免疫层析测试条和免疫层析检测试剂盒的制作方法

本发明涉及用于免疫层析的测试条和包括该测试条的免疫层析检测试剂盒。更具体地，本发明涉及具有用特定聚合物处理的样品施加区域的用于免疫层析的测试条，以及包括该测试条的免疫层析检测试剂盒。

背景技术：

随着在患者附近进行治疗的poct(pointofcaretesting，即时检验)的使用变得广泛，使用硝酸纤维素膜等的测试条的侧流式免疫层析检测法作为一种使用抗原特异性结合物反应的简单免疫测定法被广泛使用。

基于免疫层析的测试条(以下称为免疫层析测试条)通常由位于多孔膜上的样品施加区域、展开区域和检测区域组成。与分析物形成复合物的标记的特异性结合物质保持在展开区域的展开开始部位，从而能够当与样本(样品)接触时发生溶解，沿着展开区域向下移动并到达检测区域。固定的特异性结合物质被固定在下游侧的展开区域上的特定点上，以构成检测区域。当将样本滴到样品施加区域上且样本中包含分析物时，样本中的分析物与标记的特异性结合物质进行特异性地结合以形成复合物。该复合物在展开区域中向下游方向展开，并进一步与固定的特异性结合物质结合。因此，分析物可以通过检测在固定有特异性结合物质的部分中的复合物而被定性或定量地分析，所述复合物为标记的特异性结合物质，分析物和固定的特异性结合物质的夹心型复合物。构成检测试剂(缀合物)(例如标记的特异性结合物质)的标记物的实例是胶体金颗粒，并且由胶体金颗粒引起的显色反应使得能够进行定性检测。此外，样本中的分析物可以基于显色程度进行定量检测。

由于样品施加区域(如常规免疫层析测试条的样品垫)没有提供足够的亲水性，样本在预定的测试时间内可能没有充分渗透到样品垫中。因此，测试线上的显色程度可能根据渗透程度而变化。特别地，当样本是全血时，渗透到样品垫中的程度显著变化，这妨碍了精确的测量。

在专利文献1中公开的样本分析工具中，由于从存储免疫层析测试条的塑料基材上洗脱的疏水性成分而导致展开液在展开液供给区域中的渗透性降低，为了防止这种降低而在展开液供给区域的表面设置有由糖、表面活性剂等制成的亲水性成分层。但是，对样品施加中的变化和当没有疏水性成分从塑料基材上洗脱的情况并无研究，在实例中仅具体测试了蔗糖、n-甲基葡萄糖胺、sds和pvp。

引文列表

专利文献

专利文献1：wo2010/116979

技术实现要素：

技术问题

本发明要解决的问题是提供一种免疫层析测试条，其中施加到样品施加区域的样本在测试时间内充分渗透到免疫层析测试条，从而可以防止在测试线上的检测值的变异。特别地，本发明要解决的问题是提供一种即使在样本是全血的情况下也引起较小检测值变异的免疫层析测试条。

解决问题的方法

本发明是为了解决该问题，我们发现，通过在免疫层析测试条的样品施加区域中包含具有特定分子量的聚乙二醇(以下也称为peg)，可以使样本在样品施加区域中快速地渗透测试条，从而能够防止检测值变异，从而完成了本发明。具体地，本发明具有以下构造。

(1)免疫层析测试条，其至少包括样品施加区域、展开区域和检测区域，其中所述样品施加区域含有分子量为15,000至700,000的聚乙二醇。

(2)根据(1)所述的免疫层析测试条，其中所述免疫层析测试条包括作为所述样品施加区域的样品垫。

(3)根据(1)或(2)所述的免疫层析测试条，其中施加于所述样品施加区域的样本是血浆或全血。

(4)根据(1)至(3)中任一项所述的免疫层析测试条，其中施加到所述样品施加区域的样本是全血。

(5)根据(1)至(4)中任一项所述的免疫层析测试条，其中在展开区域中，与分析物结合并用胶体金标记的特异性结合物质保持为可溶解状态。

(6)根据(5)所述的免疫层析测试条，其中所述免疫层析测试条包括缀合物垫，在所述缀合物垫中，与所述分析物结合并用胶体金标记的特异性结合物质保持为可溶解状态。

(7)根据(2)至(6)中任一项所述的免疫层析测试条，其中在所述样品垫和所述检测区域之间放置用于血细胞分离的第三垫。

(8)根据(1)至(7)中任一项所述的免疫层析测试条，其中所述样品施加区域还包含红细胞凝集剂或红细胞结合成分。

(9)根据(8)所述的免疫层析测试条，其中所述红细胞凝集剂是聚凝胺(polybrene)。

(10)根据(1)至(9)中任一项所述的免疫层析测试条，其中所述聚乙二醇在所述样品施加区域的单位面积上的含量为0.00630至0.473mg/cm²。

(11)免疫层析测试条，其至少包括：

(a)含有分子量为15,000至700,000的聚乙二醇的样品垫；

(b)缀合物垫，其中与分析物结合并用胶体金标记的特异性结合物质保持为可溶解状态；和

(c)在其上固定有与分析物结合的特异性结合物质的膜。

(12)根据(11)的所述免疫层析测试条，其中在所述样品垫和所述膜之间放置用于血细胞分离的第三垫。

(13)根据(11)或(12)所述的免疫层析测试条，其中所述样品垫由玻璃纤维制成。

(14)根据(11)至(13)中任一项所述的免疫层析测试条，其中所述缀合物垫由玻璃纤维制成。

(15)免疫层析检测试剂盒，其包括：根据(11)至(14)中任一项所述的免疫层析测试条。

(16)免疫层析测试条的制备方法，该测试条至少包括样品施加区域、展开区域和检测区域，该方法包括：

用含有分子量为15,000至700,000的聚乙二醇的溶液浸渍所述样品施加区域，以及

干燥所述样品施加区域。

(17)根据(16)所述的免疫层析测试条的制备方法，其中所述免疫层析测试条包括作为所述样品施加区域的样品垫。

(18)根据(17)所述的免疫层析测试条的制备方法，其中，

含有分子量为15,000至700,000的聚乙二醇的溶液为在所述溶液中，聚乙二醇浓度被调整为使得在样品垫单位面积上聚乙二醇的保持量为0.00630至0.473mg/cm²的溶液。

