基于化学发光的可同时检测多种农兽药残留的生物芯片及检测方法与流程

本发明属于食品安全监督或食品分析的免疫分析技术，特别涉及一种基于化学发光的可同时检测多种农兽药残留的生物芯片及检测方法。

背景技术：

使用农药、兽药是目前世界各国在农业种植中防止农作物病虫害和畜禽水产养殖中防止病害的有效手段。但是，大量农药、兽药的使用，给整个生态系统和食品安全带来了巨大的安全威胁，成为危害人类健康的“杀手”。

农药残留(pesticideresidues)，是农药使用后一个时期内没有被分解而残留于生物体、收获物、土壤、水体、大气中的微量农药原体、有毒代谢物、降解物和杂质的总称。按照化学结构，农药可以分为有机磷类、有机氯类、拟除虫菊类、烟碱类等。农药残留问题是随着农药大量生产和广泛使用而产生的。到目前为止，世界上化学农药年产量近200万吨，约有1000多种人工合成化合物被用作杀虫剂、杀菌剂、杀藻剂、除虫剂、落叶剂等类农药。农药尤其是有机农药大量施用，造成严重的农药污染问题，成为对人体健康的严重威胁。食用含有大量高毒、剧毒农药残留引起的食物会导致人、畜急性中毒事故。长期食用农药残留超标的农副产品，虽然不会导致急性中毒，但可能引起人和动物的慢性中毒，导致疾病的发生，甚至影响到下一代。农药进入粮食、蔬菜、水果、鱼、虾、肉、蛋、奶中，造成食物污染，危害人的健康。一般有机氯农药在人体内代谢速度很慢，累积时间长。有机氯在人体内残留主要集中在脂肪中。如ddt在人的血液、大脑、肝和脂肪组织中含量比例为1:4:30:300；狄氏剂为1:5:30:150。食用含有大量高毒、剧毒农药残留引起的食物会导致人、畜急性中毒事故。长期食用农药残留超标的农副产品，虽然不会导致急性中毒，但可能引起人和动物的慢性中毒，导致疾病的发生，甚至影响到下一代。由于农药残留对人和生物危害很大，各国对农药的施用都进行严格的管理，并对食品中农药残留容许量作了规定。

兽药残留(residuesofveterinarydrug)是指用药后蓄积或存留于畜禽机体或产品(如鸡蛋、奶品、肉品等)中原型药物或其代谢产物，包括与兽药有关的杂质的残留。兽药在防治动物疾病、提高生产效率、改善畜产品质量等方面起着十分重要的作用。然而，由于养殖人员对科学知识的缺乏以及一味地追求经济利益，致使滥用兽药现象在当前畜牧业中普遍存在。滥用兽药极易造成动物源食品中有害物质的残留，这不仅对人体健康造成直接危害，而且对畜牧业的发展和生态环境也造成极大危害。长期食用兽药残留超标的食品后，当体内蓄积的药物浓度达到一定量时会对人体产生多种急慢性中毒。动物机体长期反复接触某种抗菌药物后，其体内敏感菌株受到选择性的抑制，从而使耐药菌株大量繁殖；此外，抗药性r质粒在菌株间横向转移使很多细菌由单重耐药发展到多重耐药。耐药性细菌的产生使得一些常用药物的疗效下降甚至失去疗效，如青霉素、氯霉素、庆大霉素、磺胺类等药物在畜禽中已大量产生抗药性，临床效果越来越差。研究发现许多药物具有致癌、致畸、致突变作用。

