基于锯齿形梯度的高分辨液相色谱的制作方法

本发明涉及一种用于分析聚合物样品的方法，该方法包括采用包含用于所述聚合物样品的至少一种非溶剂(s1)和至少一种溶剂(s2)的混合物的流动相在色谱柱上进行液相色谱分析，其特征在于在所述洗脱过程期间所述流动相中s2的体积比例以逐阶(stepwise)的方式变化，并且所述阶交替地升高和降低。
背景技术：
：iupac对色谱法的定义如下：“色谱法是一种物理分离方法，其中待分离组分在两相之间分配，其中一相是固定的(固定相)，而另一相(流动相)则沿确定的方向移动。”对于液相色谱(lc)，iupac阐述为：“液相色谱法是一种分离方法，其中流动相是液体。液相色谱法能够在柱中或塔板(plate)上进行。”液相色谱法包括诸如sec(尺寸排阻色谱法)、hplc(高压液相色谱法)和ic(离子色谱法)之类的分离方法。液相色谱能够根据流动相的组成进一步细分为等度分析(isocraticanalysis)和梯度分析。在等度分析中，流动相的组成在整个洗脱过程中保持恒定，而在梯度分析中，所述组成以连续或逐阶的方式变化。聚合物是由单体形成的大分子。因此，序列结构/单个重复单元和相应反应方法会导致大分子在不同物质尺寸方面具有分布。取决于所述化学组成，可能会出现关于化学官能度、摩尔质量或结构的分布。所述多分散性指示，例如，摩尔质量分布有多窄或多宽。鉴于聚合物，特别是共聚物、改性聚合物或聚合物混合物在工业上的重要意义，基于化学结构的有效分离方法则备受关注。由于现有方法(例如尺寸排阻色谱法，sec)通常仅提供平均值，则基于梯度洗脱的聚合物hplc目前成为深入研究的重点。通过梯度分析进行聚合物分析的hplc方法在现有技术中是已知的。具体而言，w.j.staal(埃因霍温大学(eindhovenuniversity)，1996年，论文(dissertation))很好地概述了梯度洗脱色谱法(gec)的起源和发展。进一步的综述则提供于gottfried的“gradienthplcofcopolymersandchromatographiccross-fractionation”(springerverlag，1991)中。尽管ep3170836a1公开了采用逐阶梯度的rp-hplc(反相)分析方法，但这仅对于复杂多肽混合物如醋酸格拉替雷(glatirameracetate)或类似混合物进行了描述。在这种方法中，溶剂/非溶剂混合物会随着时间逐阶变化。在一个具体的实施方式中，不太极性的溶剂每4-6分钟增加2vol％-4vol％。因此，这时的曲线类似于阶梯函数(stepfunction)。kajdanetal.(j.chromatogr.a1189(2008)183-195)公开了一种采用之字形梯度(“尖峰(spike)”梯度)的二维梯度方法用于多肽分析。在此方法中，流动相的组成在恢复原始组成(100％流动相a)之前维持一段确定的时间。然而，该梯度在第一维(firstdimension)中用于阳离子交换，而在rp-lc(反相lc)中，在第二维(seconddimension)中使用标准线性梯度。sprangeretal.(environ.sci.technol.2017,51,5061-5070)公开了一种环境hulis(atmospherichulis)(腐殖质样物质(humic-likesubstances))的二维分析方法，该方法将一维sec(尺寸排阻色谱)和其它维度的rp-hplc相结合。对于rp-hplc，采用了一种新型的之字形梯度(“尖峰”梯度)，其中流动相中有机溶剂的比例有规律地增加，减少和保持恒定。然而，现有技术确实具有以下缺点：-聚合物分离方面，特别是在低聚物分辨率方面仍然存在不足之处-洗脱时间长-不是聚合物适用的方法因此，仍存需要提供一种不具有这些缺点的聚合物或聚合物混合物分析方法。