基于离线2DLC-MS结合代谢物预测三七叶皂苷成分的方法与流程

本发明涉及一种基于离线2dlc-ms结合代谢物预测三七叶皂苷成分的方法，属于化学成分分析方法技术领域。

背景技术：

化合物库筛选是中药质谱鉴定常用的方法。化合物库中收录的化合物多基于分离文献报道，数目有限，从而限制了数据库匹配的效率。因此，扩展数据库中的化合物数目对中药复杂成分的快速鉴定至关重要。

三七叶总皂苷制剂七叶神安片收录于2015版《中国药典》，具有益气安神、活血止痛的功效，临床上用于心气不足、心血瘀阻所致的心悸、失眠、胸痛、胸闷。三七分离报道多集中于三七根，对三七叶的研究较少。

三七皂苷的主要差别在于苷元、糖基及酰化官能团类型和数目不同。本发明拟采用代谢物预测的方法，基于已报道的糖基和酰化官能团，对数据库中的皂苷进行理论的结构修饰，从而扩展化合物数据库。结合本发明已构建的hilic×rp离线二维液相系统，提出“离线二维分离-扩展数据库匹配”的策略，对三七叶中的皂苷成分进行靶向表征，从而阐明其化学物质基础，为其相关制剂的质量控制提供依据。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是，本发明提供一种基于离线2dlc-ms结合代谢物预测三七叶皂苷成分的方法，该法将代谢物预测的方法与hilic×rp离线二维液相系统相结合，提出“离线二维分离-扩展数据库匹配”的策略，对三七叶中的皂苷成分进行靶向表征，从而阐明其化学物质基础，为其相关制剂的质量控制提供依据。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：

基于离线2dlc-ms结合代谢物预测三七叶皂苷成分的方法，包括以下步骤：

s01，供试品溶液的制备：称取三七叶样品粉末适量，置于离心管中，加入相当于三七叶样品粉末质量80～100倍量的70％甲醇，室温超声提取至少30min后进行一次离心，取上清液进行二次离心，二次离心的上清液于3～4℃保存待分析；

s02，第一维分段供试品制备：第一维hilic分离在agilent1200液相系统上进行，使用的色谱条件如下：流动相包括水(a)和乙腈(b)；色谱柱watersxbridgeamide，规格为4.6×150mm,3.5μm；吸收波长：203nm；柱温25℃；进样量20μl；洗脱梯度：0-20min,85-75％(b)；20-21min,75-50％(b)；21-26min,50％(b)；1-24min每隔1min收集为1个流分，共收集23个流分，重复进样5针，将得到的流份用干燥的氮气吹干，每个样品溶于100μl的70％甲醇，于14000rpm进行离心10min，取上清液作为待测样品；

s03，uplc/qtof-fastdda条件：对经过第一维hilic分离得到的23个样品进行第二维的uplc/qtof-ms检测；色谱柱为behshieldrpc18柱，规格为2.1×100mm,1.7μm，柱温为25℃；使用乙腈(a)和0.1％甲酸水(b)作为流动相，使用如下的梯度进行洗脱：0-3min,23-29％(a)；3-6min,29-31％(a)；6-10min,31-34％(a)；10-13min,34-53％(a)；13-16min,53-60％(a)；16-17min,60-95％(a)；17-20min,95％(a)；20-20.5min,95-23％(a)；20.5-24min,23％(a)；流速为0.3ml/min，进样量为2μl，pda检测器设置检测波长为203nm；

使用waters公司的xevog2-sqtof高分辨质谱仪，配有esi源，负离子模式检测；优化的源参数为：sourcevoltage,2.5kv；conevoltage,60v；sourceoffsetvoltage,60v；sourcetemperature,120℃；desolvationtemperature,400℃；conegasflow,30l/h；desolvationgasflow,800l/h；使用fastdda模式获取三七皂苷的二级质谱碎片：ms一级扫描范围m/z500-1500,扫描时间0.15s，当tic强度超过5000intensity/sec时自动切换到ms/ms扫描；ms/ms二级扫描范围m/z150-1300；前3强离子自动选为母离子进行ms/ms裂解，ms/ms扫描时间0.15s，当单一离子强度高于5000intensity/s或者时间过去0.45s时切换到ms扫描；排除m/z500-700以避免触发产生的多电荷离子二级碎片；使用去同位素峰的峰识别模式-宽度窗口为±3da,提取峰的范围为7da；使用双动态的裂解能量-低质量端裂解能量为25v-45v，高质量端的裂解能量为60v-80v；再进行数据采集，数据采集格式为continnum，le采集但不校正；