食品安全检验检测是食品安全监管的重要手段之一，它为食品安全监管提供了重要的技术支撑。目前，国内外关于农药兽药残留的主要检测方法有两类：理化检测法和免疫分析法。理化检测法是利用抗生素分子中的基团所具有的特殊反应或性质来测定含量的方法，如高效液相色谱法、气相色谱法、比色法、荧光分光光度法，其中最常用的是高效液相色谱法(hplc)和色谱质谱联用法(tlc-ms，gc-ms，lc-ms等)。理化检测法对设备要求高，技术难度大，对技术人员要求高，操作繁琐，需要大量复杂的样品前处理操作，不适合现场监控和大量样本的筛查。免疫分析法是基于抗原抗体识别或者受体配体识别来测定抗生素含量的分析方法，如酶联免疫吸附法(elisa)和受体吸附分析法。这类方法具有灵敏度高、特异性强、操作简单的优点，然而现有的免疫分析法如elisa无法同时测定多个目标物。如需测定样品中的多种抗生素，则需要进行多次试验，需要耗费较多的时间与材料。此外，针对抗生素检测，使用较多的还有微生物法。微生物学检测方法是利用抗生素对微生物的生理机能、代谢的抑制作用来定性或定量确定样品中抗生素残留的方法，如微生物生长抑制法、微生物受体法、酶比色法等。这些方法都需要加热设备培养微生物，并且微生物法耗时很长，无法快速检测。针对农药残留，还有乙酰胆碱酯酶抑制法，但是这个方法只能半定量检测样品中的农药残留总量，无法精确定量，也无法区分残留农药的具体种类。因此，迫切需要发展一种灵敏、准确、快速并且可同时检测多种农药和兽药的检测方法。

目前，国内外现有的研究主要集中于针对单一农兽药建立其特异性免疫检测方法，而实际上农产品中残留的农兽药往往同时会有多种，单一农兽药免疫检测方法及相应的试剂盒已经难以满足实际检测的需要了。

生物芯片技术是20世纪90年代在生命科学领域迅速兴起的一项高新技术。生物芯片已经在疾病诊断、药物筛选、农作物育种、司法鉴定等领域有着广泛应用。它具有微型化、高通量和自动化的检测特征。开发高通量、快速、准确的可同时定量检测多种农兽药残留的微阵列芯片具有重要意义。

技术实现要素：

发明目的：本发明的第一目的是提供一种同时检测多种农兽药残留的化学发光微阵列生物芯片，本发明的第二目的是提供利用上述生物芯片同时检测多种农兽药残留的方法，在于弥补现有农药、兽药同时定量检测技术的空白，满足对动物源性食品、植物源性食品中多种药物残留同时进行快速检测的要求，具有多靶标、成本低、灵敏度高、检测时间短和操作简单易行等特点。

技术方案：本发明提供的一种基于化学发光的可同时检测多种农兽药残留的生物芯片，所述生物芯片包括固定有一组检测目标物抗原的芯片载体，所述检测目标物为农药和/或兽药，所述生物芯片由以下方法制成：以牛血清白蛋白为空白对照，将牛血清白蛋白和检测目标物抗原通过生物芯片制备系统在芯片载体上点样操作后，于20-37℃水浴中孵育0.5-4h，洗涤后晾干即得。

优选的，所述牛血清白蛋白和检测目标物抗原均使用cb缓冲液稀释，所述cb缓冲液配方：称取3.03gna2co3和6.00gnahco3，用蒸馏水溶解并定容至500～2000ml。

所述洗涤采用pbs缓冲液，洗涤3次，每次200～300μl。

所述生物芯片为一组由检测目标物抗原的矩阵组成，所述矩阵的列数为3的倍数，将矩阵设的列数设为3的倍数，从而每个检测目标物抗原可点3个重复点，使测定结果更直观更准确。所述的芯片载体为24孔板、96孔板、384孔板、透明高聚物片基、膜或玻片。

所述的农药为有机氯类农药、有机磷类农药、拟除虫菊酯类农药、氨基甲酸酯类农药、烟碱类农药、甲草胺、乙草胺、百草枯、异菌脲中的任意一种或几种；所述的兽药为抗生素类、促生长类药物中的任意一种或几种。