技术实现要素：该目的通过一种用于分析聚合物样品的方法来实现，该方法包括采用用于所述聚合物样品的至少一种非溶剂(s1)和其至少一种溶剂(s2)的混合物的流动相在色谱柱上进行液相色谱分析，其特征在于在洗脱过程期间，流动相中s2的体积比例以逐阶的方式变化，并且所述阶交替地升高和降低。令人惊讶的是，现在已经发现，具有交替升高和降低阶的梯度，即所谓的“锯齿形梯度(sawtoothgradient)”，在聚合物和聚合物混合物的情况下实现了改进的分离效果，并且还能够很好地分离高分子量聚合物。附图说明图1a-图1c显示了梯形形式(1a)、之字形形式(1b)和柱形形式(1c)的二维阶形梯度(“锯齿形梯度”)的示意性结构。图2a显示了以线性梯度测量的pvc的色谱图，图2b显示了以阶形梯度测量的pvc的色谱图，而图2c显示了以梯形形式的锯齿形梯度测量的pvc的色谱图(参见实施例1)。图3a显示了以线性梯度测量的pmma的色谱图，图3b显示了以梯形形式的锯齿形梯度测量的pmma的色谱图(参见实施例3)。图4a显示了以线性梯度测量的ppg的色谱图，图4b显示了以梯形形式的锯齿形梯度测量的ppg的色谱图(参见实施例3)。图5a显示了用线性梯度测量的pdms的色谱图，图5b显示了用梯形形式的锯齿形梯度测量的pdms的色谱图(参见实施例3)。图6a显示了以梯形形式的二维锯齿形梯度测量的pmma690,000的色谱图，图6b显示了以梯形形式的三维锯齿形梯度测量的pmma690,000的色谱图(参见实施例4)。图7显示了采用梯形形式的锯齿形梯度进行测量的具有类似平均摩尔质量的pdms、pmma和ppg的混合物的色谱图(参见实施例5)。具体实施方式定义：本发明的目的是一种分析聚合物样品的方法，该方法包括在色谱柱上采用包含用于所述聚合物样品的至少一种非溶剂(s1)和其至少一种溶剂(s2)的混合物的流动相进行液相色谱分析，其特征在于，在洗脱过程期间，流动相中s2的体积比例以逐阶的方式变化，并且所述阶交替地升高和降低。为了本发明的目的，聚合物样品可以是聚合物或聚合物混合物。就本发明而言，聚合物应该理解为是指由重复的结构单元组成并具有几千至几百万g/mol范围内的平均摩尔质量的化学物质；这既包括均聚物也包括共聚物。此类聚合物的实例是合成有机聚合物，如聚氯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚乙酸乙烯酯、聚碳酸酯、聚(甲基)丙烯酸酯、聚苯乙烯、聚丙烯腈，聚偏二氯乙烯、聚氟乙烯、聚偏二氟乙烯、聚偏二氰乙烯、聚丁二烯、聚异戊二烯、聚醚、聚酯、聚酰胺、聚酰亚胺、聚硅氧烷、聚硅烷、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酰胺、聚乙二醇及其衍生物和共聚物，以及纤维素、淀粉、酪蛋白和天然橡胶等天然聚合物，并且还有半合成高分子量化合物如纤维素衍生物，例如，甲基纤维素、羟甲基纤维素和羧甲基纤维素。聚合物混合物优选包含至少两种来自该组的聚合物。对于本发明的目的，聚(甲基)丙烯酸酯应该理解为是指聚丙烯酸酯和聚甲基丙烯酸酯，以及聚丙烯酸烷基酯和聚甲基丙烯酸烷基酯，烷基优选是直链或支链的c1-c20烃基。聚(甲基)丙烯酸酯的实例是聚(甲基)丙烯酸甲酯、聚(甲基)丙烯酸乙酯、聚(甲基)丙烯酸丁酯和聚(甲基)丙烯酸异丁酯。