(19)免疫层析测试方法，其使用根据(1)至(14)中任一项所述的免疫层析测试条，根据(15)所述的免疫层析检测试剂盒或通过根据(16)至(18)中任一项所述的方法制备的免疫层析测试条，所述方法包括：

将所述样本滴到所述免疫层析测试条的样品施加区域上，以及

在预定时间之后检测所述免疫层析测试条的检测区域的显色。

本发明进一步包括以下方面。

(a-1)在检测样本中分析物的免疫层析检测方法中，通过使用以下免疫层析测试条抑制测量值变异的方法：

免疫层析测试条，其至少包括样品施加区域、展开区域和检测区域，其中所述样品施加区域含有分子量为15,000至700,000的聚乙二醇。

(a-2)根据(a-1)所述的方法，其中所述免疫层析测试条包括作为所述样品施加区域的样品垫。

(a-3)根据(a-1)或(a-2)所述的方法，其中施加到所述样品施加区域的样本是血浆或全血。

(a-4)根据(a-1)至(a-3)中任一项所述的方法，其中施加到所述样品施加区域的样本是全血。

(a-5)根据(a-1)至(a-4)中任一项所述的方法，其中在展开区域中，与分析物结合并用胶体金标记的特异性结合物质保持为可溶解状态。

(a-6)根据(a-5)所述的方法，其中所述免疫层析测试条包括缀合物垫，在所述缀合物垫中，与分析物结合并用胶体金标记的特异性结合物质保持为可溶解状态。

(a-7)根据(a-6)所述的方法，其中在所述样品垫和所述检测区域之间放置用于血细胞分离的第三垫。

(a-8)根据(a-1)至(a-7)中任一项所述的方法，其中所述样品施加区域还包含红细胞凝集剂或红细胞结合成分。

(a-9)根据(a-8)所述的方法，其中所述红细胞凝集剂为聚凝胺。

(a-10)根据(a-1)至(a-9)中任一项所述的方法，其中在所述样品施加区域的单位面积上所述聚乙二醇的含量为0.00630至0.473mg/cm²。

(b-1)在检测样本中分析物的免疫层析检测方法中，通过使用至少包括以下(a)至(c)的免疫层析测试条来抑制测量值变异的方法：

(a)含有分子量为15,000至700,000的聚乙二醇的样品垫；

(b)缀合物垫，其中与分析物结合并用胶体金标记的特异性结合物质保持为可溶解状态；和

(c)在其上固定有与分析物结合的特异性结合物质的膜。

(b-2)根据(b-1)所述的方法，其中在所述样品垫和所述膜之间放置用于血细胞分离的第三垫。

(b-3)根据(b-1)或(b-2)所述的方法，其中所述样品垫由玻璃纤维制成。

(b-4)根据(b-1)至(b-3)中任一项所述的方法，其中所述缀合物垫由玻璃纤维制成。

(c-1)免疫层析测试条，其至少包括样品施加区域、展开区域和检测区域，其中所述样品施加区域含有分子量为15,000至700,000的聚乙二醇，并且其中分析物选自由以下组成的组：

炎症相关标志物、凝血或纤维蛋白溶解标志物(例如纤维蛋白降解产物、可溶性纤维蛋白、tat(凝血酶-抗凝血酶复合物)和pic(纤溶酶-纤溶酶抑制剂复合物))、循环相关标志物(例如氧化的ldl、bnp(脑利钠肽)、h-fabp(心型脂肪酸结合蛋白)和心肌肌钙蛋白i(ctni))、与代谢相关的标志物(例如脂联素)、肿瘤标志物(例如cea(癌胚抗原)、afp(α-胎蛋白)、ca19-9、ca125和psa(前列腺特异抗原))、与传染病相关的标志物(例如hbv(乙型肝炎病毒)、hcv(丙型肝炎病毒)、沙眼衣原体和淋球菌)、变应原特异性ige(免疫球蛋白e)、激素和药物。

(d)使用以下测试条的免疫层析测试方法，该方法包括以下步骤：

将样本滴到测试条的样品施加区域上；

使样品中的分析物与免疫层析测试条的特异性结合物质反应预定的时间；和

光学检测在免疫层析测试条的检测区域中的显色，其中

所述测试条是至少包括样品施加区域、展开区域和检测区域的免疫层析测试条，其中所述样品施加区域含有分子量为15,000至700,000的聚乙二醇。

发明的有益效果

根据本发明，通过在免疫层析测试条的样品施加区域中含有具有特定分子量的聚乙二醇，可以使样本迅速渗透到测试条的样品施加区域中，从而可以防止检测值的变异。此外，由于样本迅速渗透到测试条的样品施加区域中，检测区域在预定的反应时间内可靠地显色，并且可以防止由于检查失败或重新检查而导致检查延迟。特别地，即使样本是全血，也能实现使样本快速渗透到测试条中，并且可以显著地抑制检测值变异。

附图说明

[图1]图1为显示在含有peg(本发明)和不含有peg(对比例)的样品垫的情况下，当样本为血浆时的测量值变异(c.v.)的图。

[图2]图2是显示当改变样品垫中包含的peg的分子量和浓度时测量值变异的图。peg为20k、6k或2k，浓度为0.5％或1.0％。

[图3]图3是显示在含有peg(本发明)和不含有peg(对比例)的样品垫的情况下，当样本是全血时的测量值变异的图。使用血细胞比容值为0(即血浆)、20％、39％或54％的全血。

[图4]图4是显示当样本为血浆时在测量值为100的情况下具有各个血细胞比容值的全血的测量值比例的图。

[图5]图5是显示本发明的免疫层析测试条的示意图。

[图6]图6是显示在将样本溶液滴到样品垫(无peg和0.25％peg20k预处理的样品垫)上即刻、2秒和5秒后的渗透状态的照片。

具体实施方式

(免疫层析测试条)

