，浓度为1mg/ml。优选地，所述多肽sle2018-v003通过环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯(smcc)与bsa偶联，形成smcc-bsa-多肽偶联产物。优选的，所述试剂盒还包含标准品、包被缓冲液、封闭液、样品稀释液、含有辣根过氧化物酶标记的anti-humanigg抗体的酶标试剂、酶底物溶液、洗涤液和酸性终止液。优选的，所述标准品包括抗多肽sle2018-v003的igg抗体的浓度为0u/ml的标准血清1和抗多肽sle2018-v003的igg抗体的浓度为100u/ml的标准血清2；所述标准血清1为正常人血清，标准血清2为sle2018-v003抗体为阳性的血清。优选的，所述包被缓冲液为0.05±0.005mph9.6±0.05的碳酸盐缓冲液。更优选每1l溶液中含1.59gna2co3，2.93gnahco3。优选的，所述封闭液为含0.5％牛血清白蛋白的0.01±0.005mph7.4±0.05的磷酸盐-nacl缓冲液(pbs)溶液。更优选每1l中含有5g牛血清白蛋白(bsa)，8gnacl，0.2gkh2po4，2.9gna2hpo4·12h2o，0.2gkcl。优选的，所述样品稀释液为0.01±0.005mph7.4±0.05磷酸盐-nacl缓冲液。所述标准品与待测血清样品采用样品稀释液进行稀释。优选的，所述酶标试剂含辣根过氧化物酶(hrp)-二抗(即辣根过氧化物酶标记的anti-humanigg抗体)0.1-1μg/ml。优选的，所述酶底物溶液包括显色剂a和显色剂b；每500ml显色剂a溶液中含醋酸钠13.6g、柠檬酸1.6g、30％双氧水0.3ml；每500ml显色剂b溶液中含tmb350mg、dmso20ml、柠檬酸·h2o5.1g。优选的，所述洗涤液为内含0.05％tween-20的0.01±0.005mph7.4±0.05磷酸盐-nacl缓冲液(pbst)。更优选每1升溶液中含8gnacl，0.2gkh2po4，2.9gna2hpo4·12h2o，0.2gkcl，0.5mltween-20。优选的，所述酸性终止液为2±0.1mh2so4溶液。优选的，所述包被缓冲液、封闭液、样品稀释液、酶标试剂、洗涤液、酶底物溶液、酸性终止液中的一种或几种包含防腐剂。本发明的试剂盒中的试剂均可以加入防腐剂，以便于保存。第四方面，本发明涉及一种定性检测人血清样品中抗多肽sle2018-v003的igg抗体的方法，所述方法包括如下步骤：a、多肽sle2018-v003通过smcc与bsa偶联；b、将偶联后的多肽通过包被缓冲液稀释后包被在酶标板上的微孔内制成固相抗原，加入封闭液；c、将标准品与待测血清样品用样品稀释液后加入各自的抗原测定孔中，每孔加入含有辣根过氧化物酶标记的anti-humanigg抗体的酶标试剂，形成sle2018-v003-抗体-酶标二抗复合物；d、经洗涤液洗涤后加酶底物溶液显色，酶底物溶液反应时间到后加入酸性终止液终止反应；通过od450值即得样品中抗多肽sle2018-v003的igg抗体的水平。优选的，上述方法是非诊断治疗性的定性检测人血清样品中抗多肽sle2018-v003的igg抗体的方法。优选地，步骤a中，所述多肽sle2018-v003通过smcc与bsa偶联的步骤具体包括：a1、将环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯(smcc)加入含bsa的缓冲液pbs中，混匀，25℃反应1h，得bsa-smcc溶液；a2、向多肽sle2018-v003溶液中加入bsa-smcc溶液，混匀后静置于25℃下4至6小时，即得偶联产物bsa-smcc-多肽sle2018-v003。更优选地，步骤a1中，所述smcc与bsa的质量比为1:5；所述bsa-smcc溶液的浓度为4mg/ml。