进一步的，所述的有机氯类农药包括滴滴涕、六六六、三氯杀螨砜、三氯杀螨醇、五氯硝基苯、百菌清、道丰宁、氯丹、七氯、艾试剂、毒杀芬、冰片基氯；所述的有机磷类农药包括乐果、氧化乐果、对硫磷、三唑磷、内吸磷、甲基内吸磷、马拉硫磷、敌百虫、敌敌畏、甲拌磷、乙拌磷、甲基对硫磷、磷胺、硫特普、二溴磷、氯蜱硫磷；所述的拟除虫菊酯类农药包括甲氰菊酯、氯氟氰菊酯、溴氰菊酯、氰戊菊酯、二氯苯醚菊酯；所述的氨基甲酸酯类农药包括多菌灵、速灭威、西维因、涕灭威、克百威、甲萘威、叶蝉散、抗蚜威、甲霜灵；所述的烟碱类农药包括吡虫啉、啶虫脒、噻虫嗪、噻虫胺、烯啶虫胺；所述的抗生素类药物包括β-内酰胺类抗生素、氨基糖苷类抗生素、四环素类抗生素、大环内酯类抗生素、磺胺类抗生素、喹诺酮类抗生素、硝基呋喃类抗生素和其他抗生素；所述的促生长类药物包括克伦特罗、沙丁胺醇、溴布特罗、克伦潘特、卡布特罗、马布特罗、西布特罗、马喷特罗、吡布特罗、特布他林、西马特罗、莱克多巴胺、苯乙醇胺a可乐啶、赛庚啶。

所述的β-内酰胺类抗生素包括青霉素类抗生素和头孢类抗生素；所述的氨基糖苷类抗生素包括庆大霉素、卡那霉素、链霉素和新霉素；所述的四环素类抗生素包括四环素、土霉素、金霉素和多西环素；所述的大环内酯类抗生素包括红霉素、克拉霉素和罗红霉素；所述的磺胺类抗生素包括磺胺对甲氧嘧啶、磺胺甲基异噁唑、磺胺甲二唑磺胺噻唑、磺胺甲氧哒嗪、磺胺氯哒嗪、磺胺邻二甲氧嘧啶、磺胺嘧啶、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺喹噁啉、磺胺甲基嘧啶、磺胺索嘧啶、磺胺氯哒嗪、磺胺氯吡嗪；所述的喹诺酮类抗生素包括诺氟沙星、恩诺沙星、洛美沙星、沙拉沙星、左氟沙星、环丙沙星、氧氟沙星、加替沙星、司帕沙星和莫西沙星；所述的硝基呋喃类抗生素包括呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃妥因和呋喃西林；所述的其他抗生素包括氯霉素、甲砜霉素、克林霉素和林可霉素。

本发明还提供了一种利用上述生物芯片同时检测农兽药残留的方法，包括以下步骤：

(1)在生物芯片的部分反应孔内分别加入含有不同浓度梯度的检测目标物的混合标准溶液，在剩余反应孔内分别加入待测样品溶液，继续向所有反应孔中依次加入有标记物标记后的检测目标物所对应的抗体，于20～37℃水浴反应10～20min，洗涤液洗涤；

(2)向步骤(1)洗涤后的所有反应孔内继续加入显色剂；

(3)使用ccd进行图像采集，根据检测目标物阵列点的化学发光信号值以及标准溶液的浓度对数制作标准曲线，采用外标曲线法定量，分别计算样品溶液中检测目标物的含量。

步骤(1)中，所述标记物为辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶。

步骤(2)中，所述显色剂为过氧化物-鲁米诺体系、过氧化物-异鲁米诺及其衍生物体系、过氧化物-吖啶酯及吖淀酰胺类体系、(金钢烷)-1，2-二氧乙烷及其衍生物。所述显色剂加入体积为10～100μl。

所述的待测样品为动物源性样品和植物源性样品，其中，动物源性食品包括牛奶、奶粉、奶酪、饲料、尿液、动物组织(如猪肉、牛肉、鸡肉、猪肝或鸡肝等)、血清、蜂蜜、蜂皇浆、鸡蛋和水产品(如鱼或虾等)，植物源性食品包括水果、蔬菜。