本发明的免疫层析测试条包括至少具有“样品施加区域”、“展开区域”和“检测区域”的多孔膜。与分析物形成复合物的标记的特异性结合物质被保持在展开区域中，从而能够通过当与样本接触时溶解而沿着展开区域向下移动并到达检测区域。进一步，用于检测的特异性结合物质固定在展开区域的一部分上以构成检测区域。

体现这些要素的测试条的一个实例是包括以下项的测试条：用作样品施加区域的样品垫；缀合物垫(其中，与分析物结合的标记的特异性结合物质保持为可溶解状态并用作展开区域的一部分)；以及用作展开区域和检测区域的多孔膜，其具有在其上固定有用于检测的特异性结合物质的部分。具体地，本发明的典型的免疫层析测试条具有以下构造：

(1)施加样本的样品垫；

(2)被放置在样品垫和包括展开区域的膜之间并与两者进行接触的缀合物垫，该缀合物垫将用第一特异性结合物质敏化的缀合物以可溶解状态保持在胶体金表面上；和

(3)多孔膜，其被放置使得与缀合物垫接触，并具有固定在展开方向下游侧的第二特异性结合物质，该第二特异性结合物质与缀合物和分析物的复合物结合。

样品垫、缀合物垫和多孔膜可以各自构成单独的载体，或者它们中的两个可以构成一个载体，并且可以使用任何形式，只要在展开方向上从上游到下游按样品垫、缀合物垫和多孔膜的顺序放置即可，从而将包含有样本的液体展开。

除上述构成要素外，免疫层析测试条可以进一步具有放置并安装在其上的一个或更多个的吸收垫和第三垫。测试条通常可以布置在固相支持物例如塑料粘合片上。为了增加在其上固定有特异性结合物质的多孔膜的机械强度并防止在测定中的水分蒸发(干燥)，可以在测试条的表面上层叠聚酯膜等。

通过使用本发明的免疫层析测试条而检测样本中分析物的方法，其至少具有以下步骤：

将样本滴到样品施加区域；使样本中的分析物与缀合物接触形成复合物；在检测区域中检测样本中的分析物与缀合物的复合物。

由于本发明的免疫层析测试条的样品施加区域用特定peg进行预处理，样本可以快速地从样品施加区域渗透并移动至展开区域。因此，可以使反应在预定时间内进行到一定程度，从而抑制检测值变异。

(用peg预处理样品施加区域)

在本发明中，样品施加区域的特征在于用分子量为15,000至700,000的聚乙二醇(以下也称为peg)进行预处理。预处理是指将peg包含在样品施加区域中，包括以可溶解状态保留或支撑，或不可洗脱的固定。含有具有特定分子量的peg提供了使样本(也称为样品并具有与样品相同的含义)快速渗透测试条并改善测量值变异的效果。

这是因为，如果分子量小于15,000，则使样本渗透测试条的能力差；如果分子量大于700,000，则peg本身的水溶性变低而使样本渗透到测试条的能力差，从而不能抑制展开中的变异。本发明的peg的分子量更优选为15,000至500,000，进一步优选为15,000至100,000。

除非另有说明，否则本发明中peg的分子量是指数均分子量。数均分子量可以通过羟值分析来测量和计算，并且羟值可以通过乙酸酐/吡啶法来测量。

本发明的数均分子量为15,000至700,000的聚乙二醇的市售产品的实例包括peg20,000(平均分子量：18,000至25,000，kishidachemicalco.，ltd.)和peg70,000(fujifilmwakopurechemicalcorporation)、peg500,000(平均分子量：300,000至500,000，fujifilmwakopurechemicalcorporation)等。市售聚乙二醇产品的其他实例包括adekapeg(adeka)和peg(sanyochemicalindustries，ltd.)。在下文中，peg20,000、peg70,000和peg500,000有时分别称为peg20k、peg70k和peg500k。

在本发明中，当测试条具有样品垫时，peg需要至少包含在样品垫的样品施加区域中。peg可包含在整个样品垫中。

当不具有样品垫，样品施加区域被包含在同一不溶性膜上时，本发明的peg需要至少包含在不溶性膜的样品施加区域中。peg不仅可以包含在样品施加区域中，而且可以包含在样品施加区域的下游侧。

在样品垫中包含peg的方法的实例包括将包含peg的溶液施加到样品垫等的方法，以及用这些溶液浸渍样品垫并干燥样品垫以在样品垫表面或内部包含peg的方法。

本发明的特定peg在样品施加区域的单位面积上优选保持为0.00630至0.473mg/cm²。

这是因为在小于0.00630mg/cm²的情况下，使样本渗透到测试条的能力差，而在大于0.473mg/cm²的情况下，与检测试剂发生不必要的相互作用，导致缀合物的过度聚集或检测区域中的空白反应。peg的保持量更优选为0.0630～0.473mg/cm²，进一步优选为0.0630～0.315mg/cm²，最优选为0.0945～0.189mg/cm²。

在本发明的施加具有特定分子量的peg的方法中，如下所述：制备含有预定浓度的peg的溶液，使用具有能够使喷嘴在水平方向移动的同时以恒定速率从中放出该溶液的机构的装置等，将该溶液以线状等施加到样品垫或不溶性膜载体等上并干燥，从而以可溶解状态包含peg。或者，可以用移液管等收集一定量的具有预定浓度的peg溶液，并将其施加到样品垫的一部分或整个表面上。当将peg施加到整个表面上时，可以将样品垫浸入包含具有预定浓度的peg溶液的容器中，从而将peg施加到整个表面上。

可以调整peg溶液的浓度，以实现上述优选的保持量，并且当假定标准样品施加区域的面积为0.96cm²且施加量为60.5μl时，由以下方程式计算得出c为0.01％至0.75％。c更优选为0.1～0.75％，进一步优选为0.1～0.5％，最优选为0.15～0.3％。

a(mg/cm²)＝bμl×(c％/100)/dcm²

a：在样品施加区域的单位面积上保持的peg量

b：允许渗透到样品施加区域中的含peg溶液的量

c：含peg溶液中peg的％浓度(w/v)

d：样品施加区域的面积

(样品垫)

