一种用于完整细胞亲和筛选的色谱柱的制作方法

本实用新型涉及生物医药技术领域，更具体地，本实用新型公开了一种适用于完整细胞亲和筛选的色谱柱。

背景技术：

抗体库技术出现于上世纪80年代，它最初将人或动物的抗体编码基因克隆到噬菌体的基因组中，并在噬菌体的表面表达展示抗体可变区肽段（噬菌体展示，phagedisplay），然后通过多轮的“抗原吸附-洗脱-扩增”筛选过程，最终筛选到的针对目标抗原的的抗体克隆。除了噬菌体展示外，后来还出现了核糖体展示、mrna展示、细菌展示、酵母展示等多种展示技术。

在抗体库技术出现之前，传统的抗体筛选方法采用小鼠杂交瘤技术，需要多次注射动物、抽取腹水、细胞融合、杂交瘤筛选，步骤繁琐、耗时长，并且筛得的动物抗体需要经过人源化才能用于人体。而抗体库技术完全在体外完成抗体筛选，高通量、步骤少、时间短，并且可以直接获得全人源抗体。

随着生物医药的发展，抗体已经成为一种重要的药物，尤其在恶性肿瘤和自身免疫疾病的治疗上展现出卓越的疗效和良好的安全耐受性，目前全球范围内抗体药物已经占生物制品50%的销售额。抗体药物的靶向抗原大多是膜蛋白，如肿瘤表面抗原、细胞表面受体等，cd20（白细胞分化抗原20）、egfr（表皮生长因子受体）、her2（人表皮生长因子受体2）、vegfr（血管内皮因子受体）、il-6r（白介素6受体）等靶向治疗的热门靶点都是膜蛋白。

在采用抗体库技术筛选抗膜蛋白抗体时，保持蛋白的天然构象至关重要，因此常规的固相筛选难以胜任，而对表达这些抗原的完整细胞进行筛选可以避免构象改变引起的问题。为了提高抗体筛选的成功率，往往通过基因重组技术构建靶向抗原高表达细胞株，使靶向抗原以高丰度表达于细胞膜表面，然后把噬菌体抗体库先与重组前的原始细胞株孵育、去除非特异性结合的噬菌体，再与靶向抗原高表达细胞株共同孵育、离心去除未结合的噬菌体、洗脱收获特异性结合的噬菌体，每个筛选过程往往要重组3-5轮以减少假阳性、提高成功率。

现有的完整细胞筛选抗体库的方法需要经过多次试验探索最佳孵育和洗脱条件，并且每轮试验均须孵育、离心、洗脱等多个步骤的人工操作，过程较为繁琐，并且难以自动化、标准化，更不便于监测和研究结合、洗脱的过程。

技术实现要素：

为了提高完整细胞筛选抗体库这一试验流程的便利性、减少人工操作，本实用新型提供了一种色谱柱，能够将“孵育、离心、洗脱”的试验步骤转化为液相色谱“上样、洗涤、洗脱”的过程，结合液相色谱仪，可实现自动化筛选和实验条件优化。

本实用新型的技术方案如下：

一种细胞色谱柱，用于以完整细胞为固定相的色谱，包括进口（2）、柱体（1）、出口（3）、凝胶（4）、完整细胞（5），和配套使用的进口盖（6）、出口盖（7）、进口接头（8）、出口接头（9）；所述的进口（2）、出口（3）位于柱体（1）的两端；在进行色谱操作时，进口（2）、出口（3）分别与进口接头（8）、出口接头（9）连接，进口接头（8）、出口接头（9）可进一步与液相色谱仪（10）的液体管道连接；在不进行色谱操作时，进口（2）、出口（3）分别盖上进口盖（6）、出口盖（7），以便于保存；进口盖（6）、出口盖（7）内有密封垫片（11），盖子拧紧或卡紧后可以防止凝胶（4）污染或泄漏，松开后可给凝胶（4）通气；所述的凝胶（4）位于柱体（1）内，凝胶（4）体积占柱体（1）容积不少于1/3；所述的完整细胞（5）均匀分布于凝胶（4）中，在凝胶（4）中的浓度为1×10⁵细胞/ml至1×10⁷细胞/ml。

柱体（1）使用透明的玻璃、塑料或石英制成，柱体（1）有用于光学观察的两个平行平面（14、15）（如图4所示）；优选的，柱体（1）内表面为光滑的平面或曲面，无尖锐的夹角或死角（如图1所示）。

细胞色谱柱还可以具有控温层（12）、保温层（13），其中控温层（12）包裹于柱体（1）的外围，保温层（13）包裹于控温层（12）的外围，控温层（12）、保温层（13）可拆卸，如通过尼龙搭扣、磁吸或物理卡扣、旋钮等方法固定于柱体（1）的外围。