优选的，步骤d中，通过od450值即得样品中抗多肽sle2018-v003的igg抗体的水平具体包括：用酶联仪在450nm波长依序测量各孔的光密度od值，根据如下公式测得相对单位值：单位值(u/ml)＝(od值<样品>-od值<标准血清1>)/(od值<标准血清2>-od值<标准血清1>)×10；当单位值≥100u/ml，判断为人血清样品中抗多肽sle2018-v003的igg抗体水平高。本发明利用噬菌体随机多肽展示库和二代测序高通量、快速分析的优势，发展了一套快速获取疾病血清标志物的技术。通过对200份系统性红斑狼疮血清(病人100例，健康病人100例)进行分析，在短时间内比较了患者和健康人血清igg反应性的不同，筛选出本发明的血清标志物—多肽sle2018-v003，该多肽可用于早期诊断系统性红斑狼疮。与现有技术相比，本发明具有的有益效果为：1、本发明提供的血清标志物的特异性为73％，灵敏度为89％，具有高特异性和高灵敏度的特点。2、本发明提供一种灵敏、安全、可靠、易操作的商品化试剂盒，定性测定人血清中抗多肽sle2018-v003的igg抗体的水平，有助于辅助早期诊断系统性红斑狼疮。附图说明通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：图1为多肽偶联情况的电泳验证示意图；图2为roc曲线。具体实施方式下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。实施例1本实施例涉及一种多肽sle2018-v003，包含该多肽的诊断系统性红斑狼疮的诊断试剂盒。具体如下：1、准备多肽并将多肽与bsa偶联1)多肽sle2018-v003(氨基酸序列为：istvytgltekd)是采用hplc方法由吉尔生化(上海)有限公司合成的c端连接有半胱氨酸的多肽。从thermo购买smcc(环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯)(货号22360)。用dmso(二甲基亚砜)溶解，终浓度为100mg/ml，于-20℃保存。保质期一个月。2)称取10mgbsa，加入1ml偶联缓冲液pbs，配成10mg/ml的bsa溶液。3)取2mgsmcc(与bsa是1:5的关系)，加入到上述载体蛋白溶液中，混匀，25℃反应1h。4)在10kd透析袋中，透析过夜。5)将透析好的载体蛋白溶液置于新的离心管中，加入原偶联缓冲液，将激活的bsa-smcc浓度稀释到4mg/ml。6)取多肽1mg于eppendorf管中，加入10μldmso将多肽溶解。加入200μlpbs重悬，并测其ph在7.0～7.5内。7)向多肽中加入200μl激活好的bsa-smcc(浓度为4mg/ml)，混匀后静置于25℃4至6小时。8)偶联完成后加pbs定容至0.8ml，此时溶液浓度为1mg/ml。9)电泳验证偶联情况。电泳验证多肽的偶联情况如图1所示，由图1可知，蛋白条带从左至右依次是：marker,bsa,bsa-smcc,bsa-smcc-多肽sle2018-v003。可以看出bsa经过偶联smcc后分子量出现20kd左右的变化，bsa-smcc偶联多肽后出现了较小的分子量变化，由于多肽由12个氨基酸组成，所以分子量变化不大，但依旧可以看出多肽已经偶联成功。2、血清样本的准备：全血标本于室温放置2小时或4℃过夜后于1000g离心20分钟左右，取上清即可立即检测；或进行分装，并将标本放于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。解冻后的样品应再次离心，然后检测。所检测样品中不能含有nan3,因为nan3抑制辣根过氧化物酶(hrp)的活性。