良附滴丸的检测方法与流程

本发明涉及良附滴丸质量控制技术领域，特别是一种良附滴丸的检测方法。

背景技术：

良附滴丸为贵州黄果树立爽药业有限公司独家生产的中成药品种，由高良姜、香附两味中药组成。良附滴丸的处方为传统中药名方，首载于清代医学家谢元庆所著的《良方集腋》，主要用于治疗寒凝气滞、脘腹胀满、疼痛吐酸等症的急慢性胃炎、胃溃疡、胃痉挛等。高良姜主要含有挥发油类、黄酮类、二芳基庚烷类、苯丙素类、糖苷类、甾醇类等，其中的黄酮类成分不仅具有抗消化道溃疡、解除胃肠痉挛、止呕作用，还具有镇痛抗炎、抗血栓形成、抗氧化及化学预防作用。香附主要含挥发油类，包括多种单萜、倍半萜及其氧化物等、黄酮类、生物碱类、糖类以及三萜类等化合物，这些复杂的化学成分使得香附具有广泛的药理活性和药用价值。

目前良附滴丸的检测方法较为简单，其定量分析方法只能测定高良姜素的含量，而良附滴丸的成份复杂，只检测单一指标成分难以有效控制产品质量，无法满足良附滴丸质量控制的稳定、可控的要求；其定性检测方法只能测定良附滴丸中的高良姜和香附的存在，无法测定高良姜和香附中具体的化学成份。

因此，现有的良附滴丸的检测方法，其定量分析方法只能测定单一指标成份高良姜素的含量，其定性检测无法检出高良姜和香附中具体的化学成份，现有的良附滴丸的检测方法难以有效控制产品质量，无法满足良附滴丸质量控制的稳定、可控的要求。

技术实现要素：

本发明的目的，在于提供了一种良附滴丸的检测方法。本发明中的定量分析方法可以同时测定良附滴丸中6中主要成份的含量，本发明中的定性检测可以检出高良姜和香附中具体的化学成份，本发明可以有效控制产品质量，能够满足良附滴丸质量控制的稳定、可控的要求。

本发明的技术方案：良附滴丸的检测方法，良附滴丸的原料包括高良姜、香附两味中药，所述良附滴丸中高良姜素、鼠李柠檬素、高良姜素-3-o-甲醚、香附烯酮、诺卡酮和α-香附酮的含量的检测方法如下，

混合对照品溶液的制备：称取高良姜素对照品、鼠李柠檬素对照品、高良姜素-3-o-甲醚对照品、香附烯酮对照品、诺卡酮对照品和α-香附酮对照品，加入甲醇配置成混合对照品溶液，计算各对照品溶液的浓度；

供试品溶液的制备：称取良附滴丸，置于具塞锥形瓶中，加入甲醇或乙醇或甲醇/乙醇溶液，称重定量，超声处理，取出，放冷，用甲醇或乙醇或甲醇/乙醇溶液补足减失的重量，过滤，取滤液，得供试品溶液；

含量测定色谱条件：高效液相色谱仪；pfp色谱柱；流动相为乙腈a-水b或乙腈a-磷酸水溶液b或甲醇a-水b或甲醇a-磷酸水溶液b；柱温为35-45℃；流速为0.6-1.4ml·min^-1；检测波长为220-280nm；

含量测定：按含量测定色谱条件分别吸取混合对照品溶液和供试品溶液注入高效液相色谱仪，测定高良姜素、鼠李柠檬素、高良姜素-3-o-甲醚、香附烯酮、诺卡酮和α-香附酮的含量。

前述的良附滴丸的检测方法中，所述混合对照品溶液的制备为，称取高良姜素对照品10-15mg、鼠李柠檬素对照品5-10mg、高良姜素-3-o-甲醚对照品5-10mg、香附烯酮对照品5-10mg、诺卡酮对照品3-6mg和α-香附酮对照品3-6mg，加入甲醇配置成20ml混合对照品溶液，计算各对照品溶液的浓度。