待测样品溶液的制备方法为：当待测样品为液体时，取50μl～1ml于10mlep管中，用缓冲液稀释10～100倍即得待测样品溶液；当待测样品为固体时，取粉碎样品5g，加入8ml缓冲液，混合2～5min，置50℃水浴下放置10～30min，离心5～10min，取50μl上清液，加入450μl缓冲液混匀，取50μl～500μl即得待测样品溶液。

步骤(1)中，所述检测目标物的混合标准溶液加入体积为10～200μl；所述待测样品溶液的加入体积与游离农药和兽药的标准溶液的加入体积相同；每个反应孔内加入的标记后的抗体的量10～200μl；不同反应孔内加入的抗体的量相同，不同反应孔内加入的标记的羊抗鼠igg的量相同；所述的洗涤液为磷酸盐缓冲液和tris缓冲液。

其中，所述的洗涤液为磷酸盐缓冲液和tris缓冲液。

有益效果：本发明提供的一种同时检测多种农兽药残留的化学发光生物芯片结构简单、制备工艺简单、成本低、多靶标、准确度高、灵敏度高、精密度高、检测时间短、操作简单易行，无需昂贵的检测仪器，适用于现场大规模样品的初筛。该生物芯片将检测目标物抗原固定于芯片载体上，使用时在反应孔内加入待测样品溶液及其检测目标物相应的标记的抗体，从而实现待测样品溶液中游离的农兽药分子和生物芯片上固定的包被抗原之间发生竞争反应，待测样品溶液中游离的检测目标物越多，那么生物芯片上固定的包被抗原反应量越少，显色后生物芯片上固定的抗原阵列的不同位置上形成强弱不一的化学发光信号，通过ccd对图像进行采集，最终可实现对多种农兽药残留的同时定量检测。

具体而言，本发明相对于现有技术具有以下突出的特点：

(1)准确度高：利用本发明提供的芯片检测多种农兽药残留，对牛奶加样回收率在80％-120％之间，准确度高，适于实际样品的检测。

(2)灵敏度高：利用本发明提供的芯片检测多种农兽药残留，灵敏度高。

(3)精密度高：利用本发明提供的芯片检测多种农兽药残留，对农兽药分子抗体的特异性较好，并且孔间cv值低于10％，孔内cv值低于5％，精密度高。

(4)效率高：利用本发明提供的芯片检测多种农兽药残留，根据外标曲线可定量求出多种农兽药的浓度。使用该生物芯片可在一次实验中同时测得多种有害物质的含量，大大降低了操作步骤，减少试剂用量，降低了成本，无需特殊昂贵的实验仪器，同时也为现场快速检测提供了一种思路；与现有的elisa方法相比，本发明根据生物芯片包被抗原的化学发光信号强弱来定量检测，克服了elisa方法在溶液中显色一次只能测定单种有害物质的含量的缺陷。本发明方法可同时快速定量检测多种农兽药残留，而现有方法只能检测一种药物，原因是现有方法通常会加入内标物从而干扰多种物质的检测，影响其他待测物质检测的准确度。

(5)本发明可以在一块芯片上设置分区和多个平行重复点，可有效控制芯片质量，极大地提高了芯片检测结果的可靠性，使其检测结果的可控性和可靠性远远高于elisa等其他常规检测方法，便于建立标准化检测平台，可节省大量样本、检测时间和人员设备。

附图说明

图1a-1f为本发明制作的标准曲线图：

1a为四环素的标准曲线(实施例1)；四环素的曲线在0.2ng/ml-16.2ng/ml范围内线性良好，r²>0.99，并且孔间cv值低于10％，孔内cv值低于5％，方法精密度高。且蜂蜜样本加样回收率在90％-120％之间，方法的准确度高；

1b为链霉素的标准曲线(实施例1)；链霉素的曲线在0.15ng/ml-12.15ng/ml范围内线性良好，r²>0.99，并且孔间cv值低于10％，孔内cv值低于5％，方法精密度高。且蜂蜜样本加样回收率在85％-100％之间，方法的准确度高；