在本发明中，“样品垫”是用作接收样品的样品施加区域的部位，并且可以使用任何物质和形式，只要它们处于模制成垫的状态时可以吸收液体样品并允许液体和分析物成分通过即可。

如上所述，本发明的样品垫用分子量为15,000至700,000的聚乙二醇(peg)预处理。

用peg对样品垫进行的预处理可以至少应用于样品垫中的样品被施加的样品施加区域，可以在展开方向上比样品施加区域更大范围地施加，并且优选施加到整个样品垫。换句话说，样品施加区域是样品滴加区域，并且当免疫层析测试条被存储在外壳中以形成装置时，对应于与外壳的样本滴加孔接触的部分。

本发明的样品垫可以包含红细胞凝集剂。在这种情况下，该试剂可以包含在样品垫的至少一部分中，或者可以包含在整个样品垫中。

适用于样品垫的材料的具体实例包括但不限于玻璃纤维、丙烯酸纤维、亲水性聚乙烯材料、干纸、纸浆、织物等。优选地，使用玻璃纤维垫。样品垫还可以具有后述的缀合物垫的功能。在不脱离本发明的目的并且不影响反应系统的情况下，根据需要，样品垫还可以包含通常使用的封闭剂。

(缀合物)

在本发明的缀合物中，与分析物结合的特异性结合物质或对照物质被固定在标记上。

对在本发明中使用的标记而言，可以是能够通过诸如抗体的特异性结合物质的敏化(固定化)而构成缀合物的任何标记，并且能够在使标记与样品接触以检测样品中的分析物(例如抗原)的方法中用作标记，其实例包括胶体金颗粒、胶体铂颗粒、有色胶乳颗粒和磁性颗粒，其中胶体金和有色胶乳是理想的，并且胶体金是更理想的。它们的粒径可以根据每种类型调节，以便获得所需的分析物检测灵敏度，例如，胶体金颗粒的粒径优选为20至100nm，更优选为30至100nm，特别是优选60nm。

在本发明的缀合物中，可以在胶态金等的表面上不与特异性结合物质结合的区域用封闭剂封闭。

关于缀合物的存在形式，缀合物可以呈现为缀合物垫的存在形式，即，以包含在除了样品垫、第三垫和多孔膜之外的专用垫(缀合物垫)中的状态存在(a型)，或者也可以呈现为样品垫的一部分中的缀合物部分(b型)。或者，缀合物可以呈现为与测试条分开的分离检测试剂，以便与样本混合(c型)。

下文将描述以a型存在形式具有缀合物的测试条的典型实例。

样品垫、缀合物垫、第三垫和多孔膜在样品的流动方向上，从上游到下游按此顺序进行布置，并且布置成使得上层和下层至少部分地彼此重叠。这种布置实例的测试条如图5所示。

当将包含分析物的样品施加到这种测试条的样品垫上时，分析物通过样品垫流到下游侧的结合垫。在缀合物垫中，分析物和缀合物彼此接触并穿过垫，同时形成复合物。随后，复合物穿过与缀合物垫的下表面接触设置的第三垫，并向多孔膜中展开。

由于多孔膜具有固定在其一部分上的与分析物结合的特异性结合物质，因此复合物被结合并固定在该膜上。固定的复合物可以通过检测源自标记物质的吸光度、反射光、荧光、磁性等的手段来检测。

然后将描述以b型存在形式具有缀合物的测试条。

与a型测试条的区别在于，样品垫和缀合物垫是一体的，即，样品施加区域和缀合物部分形成在样品垫的一部分中。

样品施加区域是施加包含分析物的样品的位点，且缀合物部分是包含缀合物的位点，且样品施加区域位于缀合物部分的上游。

然后将描述以c型存在形式具有缀合物的测试条。

与a型测试条的区别在于，在测试条中不存在缀合物垫，并且缀合物作为单独的检测试剂(缀合物试剂)存在。例如，可以包括具有结合在过滤器中的缀合物的过滤器芯片。通过用这种过滤器芯片来利用过滤器过滤样本，保持在过滤器中的缀合物与分析物进行结合而形成复合物(聚集体)。该复合物可以被施加到除了没有缀合物垫以外与a型测试条相同的测试条上，以检测分析物。

(检测试剂)

在本发明中，“检测试剂”具体是至少包含缀合物的溶液。

检测试剂可以包含例如一种或多种类型的稳定剂、增溶剂等，以将缀合物维持在稳定状态，以便促进当与样品混合时固定在缀合物上的抗体与分析物的特异性反应，或快速有效地溶解和流化缀合物。稳定剂、增溶剂等的实例可包括牛血清白蛋白(bsa)、蔗糖、酪蛋白和氨基酸。

为了提高检测灵敏度，检测试剂也可以根据需要包含已知的敏化剂和螯合剂，例如edta和egta。

在本说明书中，术语“检测”或“测量”须以最广义的方式来解释，包括分析物的存在性证明和/或定量，并且不应在任何意义上以受限的方式来解释。

(样品稀释剂)

根据样本中分析物的浓度，如果需要稀释样本，则可以在本发明中使用稀释剂。可以使用具有任何组成的稀释剂，只要该稀释剂不显著抑制在分析物与特异性结合物质之间的反应，或者相反，不显著促进导致标记物的过度聚集的反应并导致由毛细作用引起的展开缺陷，并且不使取决于分析物浓度的、与特异性结合物质的反应的信号检测变得不可能。

(缀合物垫)

在本发明中，“缀合物垫”是指通过如下获得的垫：用与分析物特异性反应的检测试剂浸渍适用于后述的缀合物垫的材料，并干燥材料。缀合物垫具有当样品通过缀合物垫时允许检测试剂和分析物形成复合物的功能。可以将缀合物垫本身与固定有特异性结合物质的膜接触放置。或者，可以将缀合物垫与样品垫接触放置，以接收以毛细管流形式通过样品垫的样本，然后将样本以毛细管流形式转移至第三垫上，该第三垫与不同于与样品垫的接触面的表面进行接触。关于样品垫和缀合物垫的一个或更多个位点如何选择，以及选择的位点如何布置在固定有特异性结合物质的膜上，可以适当地改变。