前述的良附滴丸的检测方法中，所述供试品溶液的制备为，称取良附滴丸0.5-1.5g，置于具塞锥形瓶中，加入甲醇配制成5％的良附滴丸溶液，称定重量，超声处理30min，取出，放冷，用甲醇补足减失的重量，过滤，取滤液，得供试品溶液。

前述的良附滴丸的检测方法中，所述含量测定色谱条件为，高效液相色谱仪；色谱柱为lunapfp2100a，250×4.60mm，5μm；流动相为乙腈a-0.1％磷酸水溶液b，40:60；柱温为40℃；流速为1.000ml·min^-1；检测波长为254nm；进样量10μl。

前述的良附滴丸的检测方法中，还包括良附滴丸的指纹图谱的测定方法，所述良附滴丸的指纹图谱的测定方法如下，

供试品溶液的制备：称取良附滴丸，置于具塞锥形瓶中，加入甲醇或乙醇或甲醇/乙醇溶液，称重定量，超声处理，取出，放冷，用甲醇或乙醇或甲醇/乙醇溶液补足减失的重量，过滤，取滤液，得供试品溶液；

指纹图谱色谱条件：高效液相色谱仪；pfp色谱柱；流动相乙腈a-水b或乙腈a-磷酸水溶液b或甲醇a-水b或甲醇a-磷酸水溶液b，梯度洗脱：0～20min:20％～52％(a)，20～40min:52％～70％(a)，40～50min:70％～95％(a)；柱温为35-45℃；流速为0.6-1.4ml·min^-1；检测波长为160-220nm；

指纹图谱测定：按指纹图谱色谱条件吸取供试品溶液注入高效液相色谱仪，测得良附滴丸的指纹图谱。

前述的良附滴丸的检测方法中，所述良附滴丸的指纹图谱的测定方法中，所述供试品溶液的制备为，称取良附滴丸0.5-1.5g，置于具塞锥形瓶中，加入甲醇配制成5％的良附滴丸溶液，称定重量，超声处理30min，取出，放冷，用甲醇补足减失的重量，过滤，取滤液，得供试品溶液。

前述的良附滴丸的检测方法中，所述指纹图谱色谱条件为，高效液相色谱仪；色谱柱为lunapfp2100a，250×4.60mm，5μm；流动相为乙腈a-0.1％磷酸水溶液b，梯度洗脱：0～20min:20％～52％a，20～40min:52％～70％a，40～50min:70％～95％a；柱温为40℃；流速为1.000ml·min^-1；检测波长为190nm；进样量10μl。

前述的良附滴丸的检测方法中，所述指纹图谱的相似度评价方法为，测定多批良附滴丸样品的指纹图谱，采用国家药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”2012版进行相似度评价，运用中位数法，以任一批的指纹图谱样品为参照图谱，进行多点校正，生成对照图谱，计算批间相似度。

前述的良附滴丸的检测方法中，所述多批良附滴丸样品的指纹图谱，包括21个共有峰，其中有6个特征峰，分别为高良姜素、鼠李柠檬素、高良姜素-3-o-甲醚、香附烯酮、诺卡酮、α-香附酮，共有峰中14个峰来自高良姜药材，9个峰来自香附药材，其中2个峰同时存在于高良姜素和香附药材。

前述的良附滴丸的检测方法中，所述良附滴丸为包括高良姜、香附以质量比为1:1制得的滴丸剂。

与现有技术比较，本发明中良附滴丸的含量检测方法可以同时测定高良姜素、鼠李柠檬素、高良姜素-3-o-甲醚、香附烯酮、诺卡酮和α-香附酮共6种主要成份的含量，所述含量测定色谱条件下各峰分离度均大于1.5，各对照品的线性回归方程的相关系数为0.9998以上，所述含量测定方法精密度好、重复性好、24h内稳定性好，准确度好，批间差异性小，检测速度快，可同时检出6种成份的含量；本发明中良附滴丸的指纹图谱测定方法测得的指纹图谱批间相似度大于0.99，通过“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”建立15批良附滴丸指纹图谱共有模式，确定了21个共有峰，并指认了6个特征峰，分别为高良姜素、鼠李柠檬素、高良姜素-3-o-甲醚、香附烯酮、诺卡酮和α-香附酮，21个共有峰中14个峰来自高良姜药材，9个峰来自香附药材，其中两个峰同时存在于高良姜药材和香附药材，所述指纹图谱检测方法精密度好，24小时内稳定性好，重复性好。本发明中的定量分析方法可以同时测定良附滴丸中6中主要成份的含量，本发明中的定性检测可以检出高良姜和香附中具体的化学成份，本发明可以有效控制产品质量，能够满足良附滴丸质量控制的稳定、可控的要求。