所述的凝胶（4）是温度敏感性水凝胶，如羟丙基甲基纤维素、聚异丙基丙烯酰胺或其衍生物，能在4℃至40℃之间进行固态、液态的转换。

此外，所述的凝胶（4）也可以是光敏感性凝胶，如甲基丙烯酸酐或马来酸酐改性的透明质酸衍生物、硫酸软骨素衍生物、普鲁兰多糖衍生物等，或者任何适用于活细胞培养并具有一定酸、碱、高离子浓度耐性的水凝胶。

优选的，所述的凝胶（4）是非离子型水凝胶，能够耐ph3.0的弱酸性或150mmol/l氯化钠溶液的离子浓度。

优选的，所述的色谱柱进口（2）中轴线与柱体（1）中轴线呈30°至60°夹角（如图2所示），当柱体（1）水平放置时，进口（2）的外沿不低于柱体（1），使柱体（1）内的溶液不外溢。

本实用新型的有益效果是，所述的细胞色谱柱与液相色谱仪连接后，可通过设置液相色谱仪的程序，自动化完成细胞色谱柱平衡、抗体库上样、洗涤、洗脱等流程，实现抗体库的自动化筛选；并且可方便地通过优化上样、洗涤、洗脱等条件，提高抗体库筛选的精度，减少漏筛、误筛；也有利于抗体库筛选过程的标准化，减少人为因素造成的实验失败。

附图说明

图1、一种细胞色谱柱的结构图（纵剖面）；

图2、一种细胞色谱柱的结构图（纵剖面）；

图3、一种细胞色谱柱的结构图（纵剖面）；

图4、一种细胞色谱柱的结构图（横截面）；

图5、进口接头形状结构示意图；

图6、出口接头形状结构示意图;

图7、一种细胞色谱柱与液相色谱仪及相关配件的连接方式示意图;

附图标记：柱体（1）、进口（2）、出口（3）、凝胶（4）、完整细胞（5）、进口盖（6）、出口盖（7）、进口接头（8）、出口接头（9）、液相色谱仪（10）、密封垫片（11）、控温层（12）、保温层（13）、平行平面一（14）、平行平面二（15）、缓冲液瓶（16）、分部收集器（17）、废液瓶（18）。

具体实施方式

实施例1、一种细胞色谱柱的制备方法

用基因重组技术将膜蛋白如人表皮生长因子受体2（her2）的编码基因插入中国仓鼠卵巢（cho）细胞基因组，筛选在细胞膜表面高表达膜蛋白her2的cho细胞株，记作cho/mher2，将细胞株在无血清培养基（如dmem/f12培养基）中大量扩增，总数达到1×10⁸个细胞以上。

将细胞色谱柱的出口盖装到柱体上、使出口密闭。将凝胶形成剂加入含有细胞的溶液内，或将细胞悬液加入凝胶形成体系内，混匀，使细胞在凝胶中的终浓度达到1×10⁵细胞/ml至1×10⁷细胞/ml，然后从进口灌入柱体内，然后装上进口盖，根据所选凝胶形成剂的性质进行控温（在柱体外包裹控温层、保温层）、光照（从柱体的平面处照入光线）或静待一段时间，直至凝胶形成。

凝胶形成后，细胞色谱柱制备完毕，根据细胞和凝胶的性质可选择将色谱柱保存于室温（保存时间一般不超过5天）或冷藏于4℃（保存时间一般不超过2周）。可以采用光学显微镜从柱体的平面观测细胞的形状以评价细胞的状态。

为了方便噬菌体抗体库负筛选，可按同样方法制备一根凝胶中含有未重组的空白cho细胞的细胞色谱柱。

实施例2、一种细胞色谱柱的结构

一种细胞色谱柱，包括进口、柱体、出口、凝胶、完整细胞，和配套使用的进口盖、出口盖、进口接头、出口接头；所述的进口、出口位于柱体的两端；在进行色谱操作时，进口、出口分别与进口接头、出口接头连接，进口接头、出口接头可进一步与液相色谱仪的液体管道连接；在不进行色谱操作时，进口、出口分别盖上进口盖、出口盖，以便于保存；进口盖、出口盖内有密封垫片，盖子拧紧后可以防止凝胶污染或泄漏，不拧紧、留有一定缝隙时可给凝胶通气；所述的凝胶位于柱体内，凝胶体积占柱体容积1/3；所述的完整细胞（cho/mher2或空白cho细胞）均匀分布于凝胶中，浓度为5×10⁶细胞/ml。

柱体使用透明的玻璃制成，柱体有用于光学观察的两个平行平面；柱体内表面为光滑的平面或曲面。

还具有控温层、保温层，其中控温层包裹于柱体的外围，保温层包裹于控温层的外围，控温层、保温层可拆卸，通过物理卡扣固定于柱体的外围，控温层为电热装置，能控制温度恒定在室温至40℃之间的某一设定值；保温层为聚氨酯保温材质。