对于本发明的目的，聚硅氧烷应该理解为是指通式(i)的化合物(sio4/2)a(rxsio3/2)b(rx2sio2/2)c(rx3sio1/2)d(i)，其中rx独立地是氢，直链的、支链的、非环状的或环状的饱和或单-或多-不饱和c1-c20烃基，羟基，乙烯基，烷氧基，氨基，卤素或通式(ii)的甲硅烷氧基，(sio4/2)e(rysio3/2)f(ry2sio2/2)g(ry3sio1/2)h(ii)，其中ry独立地是氢，卤素，非支链的、直链的、支链的、非环状的或环状的饱和或多饱和c1-c20烃基，其中单个碳原子可以被氧、卤素、氮或硫取代，并且a、b、c、d、e、f、g和h各自独立地是0-100,000范围内的整数，其中a、b、c和d之和以及e、f、g和h之和在每种情况下至少为1。优选的rx和ry是氢、甲基、乙基、丙基、苯基和氯，最优选甲基。聚硅氧烷的实例是聚二甲基硅氧烷和氨基聚二甲基硅氧烷。通常使用的聚合物具有1000-2,000,000g/mol的平均摩尔质量。所使用的聚氯乙烯通常具有20,000-1,000,000g/mol范围内的平均摩尔质量，所使用的聚(甲基)丙烯酸酯通常具有15,000-2,000,000g/mol范围内的平均摩尔质量，所使用的聚硅氧烷和聚硅烷通常具有1000-500,000g/mol范围内的平均摩尔质量，使用的聚苯乙烯通常具有8000-2,000,000g/mol范围内的平均摩尔质量，使用的聚丙二醇通常具有4000-30,000g/mol范围内的平均摩尔质量，所使用的聚乙烯醇和聚乙酸乙烯酯通常具有1000-100,000g/mol范围内的平均摩尔质量。对于色谱柱通常没有限制。所使用的色谱柱可以是本领域技术人员已知用于液相色谱的任何柱子，特别是市售柱子，即sec柱、hplc柱和ic柱。sec柱和hplc柱是优选的，并且hplc柱是特别优选的。用于液相色谱分析的流动相包含用于所述聚合物样品的至少一种溶剂(s2)和至少一种非溶剂(s1)的混合物。非溶剂应该理解为是指所述聚合物样品在其中的溶解度低于在所述溶剂中的溶解度的所有液体。本领域技术人员能够从专业文献(例如，《聚合物数据手册(polymerdatahandbook)》，第二版，2009，牛津大学出版社)中确定在每种情况下哪种液体能够用作聚合物或聚合物混合物的溶剂或非溶剂。溶剂和非溶剂可以，例如，独立地选自由四氢呋喃(thf)、甲苯、环己烷、乙醚、四氯甲烷、二氯甲烷、氯仿、1,4-二噁烷、n,n-二甲基乙酰胺、n,n-二甲基甲酰胺、苯甲醇、甲乙酮、乙酸乙酯、丙酮、乙腈、二甲基亚砜、六氟异丙醇、2-丙醇、甲醇、水及其混合物组成的组中。溶剂和非溶剂优选独立地选自由thf、六氟异丙醇、甲醇、丙酮、水及其混合物组成的组中。对于本发明的目的，s1表示非溶剂，s2表示溶剂。在洗脱开始时，使用了其中s2具有一定vol％比例的混合物，该比例被称为起始比例(sp)。洗脱开始时，通常使用100:0vol％的s1:s2混合物。根据本发明的分析方法能够以一个以上的维度进行，并因此能够称为n-维，其中维度的数量与流动相中使用的液体组分的数量有关。s2的体积比例以逐阶的方式变化，该阶交替地升高和降低(参见图1a-图1c)。该阶的形式能够由本领域技术人员根据需要通过改变下述那些的各参数进行选择。为了描述所述阶，由该梯度所基于的柱体积t'(公式1和2)计算出时间段t。通常而言，t'能够在0.1-1.2ml的范围内自由选择。表1：参数的定义t'柱体积[ml]t有效柱体积[min]flc流速[ml/min]l有效阶长[min]ltot锯齿形梯度的总长度[min]a负斜率[s2的vol％]b有效阶高[s2的vol％]c负斜率的延迟(因子)d下平台的持续时间[因子]e正斜率的延迟(因子)h总锯齿高度[s2的vol％]通过参数a、b、c、d和e，可以定义柱状、梯形、之字形或“锯齿”形的阶(参见图1a-图1c)。在一个具体实施方式(二维)中，流动相由非溶剂s1和溶剂s2组成，流动相的组成随时间如下变化：其中参数a、b、c、d和e能够自由选自以下范围a：0.01vol％-100vol％的s2和b：0.01vol％-100vol％的s2和c：0-100和d：0-100和e：0-100。