附图说明

图1为15批良附滴丸样品的hplc指纹图谱(图中，r21为混合对照品溶液的指纹图谱，其他为良附滴丸样品的指纹图谱)；

图2为良附滴丸特征峰；

图3为高良姜药材特征峰；

图4为香附(醋制)药材特征峰；

图5为良附滴丸样品的系统适用性图谱(图中，峰1为高良姜素；峰2为鼠李柠檬素；峰3为高良姜素-3-o-甲醚；峰4为香附烯酮；峰5为诺卡酮；峰6为α-香附酮)；

图6为对照品溶液的系统适用性图谱(图中，峰1为高良姜素；峰2为鼠李柠檬素；峰3为高良姜素-3-o-甲醚；峰4为香附烯酮；峰5为诺卡酮；峰6为α-香附酮)。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步的说明，但并不作为对本发明限制的依据。

实施例。

仪器与材料

1仪器

lc-2040c高效液相色谱仪(日本岛津)，十万分之一天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司)、万分之一天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司)、超声波清洗机(宁波双嘉仪器有限公司)、超纯水机(四川沃特尔科技发展有限公司)。

2材料

15批良附滴丸(所述良附滴丸为包括高良姜、香附以质量比为1:1制得的滴丸剂)均由贵州黄果树立爽药业有限公司提供(批号：011123～011137，分别以s1～s15表示)；高良姜素对照品(批号：wkq16032503；hplc≥98％)、鼠李柠檬素对照品(批号：wkq17081112；hplc≥98％)、诺卡酮对照品(批号：wkq18080103；gc≥97％)、α-香附酮对照品(批号：wkq16072701；hplc≥98％)，均购于四川维克奇生物科技有限公司；高良姜素-3-o-甲醚对照品(批号：18042321；纯度：hplc≥98％；购于上海同田生物技术股份有限公司)；香附烯酮对照品(批号：17101605；纯度：hplc≥95％；购于成都格利普生物科技有限公司)；甲醇和乙腈为色谱纯，其余均为分析纯；超纯水。

方法与结果

1色谱条件

1.1含量测定色谱条件

色谱柱为lunapfp(2)100a(250×4.60mm，5μm)；流动相为乙腈-0.1％磷酸水溶液(40:60)；柱温为40℃；流速为1.000ml·min^-1；检测波长为254nm；进样量10μl。

1.2指纹图谱色谱条件

流动相为乙腈(a)-0.1％磷酸水溶液(b)，梯度洗脱：0～20min:20％～52％(a)，20～40min:52％～70％(a)，40～50min:70％～95％(a)；检测波长为190nm；其余条件同含量测定色谱条件一致。

2混合对照品溶液的制备

取高良姜素对照品13mg、鼠李柠檬素对照品8mg、高良姜素-3-o-甲醚对照品8mg、香附烯酮对照品8mg、诺卡酮对照品5mg、α-香附酮对照品5mg，加甲醇配制成20ml的混合对照品溶液，计算各对照品的浓度。

3供试品溶液的制备

取本品1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加甲醇配制成5％的溶液，称定重量，超声处理30min(功率：300w；频率：40khz)，取出，放冷，用甲醇补足减失的重量，滤过，取滤液，即得。

4阴性对照溶液的制备

按处方分别制备缺高良姜和香附的阴性样品，按“2.3”项下供试品溶液制备方法制备阴性对照溶液。

5hplc指纹图谱的方法学考察

5.1精密度考察

取同一良附滴丸样品(s1)，按“3”项下供试品溶液制备方法制得供试品溶液，照“1.2”项下色谱条件连续进样6次，采用国家药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”(2012版)进行相似度评价，建立了15批良附滴丸指纹图谱共有模式，确定了21个共有峰，以高良姜素作为参照峰s，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积，结果各峰的相对保留时间和相对峰面积rsd值均小于3.0％，表明仪器精密度良好。