s04，unifi数据处理：数据采用unifi进行处理；三七中分离报道的99个皂苷成分的化学信息，包括名称，分子式，结构导入unifi构建三七皂苷化合物库进行代谢物预测；编辑四个转化官能团，包括丙二酰基，葡萄糖，五碳糖和鼠李糖，并限定最多进行两步结构转化；一级ms和二级ms/ms阈值分别设定为300和100counts；匹配误差阈值设为5ppm；加合离子选择[m–h]^-和[m–h+fa]^-。

s01中，一次离心的条件为：转速为4000rpm，时间为10min。

s01中，二次离心的条件为：转速为14000rpm，时间为10min。

s04中，丙二酰基为mal,+c3h2o3,86.0004da；葡萄糖为glc,+c6h10o5,162.0528da；五碳糖为xyl,+c5h8o4,132.0423da；鼠李糖为rha,+c6h10o⁴,146.0579da。

s03中，数据采集的方法为使用masslynx4.1软件进行采集。

s04中，unifi的型号为v.1.8.2，厂家为waters。

本发明具有以下有益效果：本发明针对中药数据库筛选中化合物数目有限的问题，我们基于unifi自动化数据处理模块，提出了代谢物预测方法，对已有数据库进行扩展。选择丙二酰基、葡萄糖、鼠李糖和木糖作为代谢物修饰的官能团，经过两步修饰，将三七数据库中的化合物数目扩充14倍。另外，结合离线二维液相分离，最终从三七叶中筛选出721个皂苷成分，结合“unknown”中鉴定的224个成分，共鉴定了945个成分。与常规的一维分离结合数据库筛选方法相比，二维液相分离结合扩展数据筛选中，化合物筛选数目扩大了7.5倍。通过检索人参属自建数据库，其中662个皂苷被确定为潜在的新化合物。该研究系统表征了三七叶中的皂苷成分，为其相关制剂的化学物质基础阐明提供了依据，同时扩展了当前对人参属皂苷结构多样性的认识。以上基于unifi软件的代谢物预测方法大大简化了数据处理流程，提高了质谱鉴定效率，也可推广应用于其它类别化合物的质谱表征中。

附图说明

图1为本发明中50个皂苷成分对照品化学结构；

图2为本发明中离线二维系统的正交性评价图；

图3为本发明中直接一维液质分析和4个分段样品的5个9.73min左右的质谱图；

图4为本发明中化合物739在一维和二维分离中的一级与二级谱图；

图5为4个c17侧链杂化型皂苷的一级和二级谱图及归属图；

图6为本发明中化合物695的一级与二级质谱图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清晰，以下结合附图及实施例对本发明进行进一步详细说明。此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1：

1.试剂与仪器

乙腈、甲醇均为色谱纯(merck,darmstadt,germany)；超纯水经milli-q系统(millipore,usa)纯化；甲酸为色谱纯99％(roescientificinc.,usa)。

本实验中共使用50个皂苷成分进行裂解规律总结和比对，其中malonylginsenosides-rb1,-rd分离自人参花；ginsenosides-f3,-la,-mc,-ra1,notoginsenosides-fa,-fp2,-ft1,gypenosides-ix,-xiii,-lxxv,quinquenoside-l3,chikusetsusaponin-l5及compoundy分离自三七叶；notoginsenosides-r1,-r3,-r4,-g,-k,-m,-t,-t5,20(s)-notor2,20(r)-notor2,ginsenosides-f2,-ra3,-rb1,-rb2,-rb3,-rc,-rd,-re,-re3,-rf,-rg1,-ro,20(s)-rg2,20(s)-rg3,20(r)-rg3,20(s)-sanchirhinosides-a3,-a4,-a5,vinaginsenoside-r4,20-o-glc-rf及5,6-didehydroginsenosiderb1分离自三七根；ginsenosides20(r)-rg2,-rk1,-rg5及pseudoginsenosidef11购自上海诗丹德生物技术有限公司。其化学结构见图1。