适用于缀合物垫的材料的实例包括但不限于纸、纤维素混合物、硝酸纤维素、聚酯、丙烯腈共聚物、玻璃纤维和非织造纤维(例如人造丝)。优选地，使用玻璃纤维垫。

根据需要，缀合物垫可包含用于确保免疫层析检测方法检测结果的可靠性的“对照试剂”，例如，用标记物标记且不与样本成分反应的特异性结合物质，和用标记物标记的诸如klh(匙孔戚血蓝蛋白)之类的高抗原蛋白。这些对照试剂是被认为不可能在样品中存在的组分(物质)，并可以适当地选择。

(第三垫)

在本发明中，为了从样品和检测试剂中的反应性成分中去除分析物检测所不需要的成分，第三垫可以放置在样品垫与不溶性膜之间，从而反应所必需的成分可以在固定有特异性结合物质的不溶性膜上顺利地展开。例如，作为检测所不需要的成分，期望去除血细胞和不溶性血细胞碎片等。第三垫还可以具有另外的作用，即将通过分析物与特异性结合物质之间的反应而产生的聚集体中，生长到阻止向固定有特异性结合物质的膜移动并通过该膜顺利地展开的尺寸的聚集体预先除去。第三垫可以由允许液体和待测成分以及检测试剂通过的任何材料、任何形式制成。具体实例包括但不限于玻璃纤维、丙烯酸纤维、亲水性聚乙烯材料、干纸、纸浆、织物等。当用于分离血细胞时，第三垫可被称为血细胞分离膜。在本发明中，当将全血用作样本时，优选使用血细胞分离膜来切实地分离和去除仅靠样品垫不能完全去除的血细胞。

(红细胞凝集剂)

在本发明中，当将全血用作样本时，除了使用第三垫以外，还期望一起使用红细胞凝集剂或红细胞结合成分。对要一起使用的红细胞凝集剂或红细胞结合成分没有特别限制，其已知实例包括凝集素、多克隆抗体和单克隆抗体，并且也可以使用聚阳离子红细胞凝集剂。已知的聚阳离子红细胞凝集剂的实例包括聚凝胺、聚赖氨酸、聚丙烯酸胺和聚丙氨酸，其中聚凝胺是优选的。聚凝胺的化学名称为海美溴铵(hexadimethrinebromide)，是一种阳离子聚合物，分配的cas号为28728-55-4。

红细胞凝集剂或红细胞结合成分可以以将试剂或成分添加到用于稀释样本的稀释剂中，或直接添加到样本中的形式使用，或者可以包含在免疫层析测试条的样品施加区域(样品垫)中。在这种使用形式中，全血中的红细胞被凝集。

通过使用本发明的具有特定分子量的peg，样品迅速从样品施加区域渗透并在不溶性膜中展开。当样本是全血时，趋于发生血细胞成分洗脱到膜中及在膜上堵塞，并且本发明的peg的使用可以促进这些现象。然而，第三垫、红细胞凝集剂等的使用有效地防止了血细胞成分的洗脱和堵塞。因此，在本发明中，在将全血用作样本的情况下，通过除了使用具有特定分子量的peg以外，还使用第三垫、血凝素剂等，可以提供有效的免疫层析测试条，其中可以快速实现全血样本的渗透，而不会引起血细胞成分的洗脱和堵塞。

(特异性结合物质在不溶性膜上的固定)

在本发明的免疫层析测试条中，可以通过众所周知的方法将分析物的特异性结合物质固定的不溶性膜上。例如，在流通型的情况下，将特异性结合物质调整至预定浓度，并且将其溶液以恒定量，特定的符号形状(例如点或+)施加到不溶性膜上。在这种情况下，为了确保免疫层析检测方法的可靠性，通常将能够与缀合物结合的蛋白质或化合物固定在与分析物的特异性结合物质不同的位置上，从而形成“对照检测区域”。也可以将与上述对照试剂结合的特异性结合物质固定在与分析物结合的特异性结合物质不同的位置，以形成“对照检测区域”。

在侧流型的情况下，将特异性结合物质调整至预定浓度，并通过使用具有能够使喷嘴在水平方向移动的同时以恒定速率从中放出该溶液的机构的装置等将其溶液以线状施加在不溶性膜上。在这种情况下，特异性结合物质的浓度优选为0.1至5mg/ml，更优选为0.5至3mg/ml。

在流通型的情况下，固定在不溶性膜上的特异性结合物质的量可以通过调节滴加到不溶性膜上的施用量来优化，在侧流型的情况下，可以通过调节以上描述的装置的喷嘴的排出速率来优化。特别地，在侧流型的情况下，优选0.5至2μl/cm。在本发明中，术语“流通膜测定”是指使标本溶液等展开以垂直通过不溶性膜的方法，术语“侧流膜测定”是指使标本溶液等展开以沿平行于不溶性膜的方向移动。

在本发明中，关于与分析物结合的特异性结合物质在不溶性膜上的施加位置，在侧流型的情况下，该位置可以布置成使得检测试剂由于毛细作用从缀合物垫上展开，并依次通过施加有各种特异性结合物质的线。优选地，通过施加与分析物结合的特异性结合物质形成的线位于上游，并且通过施加对照特异性结合物质形成的线优选位于其下游。在这种情况下，期望线以足够的距离间隔开，使得标记的信号可以被检测到。即使在流通型的情况下，也可以将与分析物结合的特异性结合物质的施加位置布置为使得标记的信号可以被检测到。

施加至不溶性膜的特异性结合物质溶液通常可以通过使用预定的缓冲溶液来制备。缓冲溶液的类型的实例包括常用的缓冲溶液，例如磷酸盐缓冲溶液，tris缓冲溶液和good's缓冲溶液。缓冲溶液的ph优选在6.0至9.5的范围内，并且可以根据要使用的特异性结合物质的性质适当地设定。例如，可以将ph为8.0的缓冲溶液用于后述的抗ctni特异性结合物质。缓冲溶液可以进一步包含盐(例如nacl)，稳定剂和防腐剂(例如蔗糖)，防腐剂(例如proclin)等。盐包括用于调节离子强度而含有的盐(例如nacl)，以及在调节缓冲溶液的ph值的步骤中添加的那些(例如氢氧化钠)。在将特异性结合物质固定在不溶性膜上之后，进一步，可以通过将通常使用的封闭剂以溶液或蒸气形式涂覆到除了特异性结合物质固定位点以外的区域来进行封闭。在本说明书中，将如上所述固定有特异性结合物质的不溶性膜称为“固定有特异性结合物质的膜”。