5.2稳定性考察

取同一良附滴丸样品(s1)，按“3”项下供试品溶液制备方法制得供试品溶液，分别在制备后0、2、4、8、12、24小时，照“1.2”项下色谱条件进样测定，高良姜素作为参照峰s，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积，结果各峰的相对保留时间和相对峰面积rsd值均小于3.0％，表明供试品溶液在24小时内稳定性良好。

5.3重复性考察

取同一批良附滴丸样品6份(s1)，按“3”项下供试品溶液制备方法制得供试品溶液，照“1.2”项下色谱条件进样测定，以高良姜素作为参照峰s，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积，结果各峰的相对保留时间和相对峰面积rsd值均小于3.0％，表明方法重复性良好。

6指纹图谱的建立及峰归属

6.1指纹图谱的建立

取15批良附滴丸样品(s1～s15)，按“3”项下供试品溶液制备方法制备样品溶液，照“1.2”项下色谱条件进样测定，采用国家药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”(2012版)进行相似度评价，运用中位数法，以s1号样品为参照图谱，进行多点校正，生成对照图谱r，并计算相似度值。结果15批良附滴丸样品图谱与对照图谱r的相似度值均大于0.9，表明15批良附滴丸产品批次间差异较小，建议相似度值不小于0.9，见图1和表1。

表115批样品相似度结果

6.2共有峰归属分析

分别吸取“3”项下供试品溶液和“4”项下阴性对照溶液各10μl，按“1.2”项下色谱条件进样测定(见图2-图4)，并通过国家药典委员会出版的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”建立了15批良附滴丸指纹图谱共有模式，确定了21个共有峰，并指认了6个特征峰，分别为高良姜素(11号峰)、鼠李柠檬素(12号峰)、高良姜素-3-o-甲醚(15号峰)、香附烯酮(14号峰)、诺卡酮(16号峰)、α-香附酮(17号峰)，其中1、3、4、6、8、9、10、11、12、13、15、18号峰来源于高良姜药材，2、5、7、14、16、17、21号峰来源于香附药材，19、20号峰同时存在于高良姜药材和香附药材。以高良姜素(11号峰)作为参照峰s，计算15批样品中各共有峰的相对保留时间和相对峰面积，结果各共有峰的相对保留时间和相对峰面积rsd值分别在0.02％～0.69％、0.7％～2.69％之间，表明15批良附滴丸质量一致性良好。

7良附滴丸中6种成分的含量测定

7.1系统适用性试验

分别精密吸取“2”项下对照品溶液和“3”项下供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，按“1.1”项下色谱条件进行测定并记录色谱图(见图5-图6)，结果表明各峰分离度均大于1.5。

7.2线性关系考察

精密量取“2”项下混合对照品溶液适量，加甲醇逐级稀释成一系列不同浓度的对照品溶液。照“1.1”项下色谱条件测定，以浓度为横坐标x，峰面积为纵坐标y绘制工作曲线，计算回归方程。结果见表2，表明各指标成分在一定的质量浓度范围内线性关系良好。

表26种指标成分的线性回归方程和范围

7.3精密度试验

精密吸取同一供试品溶液(s1)，按“1.1”项下含量测定色谱条件连续进样6次，计算得良附滴丸中高良姜素、鼠李柠檬素、高良姜素-3-o-甲醚、香附烯酮、诺卡酮、α-香附酮的平均含量rsd值分别为2.1％、1.5％、2.2％、2.4％、2.1％、1.5％。表明仪器精密度良好。

7.4重复性试验

分别称取同一批样品(s1)0.5、1.0、1.5g各3份(s1)，共9份，加甲醇20ml，按“3”项下供试品溶液制备方法制得供试品溶液，照“1.1”项下含量测定色谱条件进样测定，计算得良附滴丸中高良姜素、鼠李柠檬素、高良姜素-3-o-甲醚、香附烯酮、诺卡酮、α-香附酮的平均含量分别为9.3048、3.1143、1.4514、2.3942、0.8612、2.1909mg/g，rsd值分别为2.3％、2.7％、2.3％、2.4％、2.8％、1.9％。表明方法重复性良好。