sartoriuscp224s电子天平(sartoriusinc.,germany)；elmasonicp180h超声波清洗仪(elma,germany)；l530离心机(湖南长沙湘仪检测设备有限公司)。

agilent1200液相系统，配有dad检测器、二元泵、柱温箱、自动进样器及在线脱气机。

watersacquityuplci-class超高效液相系统，配有一个pda检测器、一个二元泵、一个柱温箱、一个自动进样器及一个脱气机，串连xevog2-sqtof质谱仪。配有masslynx4.1工作站。

2.供试品制备

称取三七叶样品粉末1.0g,置于50ml离心管中，加入10ml70％甲醇，室温超声提取30min(37khz)，4000rpm离心10min后，取上清液14000rpm离心10min，上清液4℃保存待分析。

3.第一维分段供试品制备

第一维hilic分离在agilent1200液相系统上进行，使用的色谱条件如下：流动相包括水(a)和乙腈(b)；色谱柱watersxbridgeamide(4.6×150mm,3.5μm)；吸收波长：203nm；柱温25℃；进样量20μl。洗脱梯度：0-20min,85-75％(b)；20-21min,75-50％(b)；21-26min,50％(b)。1-24min每隔1min收集为1个流分，共收集23个流分，重复进样5针，将得到的流份用干燥的氮气吹干，每个样品溶于100μl的70％甲醇，于14000rpm进行离心10min，取上清液作为待测样品。

4.uplc/qtof-fastdda条件

对经过第一维hilic分离得到的23个样品进行uplc/qtof-ms检测。色谱柱为behshieldrpc18柱(2.1×100mm,1.7μm)，柱温为25℃；使用乙腈(a)和0.1％甲酸水(b)作为流动相，使用如下的梯度进行洗脱：0-3min,23-29％(a)；3-6min,29-31％(a)；6-10min,31-34％(a)；10-13min,34-53％(a)；13-16min,53-60％(a)；16-17min,60-95％(a)；17-20min,95％(a)；20-20.5min,95-23％(a)；20.5-24min,23％(a)。流速为0.3ml/min，进样量为2μl，pda检测器设置检测波长为203nm。

使用waters公司的xevog2-sqtof高分辨质谱仪，配有esi源，负离子模式检测。优化的源参数为：sourcevoltage,2.5kv；conevoltage,60v；sourceoffsetvoltage,60v；sourcetemperature,120℃；desolvationtemperature,400℃；conegasflow,30l/h；desolvationgasflow,800l/h。使用fastdda模式获取三七皂苷的二级质谱碎片：ms一级扫描范围m/z500-1500,扫描时间0.15s，当tic强度超过5000intensity/sec时自动切换到ms/ms扫描；ms/ms二级扫描范围m/z150-1300；前3强离子自动选为母离子进行ms/ms裂解，ms/ms扫描时间0.15s，当单一离子强度高于5000intensity/s或者时间过去0.45s时切换到ms扫描；排除m/z500-700以避免触发产生的多电荷离子二级碎片；使用去同位素峰的峰识别模式-宽度窗口为±3da,提取峰的范围为7da；使用双动态的裂解能量-低质量端裂解能量为25v-45v，高质量端的裂解能量为60v-80v。使用masslynx4.1软件进行数据采集，数据采集格式为continnum，le采集但不校正。

5.unifi数据处理

数据采用unifi(v.1.8.2,waters)进行处理。三七中分离报道的99个皂苷成分(附表2)的化学信息，包括名称，分子式，结构导入unifi构建三七皂苷化合物库。编辑四个转化官能团，包括丙二酰基(mal,+c3h2o3,86.0004da),葡萄糖(glc,+c6h10o5,162.0528da),五碳糖(xyl,+c5h8o4,132.0423da)和鼠李糖(rha,+c6h10o4,146.0579da)，并限定最多进行两步结构转化；一级ms和二级ms/ms阈值分别设定为300和100counts；匹配误差阈值设为5ppm；加合离子选择[m–h]-和[m–h+fa]-。

