一种用于猪肉中兽药残留检测的蛋白芯片及其制备方法与流程

本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种用于检测兽药残留的蛋白芯片及其制备方法。

背景技术：

兽药残留是指用药后蓄积或存留于畜禽体内或产品中原型药物或其代谢产物。兽药的正确、合理的使用给养殖业带来了高效益，但总有部分人一味追求经济利益，在畜禽产业各个环节中非法使用、滥用、违规添加、注入兽药或有害物质。兽药的残留及有害物质严重影响动物性食品安全、畜牧业的可持续发展，更严重的是直接危害人体健康和生命安全，对人类健康危害极大。因此，必须对动物性食品进行兽药残留含量和违禁药物及有害物质的检测，防止问题畜产品流入市场各环节，保证人们的“餐桌安全”。

六个兽药残留检测的指标分别为：clen、rac、sal、cap、cpz、amc。

clen(盐酸克伦特罗)又称为“瘦肉精”是一种肾上腺类神经兴奋剂，能改变动物体内的代谢途径，促进肌肉，特别是骨骼肌中蛋白质的合成，抑制脂肪的合成，从而加快生长速度。人长期食用了含有盐酸克伦特罗残留的肉食，可引起血压升高、血管扩张、心跳加快、呼吸加剧、神经过敏、恶心、呕吐等症状，更严重的是它可诱发和加重心率失常病人的病情。

rac(莱克多巴胺)是一种β促效剂，是瘦肉精的一种，作为动物饲料添加物，用以助长猪、牛、火鸡生出肌肉，减少体脂肪。含有莱克多巴胺的猪肉一旦通过食物链进入人体，会对健康产生极大的危害，可能引发中毒的征兆，恶心、头晕、肌肉颤抖、心悸、血压上升、促进心血管疾病，影响生殖系统等。

sal(沙丁胺醇)是一种短效β2肾上腺素能受体激动剂，用作平喘药。添加沙丁胺醇与牲畜饲料内，可以增加牲畜的瘦肉量及换肉率、减少脂肪。长期食用含沙丁胺醇的食品易出现震颤、恶心、呕吐、持续心率增快或心博异常强烈、情绪烦躁不安等症状。

cap(氯霉素)可用于细菌核糖核蛋白体的50s亚基，阻扰蛋白质的合成，对革兰氏阳性、阴性菌均有抑制作用，特别对伤寒杆菌、流感杆菌、副流感杆菌和百日咳杆菌的作用强于其他抗生素。氯霉素会抑制骨髓造血机能，造成有粒细胞及血小板减少、再生障碍性贫血，久用还可致视神经炎、共济失调及二重感染。

cpz(氯丙嗪)又名冬眠灵，是一种安眠、镇静、催眠药物，在兽医临床上主要被用作镇静药。氯丙嗪添加到饲料中，除了达到镇静、催眠的效果外，还能间接起到催肥促身长作用。长期食用含有氯丙嗪的食物会引起白细胞减少、口干、乏力、、嗜睡、便秘、心悸、血压下降、甚至休克等。

amc(阿莫西林)是β-内酰胺类抗生素中一种，其杀菌作用强，穿透细胞壁的能力也强，对多数致病的g+菌和g-菌(包括球菌和杆菌)均有强大的抑菌和杀菌作用，被广泛的用于治疗各种动物的尿道、呼吸道及皮肤的感染。在人体内长期的积累可出现过敏症状、消化系统症状、血液系统症状、皮肤粘膜反应、肝肾功能紊乱、中枢神经系统症状。

目前这六个指标已经被企业、检测机构、政府执法部门等广泛应用检测。但是目前采取的主流方法是免疫单指标的测定方法(例如elisa和胶体金等)。虽然能够测定这六个指标，但是存在检测速度慢，检测成本高等缺点。而且六个指标分别检测存在着操作不便，出错概率大等现实问题。而作为微量成分检测最权威的hplc(液相色谱)法虽然结果准确可靠，但成本极高，设备昂贵，无法大规模采用。猪肉中是否含有抗生素、能否安全食用是大众急切想知道的问题，为了加快检测的速度，不少企业、检测机构、政府执法部门不得不花费更多的人力、物力、时间，分别用于检测clen、rac、sal、cap、cpz、amc造成了较大的浪费。

技术实现要素：

针对现有技术存在的上述问题，本发明申请人提供了一种用于兽药残留检测的蛋白芯片及其制备方法。本发明蛋白芯片用于检测猪肉中六个兽药残留指标，应用本公司独创的蛋白芯片技术实现联合检测可以有效地提高检测效率，降低检测成本；本发明人开发了同时包含有clen、rac、sal、cap、cpz、amc六个指标的蛋白芯片诊断试剂盒，具有快速，高效，低成本等优点。