7.5稳定性试验

取同一供试品溶液(s1)分别在放置0、1、2、4、8、12、24h后按“1.1”项下含量测定色谱条件进样测定，结果高良姜素、鼠李柠檬素、高良姜素-3-o-甲醚、香附烯酮、诺卡酮、α-香附酮含量rsd分别为1.2％、1.0％、1.4％、1.8％、1.8％、2.1％。表明供试品溶液在24h内稳定性良好。

7.6加样回收率试验

取已知含量的良附滴丸样品(s1)0.5g，共9份，精密称定，分别按6种成分含量的50％、100％、150％加入高良姜素、鼠李柠檬素、高良姜素-3-o-甲醚、香附烯酮、诺卡酮、α-香附酮对照品适量，按“3”项下供试品溶液制备方法制得供试品溶液，照“1.1”项下含量测定色谱条件进样测定，计算6种成分的加样回收率。结果高良姜素、鼠李柠檬素、高良姜素-3-o-甲醚、香附烯酮、诺卡酮、α-香附酮的平均加样回收率(n＝9)分别为100.6％、100.7％、100.5％、101.2％、102.0％、102.0％，rsd值分别为1.9％、1.7％、1.0％、1.7％、1.5％、1.6％。表明方法准确度良好。

7.7样品测定

取15批良附滴丸良附滴丸样品，分别按“3”项下供试品溶液制备方法制得样品溶液，照“1.1”项下含量测定色谱条件进样测定，计算15批良附滴丸中6种成分的含量，结果15批良附滴丸样品中6种成分含量的rsd值均小于3.0％，表明良附滴丸产品批次间差异较小，均一性高。见表3。

表315批良附滴丸中6种成分的含量(mg/g，n＝3)

讨论

1色谱柱的选择本研究在实验之初选择了c18柱进行色谱峰的分离，结果发现在不同的色谱条件下，高良姜素和鼠李柠檬素均处于重叠状态。因高良姜素和鼠李柠檬素结构非常相似，选择用于分离芳香族化合物的位置异构体的pfp色谱柱，最终可将高良姜素和鼠李柠檬素完全分离。

2波长的选择本研究通过高效液相色谱仪进行了全波长扫描，发现在190nm下黄酮类成分和挥发油成分的峰吸收程度最大化，故选择190nm作为良附滴丸指纹图谱吸收波长。为更准确地对6个指标成分进行含量测定，减少各杂峰对指标成分的干扰，最终选择在254nm进行含量测定研究。

3提取方法考察本研究分别以40％甲醇、70％甲醇、甲醇、乙醇、水超声处理30min、甲醇、水温浴30min，对良附滴丸进行了提取考察，结果甲醇超声30min较其他提取方法的提取率更高。

4hplc色谱条件的优化本研究考察了乙腈-水，乙腈-0.05％磷酸水溶液、乙腈-0.1％磷酸水溶液、乙腈-0.2％磷酸水溶液、甲醇-水、甲醇-0.1％磷酸水溶液6种流动相系统，结果乙腈-0.1％磷酸水溶液流动相系统下，各色谱峰的峰形及分离度较好；此外还对不同柱温和不同流速进行了比较，结果在40℃和1.0ml·min^-1条件下，各色谱峰能够得到更好的分离。

在研究过程中发现结构非常相似的高良姜素和鼠李柠檬素，常规十八烷基硅烷键合硅胶柱不易有效分离，通过pfp色谱柱将其较好地分离，建立了良附滴丸hplc指纹图谱及多指标成分含量同时测定方法，本方法简便有效，重复性高，专属性强，且产品批次间具有较好的均一性，能够很好地控制良附滴丸的内在质量。

当然，本发明还可有其它多种实施例，在不背离本发明精神及其实质的情况下，熟悉本领域的技术人员当可根据本发明作出各种相应的改变和变形，但这些相应的改变和变形都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。