(不溶性膜)

在本发明中，不溶性膜(以下也简称为膜)可以由任何材料制成。其实例包括但不限于聚乙烯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、尼龙、玻璃、诸如纤维素和纤维素衍生物的多糖，或陶瓷。具体实例可包括购自merckmillipore,toyoroshikaisha,gehealthcare，等的玻璃纤维滤纸和硝酸纤维素膜。通过适当地选择不溶性膜的孔径大小和结构，可以控制胶体金标记的特异性结合物质和分析物的免疫复合物流通膜的速率。由于可以通过控制膜中的流速来调节与固定在膜上的特异性结合物结合的标记的特异性结合物的量，优选地，考虑与本发明的免疫层析测试条的其他成分材料的组合而将膜的孔径大小和结构进行最优化。

(吸收垫)

在本发明中，吸收垫是具有液体吸收能力的位点，用于通过吸收已经移动并通过多孔膜的样本来控制样本的展开。在侧流型中，吸收垫可以放置在测试条的最下游侧，而在流通型中，吸收垫可以放置在例如固定有特异性结合物质的膜的较下部分。对于吸收垫，例如可以使用滤纸；然而，本发明不限于此。

(检测装置)

可以将本发明的免疫层析测试条存储/安装并使用在考虑了测试条的尺寸，添加样本的方法和位置，固定有特异性结合物质的膜上特异性结合物质的固定位置，信号检测方法等的合适的容器(外壳)中，以这种方式存储/安装的状态称为“装置”。

在本发明的检测装置中，除了样品施加区域之外，还可以在样品施加区域的上游侧设置用于另外供给展开液的展开液供给区域。通过布置展开液供给区域并施加展开液，可以促进从样品施加区域施加的样本的展开。

然而，由于本发明的测试条的样品施加区域用特定peg进行了预处理，通过从样品施加区域施加样本就可以将分析物快速转移至展开区域和检测区域，因此，即使在除了样品施加区域之外不设置展开液供给区域以促进样本的展开，也可以在预定时间内使反应进行至一定程度，而不具有免疫层析测试条的个体差异，并可以抑制检测值变异。

特别地，当将全血用作样本时，可以有效地抑制展开的变化。从样本和展开液以两次分别进行施加的复杂性，以及结构简单的观点出发，更期望将不具有展开液供给区域的装置作为本发明的检测装置。

(其他)

在本说明书中，“不溶性膜”可以表示为“固相”，并且可以将用不溶性膜物理或化学地支持抗原或特异性结合物质，或所述支持状态表示为“固定”、“固定化”、“固相化”、“敏化”或“吸附”。

(样本)

在本发明的检测方法中，包含分析物的“样本”是指诸如血液、尿液、痰、唾液、鼻腔分泌物、鼻腔拭子、咽喉拭子、其他体液和粪便的生物样品。生物样品可以直接用作样本，用稀释剂进行了适当稀释或提取和/或过滤的样品也包括在本发明的样本中。血液样本的实例包括全血、红细胞、血浆、血清等。

血液样本还包括通过在血液收集时向其中添加了抗凝剂(例如edta或肝素)的血液收集管收集的样本。

本发明解决了在免疫层析法中，全血样本的测量值与的血浆样本相比降低的问题，并且提供了无论样本的类型而能够进行准确测量的效果。

(分析物)

本发明的分析物是存在于生物样本中的物质，例如血液(全血)、红细胞、血清、血浆、尿液、唾液或痰，并且其实例包括：炎症相关标志物，例如crp(c反应性蛋白)、iga、igg和igm；凝血或纤维蛋白溶解标志物，例如纤维蛋白降解产物(例如d-二聚体)、可溶性纤维蛋白、tat(凝血酶-抗凝血酶复合物)和pic(纤溶酶-纤溶酶抑制剂复合物)；循环相关标志物，例如氧化的ldl、bnp(脑利钠肽)、h-fabp(心型脂肪酸结合蛋白)和心肌肌钙蛋白i(ctni)；代谢相关标志物，如脂联蛋白；肿瘤标志物，例如cea(癌胚抗原)、afp(α甲胎蛋白)、ca19-9、ca125和psa(前列腺特异性抗原)；与传染病相关的标志物，例如hbv(乙型肝炎病毒)、hcv(丙型肝炎病毒)、沙眼衣原体和淋球菌；变应原特异性ige(免疫球蛋白e)、激素和药物。其中，d-二聚体、crp、bnp、h-fabp、ctni等与强烈希望将全血用作样本相关的那些是更优选的。

(特异性结合物质)

在本发明中，由不溶性载体颗粒如胶体金支持的分析物的特异性结合物的实例包括蛋白质、肽、氨基酸、脂质、糖、dna、rna、受体和半抗原，尽管不受分子量的大小或来源(例如，天然或合成)的特别限制，其实例包括可用在利用免疫应答的免疫学测量方法中的抗体或抗原。

(本发明中使用的抗体)

本发明中使用的针对分析物的抗体不受制备方法的限制，只要该抗体与分析物特异性反应即可，可以是多克隆抗体或单克隆抗体。更优选地，抗体是单克隆抗体。通常，产生所述抗体的杂交瘤可以根据kohler和milstein的方法(参见nature,vol.256,p.495(1975))，通过使用分析物作为免疫原进行了免疫的动物的脾细胞与相同物种的骨髓瘤细胞之间的细胞融合来制备。