使用以下公式(3-5)计算流动相的组成，这些公式描述了二维锯齿形梯度(参见图1a-图1c和表2)：l＝t+c·t+d·t+e·t(3)h＝a+b(5)每个阶x以时间段t开始，在该时间段内，s2的比例保持于相应阶的“起始比例”(spn)，即spn＝sp+(x-1)*b。在随后的时间段c·t中，s2的比例减少了比例a(例如，6vol％)，因此为(sp+(x-1)*b-a)。在随后的时间段d·t，这些比例保持恒定。在随后的时间段e·t期间，s2的起始比例增加了比例b(例如，0.2vol％)，因此为(sp+x*b)。这些比例对应于相应阶的终值，同时对应于下一阶的起始比例。然后开始下一阶。在每种情况下s1的比例为(100-s2)vol％。对于多个阶而言，由于所述降低的阶，最初会计算出s2比例的负值。然而，这种负值在数学上是不可能的，因此将其设置为s2的初始比例的水平，直到计算出s2的正值。表2再次显示了作为前两个阶的数学实例的组成变化。这种计算相应地继续直到最后的阶，在该阶中达到100vol％的s2比例。所需阶的数目能够由公式4计算出。表2：二维锯齿形梯度的流动相组成随时间的变化表3：对于a＝6vol％，b＝0.2vol％，c＝1，d＝3，e＝1，s2的比例的示例性计算当使用二维锯齿形梯度时，液体组分优选是thf和甲醇。在该实施方式的进一步实现中，在每种情况下该方法通过使用先前的溶剂作为非溶剂并选择新的溶剂，在每种情况下以不同的流动相至少重复一次。这种特殊的方法特别适用于聚合物混合物的分析。在每种情况下选择的非溶剂是适合作为聚合物混合物中至少部分聚合物的溶剂的一种非溶剂。这通过聚合物在各种流动相中的不同溶解度实现了将所述聚合物混合物分离成单个聚合物。例如，在第一次通过中，因此甲醇用作非溶剂，而丙酮用作溶剂，而在第二次通过中，丙酮用作非溶剂，而thf用作溶剂。此过程是二维梯度的特例。在另一个具体实施方式(3维)中，流动相由两种非溶剂s1和s1'和溶剂(s2)组成，流动相的组成随时间如下变化：其中参数a、b、c、d和e能够自由选自以下范围a：0.01vol％-100vol％的s2和b：0.01vol％-100vol％的s2和c：0-100和d：0-100和e：0-100。使用以下公式(6)和(7)计算流动相的组成变化，这些公式描述了三维锯齿形梯度(参见表4)：l3d＝t+c·t+d·t+0,01+t+e·t(6)每个阶x以时间段t开始，在该时间段内，s1、s2和s1'的比例保持为相应阶的“起始比例”(spn)，即spn＝sp+(x-1)*b。在阶1中，s2的比例对应于起始比例sp。在随后的时间段c·t期间，s2的比例减少了a至(sp+(x-1)*b-a)。s1的比例为(100-s2)vol％。组分s1'的比例为0vol％。在随后的时间段d·t期间，s1、s2和s1′的先前比例保持恒定。在随后的时间段期间，s2进一步保持恒定长达0.01秒。然而，现在s1'的比例为(100-s2)vol％，s1的比例为0vol％。在随后的时间段t期间，s1、s2和s1'的先前比例保持恒定。在随后的时间段e·t期间，s2的起始比例增加了比例b(例如，0.2vol％)至(sp+x*b)。现在s1'的比例为(100-s2)vol％，而s1的比例仍为0vol％。这些比例对应于相应阶的终值，同时对应于下一阶的“起始比例”。然后开始下一阶。对于多个阶，由于所述降低的阶，s2的比例最初计算为负值。然而，这种负值在数学上是不可能的，因此将其设置为s2的初始比例sp的水平，直到计算出s2的正值。表4再次显示了作为前两个阶的数学实例的这些组成变化。该计算相应地继续直到最后阶，在该阶中s2的比例达到100vol％。所需的阶数能够由公式7计算出。