所述的凝胶是温度敏感性水凝胶羟丙基甲基纤维素(hpmc)。

所述的色谱柱进口与柱体呈45°倾斜，当柱体水平放置时，进口的外沿高于柱体，使柱体内的溶液不外溢。

实施例3、一种细胞色谱柱的结构

一种细胞色谱柱，包括进口、柱体、出口、凝胶、完整细胞，和配套使用的进口盖、出口盖、进口接头、出口接头；所述的进口、出口位于柱体的两端；在进行色谱操作时，进口、出口分别与进口接头、出口接头连接，进口接头、出口接头可进一步与液相色谱仪的液体管道连接；在不进行色谱操作时，进口、出口分别盖上进口盖、出口盖，以便于保存；进口盖、出口盖内有密封垫片，盖子拧紧后可以防止凝胶污染或泄漏，不拧紧、留有一定缝隙时可给凝胶通气；所述的凝胶位于柱体内，凝胶体积占柱体容积3/4；所述的完整细胞均匀分布于凝胶中，在凝胶中的浓度为1×10⁷细胞/ml。

柱体使用透明的塑料聚苯乙烯制成，柱体有用于光学观察的两个平行平面。

所述的凝胶是非离子型水凝胶mal-pva-peg（聚乙烯马来酰亚胺—聚乙二醇）。

所述的色谱柱进口中轴线与柱体中轴线呈45°夹角，当柱体水平放置时，进口的外沿不低于柱体，使柱体内的溶液不外溢。

实施例4、一种细胞色谱柱的结构

一种细胞色谱柱，包括进口、柱体、出口、凝胶、完整细胞，和配套使用的进口盖、出口盖、进口接头、出口接头；所述的进口、出口位于柱体的两端；在进行色谱操作时，进口、出口分别与进口接头、出口接头连接，进口接头、出口接头可进一步与液相色谱仪的液体管道连接；在不进行色谱操作时，进口、出口分别盖上进口盖、出口盖，以便于保存；进口盖、出口盖内有密封垫片，盖子拧紧后可以防止凝胶污染或泄漏，不拧紧、留有一定缝隙时可给凝胶通气；所述的凝胶位于柱体内，凝胶体积占柱体容积2/3；所述的完整细胞均匀分布于凝胶中，在凝胶中的浓度为1×10⁵细胞/ml。

柱体使用透明的塑料聚苯乙烯制成，柱体有用于光学观察的两个平行平面。

所述的凝胶是马来酸酐改性的透明质酸水凝胶，属于光敏感性水凝胶。

所述的色谱柱进口与柱体呈45°倾斜，当柱体水平放置时，进口的外沿高于柱体，使柱体内的溶液不外溢。

实施例5、一种细胞色谱柱的的使用方法

如图7所示，进行液相色谱时，将含有cho/mher2的细胞色谱柱a和含有空白cho细胞的细胞色谱柱b的进口、出口分别与进口接头、出口接头连接，进口接头、出口接头进一步与液相色谱仪的液体管道连接，缓冲液瓶（16）、分部收集器（17）、废液瓶（18）也分别与液相色谱仪连接，启动液相色谱仪，通过设置程序自动化完成以下噬菌体抗体库筛选过程：

步骤一（负筛选）：首先使细胞色谱柱b流过3个柱体积的平衡缓冲液（如无血清细胞培养基dmem/f12），然后将重悬于平衡缓冲液中的噬菌体抗体库上样，使其流经细胞色谱柱b，可反复3-5次以充分去除与空白细胞表面结合的噬菌体。

步骤二（正筛选）：使细胞色谱柱a流过3个柱体积的平衡缓冲液（如无血清细胞培养基dmem/f12），然后将步骤一中完成负筛选的噬菌体抗体库上样，使其流经细胞色谱柱a，可反复3-5次以使与膜蛋白her2特异性结合的噬菌体充分结合。然后加入洗脱缓冲液（如含0.1%牛血清白蛋白的ph3.0的甘氨酸-盐酸缓冲液），洗脱结合于细胞色谱柱a的噬菌体，进行扩增或其他下一步操作。

步骤三（柱清洗）：噬菌体抗体库筛选完毕后，用2到3个柱体积的洗脱缓冲液清洗细胞色谱柱a、b，再用5个柱体积的平衡缓冲液平衡细胞色谱柱a、b。

最后从液相色谱仪上取下细胞色谱柱a、b，盖上进口盖和出口盖，根据凝胶性质和后续实验的需求确定保存于37℃、室温或4℃。可以采用光学显微镜从柱体的平面观测细胞的形状以评价细胞的状态，以确定细胞色谱柱是否可继续使用。