本发明的抗体可以是完整的抗体分子，也可以是具有抗原-抗体反应活性的抗体的功能性片段。抗体可以是通过普通动物(小鼠、山羊、绵羊等)的免疫步骤获得的抗体，以及通过基因重组技术等获得的、具有改变为不同于用免疫原(分析物)进行免疫的动物的动物物种的氨基酸序列的抗体(例如嵌合抗体、人源化抗体或完全人源化抗体)。抗体的功能片段的实例包括为具有抗原-抗体反应活性的片段的f(ab')2或fab'，以及单链抗体(scfv)。这些功能片段可通过用蛋白水解酶(例如胃蛋白酶或木瓜蛋白酶)处理如上所述获得的抗体来产生。

当在通过所谓的夹心形成来检测分析物的测量方法中使用的抗体为单克隆抗体时，标记物上固定的抗体(第一抗体)与不溶性膜上固定的抗体(第二抗体)之间的关系中，当第一抗体的表位为单价时，所使用的第二抗体的表位与第一抗体的表位不同，当第一抗体的表位为多价时，所使用的第二抗体的表位可以与第一抗体的表位相同或不同。

(试剂盒)

利用本发明的免疫层析检测方法的检测试剂盒可以是包括免疫层析测试条的试剂盒，所述免疫层析测试条至少包括多孔膜，并具有样品施加区域、展开区域和在其上固定有特异性结合物质的检测区域，免疫层析测试条的特征在于用具有特定分子量的peg处理。

检测试剂盒可以包括检测所需的其他试剂(例如，含有缀合物的检测试剂)、样本稀释剂、试管、过滤器、用于样本收集的棉签、说明书，用于存储测试条的外壳等。

在下文中，将描述本发明的具体实施例；然而，这些仅出于说明的目的，本发明不限于此。

实施例

[实施例1]本发明的样品垫在血浆样本中的cv降低效果

1.本发明的检测装置的制作

1)胶体金标记的抗ctni单克隆抗体(抗ctni抗体缀合物)的制备

(i)胶体金溶液的制备

向加热至93℃的500ml纯化水中，添加1ml的7％(w/v)柠檬酸三铵水溶液，并通过搅拌混合。随后，添加1ml的5％(w/v)四氯金(iii)酸水溶液，并在搅拌下反应10分钟，然后将反应溶液煮沸。随后，将该溶液在冰水中冷却以制备平均粒径为60nm的胶体金溶液。

用纯化水将该平均粒径为60nm的胶体金溶液调整为在胶体金的最大吸收波长下具有1od/ml的吸光度。

(ii)抗ctni抗体缀合物的制备

向1od/ml胶体金溶液(ph8.0)中，加入用2mmtris-盐酸缓冲溶液(ph7.0)稀释至20μg/ml的抗ctni单克隆抗体，并在室温下搅拌10分钟。向胶态金和抗体的混合液中，添加含有0.5％(w/v)的neoproteinsaver(toyobo，no.nps-301)的纯化水，并在室温下搅拌5分钟。随后，将混合物在10℃下以11900×g离心45分钟。除去上清液后，将1ml的0.2％(w/v)的neoproteinsaver水溶液添加至获得的沉淀物中以将缀合物悬浮，从而获得抗ctni抗体缀合物。

(iii)用于对照线的胶体金标记的klh(klh缀合物)的制备

向20ml的1od/ml胶体金溶液中，加入溶解于2mmol/l磷酸盐缓冲液至620μg/ml的klh(由sigma制备)10ml，在室温下搅拌10分钟。向胶体金和klh的混合液中，添加1ml的10％牛血清白蛋白(bsa)水溶液，并在室温下搅拌5分钟。随后，将混合物在10℃下离心45分钟，在去除上清液之后，将1ml的缀合物稀释剂添加至获得的沉淀物中，以将缀合物悬浮，从而获得klh缀合物。

2)缀合物垫的制作

通过混合3od的抗ctni抗体缀合物，0.75od的klh缀合物，0.5％的lipidurebl-1301、0.25mg/mlheteroblock，2.4％乳糖，2.0％nps和20mmmops(ph7.2)制备缀合物溶液，并将具有一定体积的玻璃纤维垫(merckmillipore)用相对于垫体积1.2倍的溶液浸渍。通过在70℃的烘箱中加热45分钟来干燥垫，以获得缀合物垫。

3)抗ctni单克隆抗体固定化膜的制备(抗体固定化膜)

对于测试线，通过向含有0.09％nan3的10mmpb(ph8.0)中添加蔗糖和抗ctni单克隆抗体，使得最终浓度达到2.5％和3mg/ml来制备溶液。

对于对照线，如上所述稀释并制备了兔抗klh多克隆抗体(由bethyl制备)。

在硝化纤维素膜(hi-flowplushf180，merckmillipore)短边的一端内侧的位置，将抗ctni单克隆抗体使用免疫层析分配器“xyz3050”(biodot)，以设定为1μl/cm的方式，以垂直于测试条纵向(展开方向)的方向以线形进行了施加，从而形成了测试线。以从测试线的位置起约4mm的间隔类似地施加了抗klh多克隆抗体，从而形成了对照线。将该膜在烘箱中在70℃下干燥45分钟而获得抗体固定化膜。

4)样品垫的制作：将玻璃纤维垫(lydall)切成16mm×6mm的尺寸，以60.5μl的体积浸渍下述样品垫预处理溶液，并在70℃的烘箱中干燥45分钟，并用作样品垫。

(i)本发明的样品垫预处理溶液

通过调整为含有0.5％葡萄糖、2％聚凝胺和0.25％peg20k的20mmmops(ph7.2)而获得了本发明的样品垫预处理溶液(样品垫单位面积上的保持量为0.158mg/cm²)。

在实施例(包括以下测试实施例)中使用的peg2k、peg6k和peg20k由kishidachemicalco.，ltd.制备，peg70k和peg500k由fujifilmwakopurechemicalcorporation制备。

(ii)对比例的样品垫预处理溶液

通过制备含有0.5％葡萄糖和2％聚凝胺的20mmmops(ph7.2)而获得了对比例的样品垫预处理溶液。

5)免疫层析测试条的制作

将抗体固定化多孔膜固定在塑料粘合片(a)上，布置施加部分使得在展开上游侧的抗ctni抗体(c)后面是抗klh抗体(d)，进一步在该膜上安装了血细胞分离膜(第三垫)(e)。