6.2d-lcqtof系统构建及评价

本实施例的步骤1～5构建了hilic×rp2d-lcqtof系统进行血栓通注射剂的皂苷成分鉴定。本实施例结合之前的条件优化结果，构建hilic×rp2d-lcqtof系统进行三七叶中皂苷成分的系统分析。因为样品成分差异，色谱条件进行微调，主要差别在于第二维色谱柱更换为behshieldrpc18柱，并且第一维和第二维梯度进行优化，以获得成分在第一维和第二维更加均匀的分布。优化后第一维重复5针制备样品耗时约200min，第二维23个流分分析约耗时500min。第一维与第二维的保留时间重复性考察结果良好，第一维保留时间相对标准偏差(rsd)0.05％-0.15％，第二维保留时间rsd为0.08％-0.46％。

watersxevog2-sqtof支持多种方法数据采集，包括非数据依赖的mse和数据依赖的fastdda。非数据依赖的mse通过“低碰撞能”和“高碰撞能”两种扫描方式交替，同时获得高分辨的母离子及碎片信息，具有数据信息丰富的优点，但其二级碎片的归属常存在困难。数据依赖的fastdda采集方法，可以依次采集前n强的母离子二级碎片信息，因为二级碎片为单一母离子碎裂产生，具有碎片归属清晰的优点。之前报道的unifi处理数据多采用mse方法采集，软件处理过程中可能会存在假阳性结果，因此本实施例中采用fastdda方法采集数据。在负离子模式下，皂苷成分容易形成复杂的多电荷形式，尤其是m/z500-700范围形成双电荷离子，双电荷离子容易触发二级碎裂造成扫描时间损失，因此排除m/z500-700范围母离子。

2d-lcqtof系统的分离效率采用峰容量和正交性进行评价。二维系统的理论峰容量为两维峰容量的乘积，其中第一维峰容量为52.5(平均峰宽为0.4min)，第二维峰容量为170(平均峰宽为0.1min)，因此二维系统的理论峰容量为8925。正交性评价采用星条方程进行计算，血栓通注射剂分析中计算理论峰容量仅选择50个代表成分，本实验中为了更加全面的反应系统的正交性，以检测到的945个皂苷成分进行正交性评价。成分在线z+,z-,z1与z2周围分散度分别为0.89,0.64,0.95与0.86，正交性为0.69，即如图2所示，说明离线二维系统可以对三七叶中皂苷成分具有很好的分离能力。与在线二维系统相比，离线二维系统分析时间更长，但是鉴定的成分更多。因此在线二维系统更加适用于高通量分析，离线二维系统更加适用于全成分分析，同时离线二维系统具有仪器自动化要求低和溶剂兼容的优点。

离线二维方法可以使得原本共流出的化合物通过第一维的分段分布在不同段中。直接进行一维液质分析时，化合物739(m/z845.49),743(m/z1093.58),732(m/z1123.59)和741(m/z1195.61)共流出，难以同时获得4个化合物的二级碎片信息，如图3所示。经过第一维hilic分段后，四个皂苷成分分别分布在第4,8,12,10段中。以化合物739为例，相比于一维液质分析，化合物的响应得到提高，获得的二级碎片质量更好，如图4所示。

7.代谢物预测的分析策略及其应用

7.1.代谢物预测的分析策略

质谱技术，尤其是液质联用技术(lc-ms)已经成为中药分析的重要手段。质谱灵敏度高信息丰富，但是质谱数据的快速准确解析一直是一个难点。传统的手动解析方法已经难以满足大样本质谱数据解析的需要，近年来兴起的库检索的方法为中药质谱成分解析提供了可行的解决方案。以watersunifi库检索解决方案为例，通过将原本需要人为参与的很多环节(如峰提取、元素组成推导)变成软件的自动化处理，并通过选择药材化合物数据库实现精准匹配，从而大大提高分析效率。但是以上的方法仍然存在其不足，因为药材化合物数据库多基于药材分离报道进行收录，对更多微量或者不稳定的难以分离的成分则未进行收录，因而难以实现匹配。