表4：3-维锯齿形梯度的流动相组成随时间的变化参数a、b、c、d和e通常能够自由选自以下范围a：0.01vol％-100.0vol％的s2和b：0.01vol％-100.0vol％的s2和c：0-100。和d：0-100。和e：0-100。此处唯一的限制可能是lc仪器和泵的技术细节。所述值c、d和e优选大于0。参数a、b、c、d和e优选选自以下范围a：3.0vol％-12.0vol％的s2和b：0.2vol％-1.0vol％的s2和c：0.5-3.0和d：0.5-3.0e：0.1-2.0。参数a、b、c、d和e特别优选具有以下值：a：6.0vol％，b：0.2vol％，c：1.0，d：3.0，e：2.0。实施例所用的材料：hplc：1)具有二元泵的thermofisherscientificultimate30002)具有四元泵的thermofisherscientificultimate30003)具有二极管阵列检测器hl的thermofisherscientificvanquishuhplc(检测波长215nm)检测器：agilent385elsd柱子1：poroshellc18，50×4.6mm，2.7μm(agilent)柱子2：poroshellc18，100×4.6mm，2.7μm(agilent)柱子3：hypersilbdsc18，100×4.6mm，2.4μm(thermofisher)柱子4：lunac18，100×4.6mm，5μm(phenomenex)柱子5：hypersilgoldc18aq，100×10mm，5μm(thermofisher)柱子6：accucorec18，50×4.6mm，2.6μm(thermofisher)柱子7：poroshellhilic，50×4.6mm，2.7μm(agilent)以下用于流动相：四氢呋喃(未稳定处理，hplc级，merckdarmstadt)，甲醇(hplc级，merckdarmstadt)和超纯水(电导率18.5mohm·cm，toc<4ppb)。表5：使用的聚合物标准品的概述参数优化的初步测试所用的测试分析物是聚苯乙烯(mp＝19,600g/mol，多分散度1.03，psspolymerstandardservices，mainz)。将聚苯乙烯以c＝25mg/ml的浓度溶解于thf中，进样量为5μl。分析在hplc仪器2上进行。基于taguchi的l16(45)测试计划设计(“thetaguchiapproachtoparameterdesign”,1986,asqcconferenceproceedings；“taguchi’squalityengineeringhandbook”,2011,johnwiley&sons)修改了优化锯齿形梯度的参数，参见表2。优化的目标变量是(1)分离峰数，(2)分辨率，(3)不对称性，和(4)半峰的峰宽。参数的变化如表2中所示。此外，在五个不同的市售色谱柱上进行了系列测试。据发现，峰的数量以及由此的聚合物分辨率的质量主要是参数b的结果。相比之下，其他目标变量的影响较小。表6列出了每根柱子的优化参数。据发现，参数a-e的最佳值非常相似，因此不依赖于所述柱子。因此，假设是普适最优值(参见表6中的最后一行)。表6：锯齿形梯度进行优化的参数标记参数水平1水平2水平3水平4a负斜率[％]3.06.09.012.0b有效阶高[％]0.20.50.81.0c负斜率的延迟0.51.02.03.0d下平台0.51.02.03.0e正斜率的延迟0.10.51.02.0表7：进行优化的测试计划验证性实验柱子a[％]b[％]cde16.00.21.03.02.026.00.20.52.02.036.00.21.03.02.046.00.21.03.02.056.00.20.50.52.0最优6.00.21.03.02.0实施例1关于总运行时间，有效阶高b也至关重要。