随后，布置并安装了在2)中制造的缀合物垫(f)；将4)中制造的样品垫(g)布置并安装成与缀合物垫重叠；将吸收垫(h)布置并安装在相反侧的一端。通过切割具有以这种方式彼此相互重叠的组成元素的结构，制作了免疫层析测试条。在检测时，测试条可以以检测装置的形式存储于/安装至特殊的塑料外壳(具有样品添加窗部分和检测窗部分，图5中未示出)。图5示出了免疫层析测试条的示意性构造图。

2.通过免疫层析法测量

向如上所述制作的检测装置的样品添加窗部分中，添加了含有700pg/ml的心肌肌钙蛋白i(ctni)的120μl的血浆样本溶液，15分钟后，使用免疫层析读取仪rapidpia(注册商标，sekisuimedicalco.,ltd.)测量测试线的显色量(吸光度)，以计算其各自的cv值(变异)。cv表示变异系数，可以通过将标准偏差除以平均值来获得。结果示于图1。

3.结果

当利用包括用0.25％peg20k预处理过的样品垫的免疫层析测试条测量血浆样本的肌钙蛋白时，与用不含peg的溶液预处理过的样品垫的情况相比，cv值得到了抑制，并且测量再现性得到了改善。

[实施例2]peg分子量(低分子量侧)与cv降低效果之间的关系

尽管在实施例1中将peg20k用于样品垫的预处理，还测试了peg6k(分子量6,000)和2k(分子量2,000)，以检查低分子量侧的peg与cv降低效果之间的关系。在每个测试中，peg预处理的浓度分别为0.5％和1.0％。除此之外，按照实施例1进行测试。结果示于图2。

根据该结果，与用不含peg的溶液进行预处理的情况相比，仅peg20k具有cv值降低效果，即使将浓度增加至1％，也未观察到peg6k和peg2k的cv降低效果。

[实施例3]peg分子量(高分子量侧)与cv降低效果之间的关系

在peg的高分子量侧证实了该效果。具体地，尽管在实施例1中将peg20k用于样品垫的预处理，还测试了peg70k和500k以检查高分子量侧的peg与cv降低效果之间的关系。样本是含有300pg/ml心肌肌钙蛋白i(ctni)的血浆样本溶液，peg预处理的浓度为0.25％。除此之外，按照实施例1进行了测试。结果示于表1。

根据该结果，发现在高分子量侧的两者的情况下，cv降低效果均等于或高于已经被证实具有效果的peg20k。

[表1]

[实施例4]peg样品垫保持量与cv降低效果之间的关系

对于样品垫中peg20k的保持量方面证实了该效果。具体地，尽管在实施例1中将0.25％的peg20k溶液用于样品垫的预处理，还测试了0.5％(样品垫单位面积上的保持量为0.315mg/cm²)和0.75％(该量为0.473mg/cm²)以检查在peg的保持量和cv降低效果之间的关系。样本是含有60pg/ml心肌肌钙蛋白i(ctni)的血浆样本溶液，除此之外，按照实施例1进行了测试。结果示于表2。

另外，通过使用不含peg的和peg20k0.25％预处理的样品垫，目视比较并观察了将样本溶液滴到样品垫上之后，即刻、2秒和5秒后渗透到垫中的程度。观察结果以照片示于图6。

根据该结果发现，在所有保持量范围内都提供了cv降低效果。也证实了样本溶液迅速渗透到测试条中。

[表2]

[实施例5]本发明的样品垫对全血样本的cv降低效果

进行测试以检查当将样本从血浆样本变为全血时是否获得相同的效果。对于样本，使用了包含300pg/mlctni的三种全血样本(血细胞比容值：20％、39％、54％)。除了使用浓度为0.15％的peg20k以外，按照实施例1进行了样品垫的预处理。

作为参考，对血细胞比容值为0％(血浆)的样本进行了相同的测试。结果示于图3。

根据该结果，对于具有任何血细胞比容值的全血样本，证实了本发明的效果。具体地，在血细胞比容值为20％、39％和54％的所有全血样本中，通过用0.15％peg20k预处理样品垫，cv值均得到改善。特别地，即使在血细胞比容值为54％的高粘度样本的情况下，也实现了快速渗透到膜中。

[实施例6]全血样本中的peg分子量(高分子量侧)与cv降低效果之间的关系

在peg的高分子量侧也证实了该效果。具体地，将实施例3的样本替换为含有300pg/ml的心脏肌钙蛋白i(ctni)且血细胞比容值为55％的全血样本溶液，并且进行了相同的测试。结果示于表3。

根据该结果，发现在高分子量侧的两者的情况下，cv降低效果都比已经被证实具有效果的peg20k高得多。

因此，发现通过用本发明的具有特定分子量的peg对样品垫进行预处理，可以改善免疫层析检测方法中的测量值变异。

[表3]

[实施例6]在全血测定值对血浆测定值的灵敏度比与血细胞比容值之间的关系

对于在实施例5中获得的全血测量值，计算了相对于血浆(血细胞比容值为0％)测量值的比值，以检查血细胞比容值与测量灵敏度之间的关系。计算结果示于图4。

根据该图发现，当不进行本发明的样品垫的预处理时，与在血浆样本中得到的灵敏度相比，在全血样本中得到的灵敏度随着血细胞比容值增大而相对降低，而通过执行本发明的预处理可以抑制灵敏度的降低。因此，发现即使在测量的是全血时，也可以抑制测量值的变异并可以灵敏地进行测量。

工业实用性

根据本发明，通过在免疫层析测试条的样品施加区域中包含特定聚乙二醇，可以使样本快速渗透到样品施加区域中的测试条，并可以提供引起较小测量值变异的免疫层析测试条。特别地，可以提供无论样本的类型而引起较小测量值变异的免疫层析测试条。

参考标记列表

(a)塑料粘合片

(b)抗体固定化膜

(c)抗ctni抗体(测试线)

(d)抗klh抗体(对照线)

(e)血细胞分离膜(第3垫)

(f)缀合物垫

(g)样品垫

(h)吸收垫