1c为磺胺甲基异噁唑的标准曲线(实施例1)；磺胺甲基异噁唑的曲线在1ng/ml-81ng/ml范围内线性良好，r²>0.99，并且孔间cv值低于10％，孔内cv值低于5％，方法精密度高。且蜂蜜样本加样回收率在85％-110％之间，方法的准确度高；

1d为环丙沙星的标准曲线(实施例1)；环丙沙星的曲线在0.05ng/ml-4.05ng/ml范围内线性良好，r²>0.99，并且孔间cv值低于10％，孔内cv值低于5％，方法精密度高。且蜂蜜样本加样回收率在80％-95％之间，方法的准确度高；

1e为多菌灵的标准曲线(实施例1)；多菌灵的曲线在0.1ng/ml-8.1ng/ml范围内线性良好，r²>0.99，并且孔间cv值低于10％，孔内cv值低于5％，方法精密度高。且蜂蜜样本加样回收率在85％-103％之间，方法的准确度高；

1f为氟氯氰菊酯的标准曲线(实施例1)；氟氯氰菊酯的曲线在2ng/ml-162ng/ml范围内线性良好，r²>0.99，并且孔间cv值低于10％，孔内cv值低于5％，方法精密度高。且蜂蜜样本加样回收率在90％-110％之间，方法的准确度高；

图2为本发明实施例1的生物芯片图；该生物芯片的每个反应孔内可同时检测四环素(阵列3)、链霉素(阵列4)、磺胺甲基异噁唑(阵列5)、环丙沙星(阵列6)、多菌灵(阵列7)和氟氯氰菊酯(阵列8)共6个项目；其中，芯片中阵列1和阵列2为对照阵列。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作出详细说明。

实施例1

同时检测蜂蜜样本中的四环素、链霉素、磺胺甲基异噁唑、环丙沙星、多菌灵和氟氯氰菊酯的含量。

实验中所使用的试剂如下：

(1)标准溶液：

本实施例中使用的混合标准溶液共6种，组成如下：

①混合标准溶液1：其中四环素0ng/ml，链霉素0ng/ml，磺胺甲基异噁唑0ng/ml，环丙沙星0ng/ml，多菌灵0ng/ml，氟氯氰菊酯0ng/ml。

②混合标准溶液2：其中四环素0.2ng/ml，链霉素0.15ng/ml，磺胺甲基异噁唑1ng/ml，环丙沙星0.05ng/ml，多菌灵0.1ng/ml，氟氯氰菊酯2ng/ml。

③混合标准溶液3：其中四环素0.6ng/ml，链霉素0.45ng/ml，磺胺甲基异噁唑3ng/ml，环丙沙星0.15ng/ml，多菌灵0.3ng/ml，氟氯氰菊酯6ng/ml。

④混合标准溶液4：其中四环素1.8ng/ml，链霉素1.35ng/ml，磺胺甲基异噁唑9ng/ml，环丙沙星0.45ng/ml，多菌灵0.9ng/ml，氟氯氰菊酯18ng/ml。

⑤混合标准溶液5：其中四环素5.4ng/ml，链霉素4.05ng/ml，磺胺甲基异噁唑27ng/ml，环丙沙星1.35ng/ml，多菌灵2.7ng/ml，氟氯氰菊酯54ng/ml。

⑥混合标准溶液6：其中四环素16.2ng/ml，链霉素12.15ng/ml，磺胺甲基异噁唑81ng/ml，环丙沙星4.05ng/ml，多菌灵8.1ng/ml，氟氯氰菊酯162ng/ml。

以上化合物标准品均购自中国药品生物制品检定所，使用时称重并用超纯水稀释至所需浓度。

(2)检测样本溶液：

样本为市售洋槐蜂蜜，经hplc检验确认四环素、链霉素、磺胺甲基异噁唑、环丙沙星、多菌灵和氟氯氰菊酯均为阴性。检测时，往其中添加标准溶液至所需浓度。添加后，将蜂蜜样本用磷酸盐缓冲液稀释10倍后待检测。