中药天然产物通过生物合成途径生成，因而其化学结构存在规律性。如皂苷、黄酮、酚酸等化合物可以看作由多个固定结构单元组成。因此，可以推测药材中未报到的化合物与已报到的化合物结构差别主要在于固定结构单元，未报到的化合物则可以通过已知化合物与固定结构单元的匹配组合进行推测。以人参皂苷为例，其结构主要由一个苷元、若干个糖基及酰化官能团组成。因此未报到皂苷的结构可以通过已知皂苷结构上通过进一步添加糖基及酰化官能团获得。由此，提出代谢物预测法进行数据库扩展。

本实施例首先对三七中已报道的99个皂苷进行结构分析，含有22种苷元，5种糖基(葡萄糖，木糖，呋喃型阿拉伯糖，吡喃型阿拉伯糖和鼠李糖)，3种酰化官能团(乙酰基，丙二酰基，正丁烯酰基)。因为木糖、呋喃型阿拉伯糖和吡喃型阿拉伯糖为五碳糖同分异构体，质谱难以区分，统一以木糖进行标识。人参属植物，尤其是植物地上部分花和叶中含有大量的丙二酰化皂苷，因其结构不稳定，所以相关分离报道不多。最终选择葡萄糖，木糖，鼠李糖及丙二酰基4种官能团进行皂苷化合物结构预测。由此经过两步模拟衍生化，对于化合物库每个皂苷成分，可以获得14个理论预测化合物，理论上预测化合物库中化合物数目是原本化合物库的14倍，由此采用理论预测化合物库可以获得更多匹配结果。

8.2d-lc分离结合代谢物预测的分析策略优势

比较四种方法筛选出的皂苷成分数目，包括二维分离结合代谢物预测(2d-mms)，二维分离结合直接库筛选(2d-dls)，一维分离结合代谢物预测(2d-mms)和一维分离结合直接库筛选(1d-dls)方法。一维分离结合直接库筛选方法共筛选出85个皂苷成分，一维分离结合代谢物预测方法筛选出201个成分，因此代谢物预测的方法提高了1.4倍筛选效率；二维分离结合直接库筛选的方式筛选出282个成分，因此二维分离方法提高了2.3倍；二维分离结合代谢物预测的方法筛选出721个皂苷成分，相比于常规的一维分离结合直接库筛选方法提高了7.5倍，体现出了二维分离与代谢物预测方法两个方法结合使用的优势。

9.皂苷对照品的裂解行为研究

共采用50个皂苷对照品进行裂解行为研究，其中包括18个原人参三醇型(ppt)，23个原人参二醇型(ppd)，1个ot型，1个齐墩果酸型(oa)，5个c-17位侧链杂化型和2个杂化型皂苷。

皂苷成分的负离子cid裂解行为如下：即中性皂苷成分，一级中易形成[m-h]^-与[m-h+fa]^-,酸性皂苷成分(oa型和丙二酸酰化皂苷)只能形成[m-h]^-。皂苷成分通过依次断裂糖苷键丢失外侧糖，直至暴露苷元相关离子，ppt型皂苷m/z475.38/391.29,ppd型皂苷m/z459.38/375.29,ot型皂苷m/z491.37/415.32,oa型皂苷m/z455.35。对于苷元杂化型皂苷5,6-二脱氢人参皂苷rb1主要碎片为m/z457.37/373.28，7-羟基-5-烯基ppd型noto-g主要碎片为m/z473.36/389.27。对于c-17侧链杂化型皂苷，如图5所示，20(22),24-二烯基ppd型ginsenosiderg5，20(21),24-二烯基ppd型ginsenosiderk1，20(21),24-二烯基ppt型noto-t5，仅观察到各自相关苷元离子m/z441.37,441.37,457.37。23-烯基-25-羟基-ppd型quinquenosidel3基本上无苷元相关离子，可能因为其结构与ppd型及ppt型皂苷相比差异较大。因此，c17侧链断裂中性丢失84.09da(c6h12)产生的离子对m/z475.38/391.29，459.38/375.29，473.36/389.27及457.37/373.28可以用于区分不同苷元类型。此外，glc中性丢失162.05da,rha中性丢失146.05da,五碳糖(木糖：xyl；呋喃型阿拉伯糖：ara(f)；吡喃型阿拉伯糖：ara(p)；质谱裂解中五碳糖具体类型难以判断，统一以xyl进行表示)中性丢失132.04da,glura中性丢失176.03da。此外，二级谱图中低质量端碎片(m/z150-400)可以辅助判别皂苷糖链连接方式。碎片m/z221.07,205.37及191.06分别由glc-glc,glc-rha与glc-xyl进行3,6x30碎裂获得。对于丙二酰化皂苷(m-rb1与m-rd)，可以观察到[m-h]^-特征中性丢失43.99da及86.00da，分别对应中性丢失co2及整个丙二酰基(c3h2o3)。