实施的阶越多，分辨率越好，但总测量时间也越长。如果要在最小有效阶高处缩短测量时间，则需要考虑有效阶长。由于此变量由单独的明确定义的子阶组成，则这些子阶由于所用泵的梯度混合器的精度而无法进一步缩短，而因此必须找到另一种选项。有效阶长的计算中包括的另一个关键参数是lc流量。采用柱子6的hplc仪器1聚合物的浓度：90mg/ml的pdms，mp＝36500g/mol进样量：5μl流速：1ml/min，2ml/min，3ml/mint＝0.1mina＝6vol％b＝0.2vol％c＝1d＝3e＝1l＝0.2min/0.3min/0.6minh＝6.2vol％据发现，流速从1ml/min增加到3ml/min能够将测量时间降低3倍，而不会对分辨率产生不利影响。实施例2以pvc45,500作为测试分析物(pvc45,500g/mol，polymerlaboratories)，对线性梯度、仅增加阶数的阶形梯度和锯齿形梯度进行了比较。采用柱子6的hplc仪器1聚合物浓度：100mg/ml进样量：1μl(图2a和图2b)，3μl(图2c)流速：1ml/min起始条件为0％thf/100％甲醇，终止条件为100％thf/0％甲醇(用于所有梯度)t＝0.1mina＝6vol％b＝0.2vol％(阶形梯度和锯齿形梯度均具有0.2vol％的有效阶高)c＝1d＝3e＝1l＝1.5minh＝6.2vol％与其他分析技术相比，锯齿形梯度的分辨率得到了显著改善，这能够从增加的峰数清楚地看出(参见图2a-图2c)。实施例3在不同色谱柱上以不同聚合物比较了线性梯度和锯齿形梯度。测试条件如表8所示。采用柱子6或柱子7的hplc仪器1聚合物浓度：15mg/ml进样量：4μl流速：1ml/mint＝0.25mina＝6vol％b＝1vol％c＝1d＝3e＝1l＝0.6minh＝7vol％表8：实施例3的测试条件对于所有聚合物，使用锯齿形梯度时，所述分辨率均显示出明显改善，这表现为峰数增加和峰形改善。例如，这正如柱子6上的pmma和ppg和柱子7上的pdms所示(请参见图3a和图3b-图5a和图5b)。实施例4实施3-维锯齿形梯度的hplc分析，以分离pmma690,000。流动相的组成变化如先前对于3-维锯齿形梯度所述(表4)而进行。使用了以下液体组分：s2＝thf，s1＝水，s1′＝甲醇。为了进行比较，还使用二维锯齿形梯度进行了相同的分析(参见图6a-图6b)。采用柱子6的hplc仪器2聚合物浓度：15mg/ml进样量：4μl流量：2ml/mint＝0.25mina＝6vol％b＝1vol％c＝1d＝3e＝1l＝0.6minh＝7vol％实施例5实施hplc分析以分离3种具有类似平均摩尔质量的聚合物(pmma19,700，ppg18,000，pdms20,800)(参见图7)。为此，采用不同流动相连续两次使用二维锯齿形梯度。锯齿形梯度1在30min内从100vol％甲醇(0vol％丙酮)运行到100vol％丙酮(0vol％甲醇)。随后是锯齿形梯度2，该锯齿形梯度2同样在30min内从100vol％丙酮(0vol％thf)运行到100vol％thf(0vol％丙酮)。(总运行时间60min)。采用柱子6的hplc仪器2聚合物浓度：在每种情况下为20mg/ml进样量：5μl流量：2ml/min参数：t＝0.25mina＝6vol％b＝1vol％c＝1d＝3e＝1l＝0.6minh＝7vol％实施例1-5表明，根据本发明的方法能够用于多种聚合物，甚至那些具有非常大的平均摩尔质量的聚合物，也可以用于多种色谱柱。关于适用性的唯一前提条件是所研究的分析物在色谱柱上要显示出一定程度的保留。然而，这将构成本领域技术人员的一般专业知识的部分。当前第1页12