(3)标记后的抗体：

①四环素项目对应的标记抗体为hrp酶标记的鼠抗四环素单克隆抗体，由南京祥中生物科技有限公司提供；

②链霉素项目对应的标记抗体为hrp酶标记的鼠抗链霉素单克隆抗体，由南京祥中生物科技有限公司提供；

③磺胺甲基异噁唑项目对应的标记抗体为hrp酶标记的鼠抗磺胺甲基异噁唑单克隆抗体，由南京祥中生物科技有限公司提供；

④环丙沙星项目对应的标记抗体为hrp酶标记的鼠抗环丙沙星单克隆抗体，由南京祥中生物科技有限公司提供；

⑤多菌灵项目对应的标记抗体为hrp酶标记的鼠抗多菌灵单克隆抗体，由南京祥中生物科技有限公司提供；

⑥氟氯氰菊酯项目对应的标记抗体为hrp酶标记的鼠抗氟氯氰菊酯单克隆抗体，由南京祥中生物科技有限公司提供；

(4)显色剂：反应中所用的显色剂为supersignalelisafemtomaximumsensitivitysubstrate，购买自thermoscientific公司。

(5)缓冲液配方分别为：

磷酸盐缓冲液配方为：135mmnacl,2.7mmkcl,1.5mmkh2po4,和8mmk2hpo4，调节ph至7.4。

tris缓冲液配方为：50ml0.1mol/l三羟甲基氨基甲烷(tris)溶液与44.7ml0.1mol/l盐酸混匀后，加水稀释至100ml。

检测步骤如下:

(1)生物芯片的制备：以牛血清白蛋白为空白对照，使用生物芯片制备仪(美国biodot公司)在96孔板上点样制备微阵列芯片，将牛血清白蛋白、各项目抗原(四环素-bsa偶联物、链霉素-bsa偶联物、磺胺甲基异噁唑-ova偶联物、环丙沙星-bsa偶联物、多菌灵-ova偶联物和氟氯氰菊酯-bsa偶联物)在96孔板上点样操作，37℃水浴中固定0.5h，在96孔板上形成微阵列结构，不同位置的阵列点对应不同的抗原；

(2)待测样品溶液的制备：称取1g蜂蜜样品于50mlep管中，用pbs缓冲液(0.1m，ph7.4)稀释10倍，即为待测样品溶液；

(3)在96孔板的部分反应孔内分别加入50μl含不同浓度梯度的四环素、链霉素、磺胺甲基异噁唑、环丙沙星、多菌灵和氟氯氰菊酯的混合标准溶液，在剩余的反应孔内分别加入50μl待测样品溶液，向所述已经加入了混合标准溶液或样品溶液的反应孔内继续加入50μl所述四环素、链霉素、磺胺甲基异噁唑、环丙沙星、多菌灵和氟氯氰菊酯对应的标记的抗体混合溶液，在37℃水浴反应20min，然后pbst洗涤；

(4)在每个反应孔内继续加入50μl显色剂；

(5)用ccd进行图像采集，根据四环素、链霉素、磺胺甲基异噁唑、环丙沙星、多菌灵和氟氯氰菊酯相应固定抗原位置的阵列点化学发光强度信号，利用外标曲线法定量检测样品中四环素、链霉素、磺胺甲基异噁唑、环丙沙星、多菌灵和氟氯氰菊酯的含量。

检测结果见图1a-1f、图2。

本实施例对该方法的检测限和精密度进行了考察，从图中可以看出，该方法对于检测目标物的定量限分别为：四环素2ng/ml、链霉素1.5ng/ml、磺胺甲基异噁唑10ng/ml、环丙沙星0.5ng/ml、多菌灵1ng/ml和氟氯氰菊酯20ng/ml。该方法精密度较高：孔间cv值低于10％，孔内cv值低于5％。