10.三七叶中皂苷成分的系统表征

三七叶采用第一维hilic进行分段，共获得23段样品，随后采用uplc-qtof进行表征，并采用unifi结合代谢物预测的方法进行筛选。除了unifi自动筛选出的721个皂苷成分“identifiedcomponents”，还手动鉴定了响应较高(response>20000)的224个皂苷成分，由此共鉴定945个皂苷成分(附表3)。通过检索人参属自建数据库，确定其中662个为潜在新化合物。最终共从三七叶中鉴定76个ppt型，197个ppd型，7个oa型及7个ot型皂苷。

本实施例共从三七叶中鉴定167个丙二酰皂苷，其中17个为结构新颖的苷元丙二酰化皂苷。选择化合物695与936来说明糖基丙二酰化与苷元丙二酰化皂苷的不同裂解行为，如图6所示。化合物695由母离子[m-h]^-m/z1163.5842推断分子式为c56h92o25，由unifi筛选出并识别为noto-l+mal。它的[m-h]^-碎裂产生特征的m/z1119.59[m-h-co2]^-及m/z1077.58[m-h-mal]^-,表明该化合物为单丙二酰化皂苷。产生的脱糖信号m/z945.54[m-h-mal-xyl]^-,783.49[m-h-mal-xyl-glc]^-,621.44[m-h-mal-xyl-2glc]^-，及苷元信号m/z459.38[ppd-h]^-和糖链碎片m/z293.09和191.06，说明该化合物苷元为ppd，含有3个葡萄糖、1个五碳糖及1个丙二酰基，且其中一个葡萄糖和一个五碳糖直接相连。因此化合物695鉴定为ppd-glc-glc-(glc-xyl)-mal。

在三七叶鉴定的945个皂苷成分中，614个为c17侧链杂化型，占总鉴定数目的64.6％,且其中多为结构新颖的皂苷成分。三七叶中共鉴定26个含有苷元的化合物。鉴定的945个皂苷成分，共含有84种不同苷元，其中56种为人参属中未报道过的新苷元，说明三七叶中皂苷成分化学多样性。

本实施例针对中药数据库筛选中化合物数目有限的问题，我们基于unifi自动化数据处理软件，提出了代谢物预测方法，对已有数据库进行扩展。选择丙二酰基、葡萄糖、鼠李糖和木糖作为代谢物修饰的官能团，经过两步修饰，将三七数据库中的化合物数目扩充14倍。另外，结合离线二维液相分离，最终从三七叶中筛选出721个皂苷成分，结合“unknown”中鉴定的224个成分，共鉴定了945个成分。与常规的一维分离结合数据库筛选方法相比，二维液相分离结合扩展数据筛选中，化合物筛选数目扩大了7.5倍。通过检索人参属自建数据库，其中662个皂苷被确定为潜在的新化合物。该研究系统表征了三七叶中的皂苷成分，为其相关制剂的化学物质基础阐明提供了依据，同时扩展了当前对人参属皂苷结构多样性的认识。以上基于unifi软件的代谢物预测方法大大简化了数据处理流程，提高了质谱鉴定效率，也可推广应用于其它类别化合物的质谱表征中。

实施例2：

本实施例与实施例1的区别仅在于：供试品制备中，称取三七叶样品粉末1.0g,置于50ml离心管中，加入8ml70％甲醇，室温超声提取35min(37khz)，4000rpm离心10min后，取上清液14000rpm离心10min，上清液3℃保存待分析。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。