3、elisa法各种缓冲液及试剂的配制方法：(1)包被缓冲液：0.05mph9.6的na2co3-nahco3包被缓冲液质量(g)na2co31.59nahco32.93ddh2o加至1000ml(2)样品稀释液：0.01mph7.4pbs溶液样品稀释液质量(g)nacl8.0kh2po40.2na2hpo4·12h202.9kcl0.2ddh2o加至1000ml(3)洗涤液：0.01mph7.4的pbst溶液洗涤液质量(g)nacl8.0kh2po40.2na2hpo4·12h202.9kcl0.2tween-200.5mlddh2o加至1000ml(4)封闭液：0.5％bsa的0.01mph7.4pbs溶液封闭液质量(g)bsa5.0nacl8.0kh2po40.2na2hpo4·12h202.9kcl0.2ddh2o加至1000ml(5)酶底物溶液：显色剂a和显色剂b显色剂a质量醋酸钠13.6g柠檬酸1.6g30％双氧水0.3mlddh2o加至500ml(现配现用)显色剂b质量tmb350mgdmso20ml柠檬酸·h2o5.1gddh2o加至500ml(现配现用)(6)终止液：2mol/lh2so4溶液终止液质量浓硫酸(95％-98％)22.2mlddh2o加至500ml(配时将浓硫酸缓慢滴入蒸馏水中，边加边混匀)4、elisa法测定血清中抗多肽sle2018-v003的igg抗体的浓度，以辅助诊断系统性红斑狼疮：具体操作步骤如下：(1)包被：将纯化的多肽溶液用包被缓冲液稀释至1μg/ml，加入到96孔酶标板中，每孔100μl，37℃包被2小时或4℃过夜；洗涤液洗板1次，甩干。(2)封闭：加入封闭液200μl，室温保温2小时；洗涤液洗板1次，甩干。(3)标准品与样品的稀释与加样：将标准品与待测血清样品1:100用样品缓冲液稀释至100μl，加入到各自的抗原测定孔板中。注意不要有气泡，加样将样品加于梅标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，酶标板上加盖或覆膜。若待测血清样品较多，建议使用多管微量加液器加样。标准品及待检测样品临用前15分钟内配制，用完丢弃，下次检测使用新鲜配制的标准品。(4)温育：酶标板置于37℃反应120分钟，甩净孔中液体，洗涤6次。(5)加酶：每孔加含辣根过氧化物酶标记的anti-humanigg抗体的酶标试剂100μl，37℃，60分钟。甩净孔中液体，同上洗板6次拍干。(6)显色：拍干后各孔先滴加显色剂a50μl,再加入显色剂b50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟。(7)终止：依序每孔加终止液50μl，终止反应。终止液的加入顺序应尽量与底物液的加入顺序相同。底物反应时间到后应尽快加入终止液。(8)结果判定：i.用酶联仪在450nm波长依序测量各孔的光密度(od值)。单位值(u/ml)＝(a450<样品>-a450<标准血清1>)/(a450<标准血清2>-a450<标准血清1>)×100*a450是450nm处吸光度的缩写。*目前多肽等抗体尚无国际通行的参考标准，因此本检测结果校准时采用了相对单位。ii.血清中抗多肽sle2018-v003值的判定单位值≥100u/ml：可初步诊断该病人为系统性红斑狼疮患者单位值＜100u/ml：不能诊断该病人为系统性红斑狼疮患者iii.质量控制每个检测结果必须符合以下标准：标准血清1的a450：≤0.100标准血清2的a450：≥0.700如不符合上述标准，则结果视为无效，必须重新检测。iv.检验结果的解释对50例健康人血清、50例患者血清的roc分析确立了以上参考值。5、特异性和灵敏度检测：采用100份自身免疫疾病相关患者的血清(系统性红斑狼疮患者50份，健康人50份)对本发明的诊断试剂盒进行了特异性和敏感性检测。检测吸光值od450后利用spss17.0得到roc曲线(结果如图2所示，横坐标为1-特异性，纵坐标为灵敏度)。本发明的诊断试剂盒辅助诊断系统性红斑狼疮的特异性为73％，灵敏度为89％，auc＝0.81，均提高了现有技术中系统性红斑狼疮诊断的指标。以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。当前第1页12