本实施例对利用该方法对蜂蜜样本中的四环素、链霉素、磺胺甲基异噁唑、环丙沙星、多菌灵和氟氯氰菊酯的含量检测方法准确度、精密度等进行了考察，结果如下表：

表1蜂蜜样本中多种农药、兽药残留检测方法验证结果

以上结果说明本发明提供的生物芯片及方法适于实际样品的检测，利用该生物芯片及方法也可检测其他食品中的农兽药残留，包括牛奶、奶粉、奶酪、饲料、尿液、动物组织(如猪肉、牛肉、鸡肉、猪肝或鸡肝等)、血清、蜂蜜、蜂皇浆、鸡蛋和水产品(如鱼或虾等)、水果、蔬菜。

实施例2

同时定量检测猪肉样本中的克伦特罗、莱克多巴胺、磺胺嘧啶、强力霉素、氧氟沙星、氟苯尼考、林可霉素、苯乙醇胺a的含量。

检测步骤如下：

(1)生物芯片的制备：采用与实施例1相同的方法，区别在于：用克伦特罗-bsa、莱克多巴胺-bsa、磺胺嘧啶-klh、强力霉素-ova、氧氟沙星-bsa、氟苯尼考-bsa、林可霉素-ova、苯乙醇胺a-bsa代替实施例1中的抗原；

(2)待测样品溶液的制备：取粉碎猪肉样品5g，加入8ml缓冲液，混合5min，置50℃水浴下放置30min，离心10min，取50μl上清液，加入450μl缓冲液混匀，取50μl即得待测样品溶液；

(3)在96孔板的部分反应孔内分别加入25μl含不同浓度梯度的游离克伦特罗、莱克多巴胺、磺胺嘧啶、强力霉素、氧氟沙星、氟苯尼考、林可霉素、苯乙醇胺a的混合标准溶液，在剩余的反应孔内分别加入25μl待测样品溶液，向所述已经加入了混合标准溶液或样品溶液的反应孔内继续加入25μl所述克伦特罗、莱克多巴胺、磺胺嘧啶、强力霉素、氧氟沙星、氟苯尼考、林可霉素、苯乙醇胺a对应的hrp酶标记的单克隆抗体混合溶液，在20℃水浴反应20min，然后磷酸缓冲液洗涤；

(4)在每个反应孔内继续加入50μl显色剂，显色剂为鲁米诺-过氧化物体系；

(5)用ccd进行图像采集并且分析含量，采用与实施例1中相同的方法。

实施例3

同时定量检测白菜中的甲草胺、百菌清、溴氰菊酯、吡虫啉、甲基对硫磷、多菌灵、克百威、甲萘威的残留量。

(1)生物芯片的制备：采用与实施例1相同的方法，区别在于：用甲草胺-ova、百菌清-bsa、溴氰菊酯-bsa、吡虫啉-bsa、甲基对硫磷-bsa、多菌灵-bsa、克百威-bsa、甲萘威-bsa代替实施例1中的抗原；

(2)待测样品溶液的制备：取白菜叶5g，加入5ml水，粉碎后加入10ml乙酸乙酯，涡旋后离心；取5ml离心后的上层溶液，氮气流下吹干；吹干后加入1mlpbs溶液，摇晃溶解，得到的溶液待用；

(3)在96孔板的部分反应孔内分别加入50μl含不同浓度梯度的游离甲草胺、百菌清、溴氰菊酯、吡虫啉、甲基对硫磷、多菌灵、克百威、甲萘威的混合标准溶液，在剩余的反应孔内分别加入50μl待测样品溶液，向所述已经加入了混合标准溶液或样品溶液的反应孔内继续加入50μl所述甲草胺、百菌清、溴氰菊酯、吡虫啉、甲基对硫磷、多菌灵、克百威、甲萘威对应的碱性磷酸酶标记的单克隆抗体混合溶液，在20℃水浴反应20min，然后磷酸缓冲液洗涤；

(4)在每个反应孔内继续加入50μl显色剂，显色剂为3-(2-螺旋金刚烷-4-甲氧基-4-甲基-4-(3-磷酸氧基)-苯基-1，2-二氧乙烷(amppd)溶液；

(5)用ccd进行图像采集并且分析含量，采用与实施例1中相同的方法。