本发明的技术方案如下：

一种用于兽药残留检测的蛋白芯片，所述蛋白芯片的制备方法包括如下步骤：

(1)黑玻片预处理；

(2)抗原溶液点样；

(3)封闭工艺，制得所述蛋白芯片。

步骤(1)中所述黑玻片预处理的方法为：

①将黑玻片置于含有naoh的玻片预处理液中浸泡16～24h，之后采用纯化水清洗2～8次；

②将黑玻片置于质量浓度为0.05～1％的硅烷溶液中浸泡20～60min；

③将浸泡好的黑玻片氮气吹扫后放入烘箱中，于100～180℃条件下烘烤0.2～0.6h。

步骤(2)中所述抗体溶液包括clen抗原溶液、rac抗原溶液、sal抗原溶液、cap抗原溶液、cpz抗原溶液、amc抗原溶液。

步骤(2)中所述点样的方法为机器自动化点样。

步骤(3)中所述封闭过程为：将点样好的黑玻片没入封闭液中1～24h，之后取出黑玻片，并离心去除残余封闭液，制得所述蛋白芯片。

所述封闭液为含有封闭蛋白的缓冲溶液；所述封闭蛋白为牛血清白蛋白或卵清蛋白；所述缓冲液为pbs缓冲液、tris缓冲液、heps缓冲液、mops缓冲液中的一种或多种。

一种所述蛋白芯片的应用，将所述蛋白芯片制成试剂盒。

所述试剂盒还包括标记有hrp酶或碱磷酶的第二抗体溶液、兽药相对应的抗体溶液、对标记物敏感的化学发光底物。

本发明有益的技术效果在于：

本发明蛋白芯片用于检测六个重要的兽药指标，应用蛋白芯片技术实现联合检测可以有效地提高检测效率，降低检测成本；同时包含有clen、rac、sal、cap、cpz、amc六个指标的蛋白芯片诊断试剂盒，具有快速，高效，低成本等优点。配合本公司的自动化蛋白芯片阅读仪，可以实现自动化检测。由于有效地将六个指标集成在一张芯片中进行检测，只需要一份猪肉样本就可以实现六个指标的同时快速检测。本产品和技术作为一种新颖的检测方法，目前世界上还没有同类产品面市。

本发明采用经典的免疫学间接竞争法。在玻璃为载体的芯片基质上固定捕获抗原，这些包被抗原可以与样本中抗原竞争加入的特异性抗体溶液，被捕获的抗原抗体复合物与标记有hrp酶的第二抗体相结合，形成夹心式结合产物。加入对标记物(hrp酶或碱磷酶)敏感的化学发光底物进行化学发光，其光信号通过ccd摄像头采集，通过光信号的强弱可以判断被测样本中特定抗原的浓度。

本试剂盒使用了兽药残留芯片技术平台，而国内其他厂家的单项检测方法使用的是elisa检测方法，每次只能检测一个指标。与之相比，本产品的优势在于：①由于抗原或抗体与本产品抗体或抗原结合的特异性高、亲和力强，并且受到其他杂质影响较低，因此，对生物样品的要求非常低，可简化样品的前处理过程；而经典的hplc(液相色谱)法对样品处理要求很高。②能够快速高通量、平行化定量分析大量的蛋白质样品；③操作简单，结果正确率高；④所需试剂和样品少，价格低廉。

附图说明

图1为本发明抗原点样示意图；

图中，列1：阳性质控列；列2：空白；列3：clen测定列；列4：rac测定列；列5：sal测定列；列6：空白；列7：cap测定列；列8：cpz测定列；列9：amc测定列；列10：空白；列11：阴性对照列。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明进行具体描述。

实施例1

一种用于兽药残留检测的蛋白芯片，所述蛋白芯片的制备方法包括如下步骤：

(1)黑玻片预处理；

①将黑玻片置于含有2％naoh的玻片预处理液中浸泡16h，之后采用纯化水清洗2～8次；

②将黑玻片置于质量浓度为0.05％的硅烷溶液(介质为25％乙醇)中浸泡60min；

③将浸泡好的黑玻片氮气吹扫后放入烘箱中，于180℃条件下烘烤0.2h。

(2)抗原溶液点样；

参考图1，采用机器自动化点样clen抗原溶液、rac抗原溶液、sal抗原溶液、cap抗原溶液、cpz抗原溶液、amc抗原溶液，抗原溶液浓度为0.05mg/ml，每点点样20nl，各抗体点样分布如图1所示。

(3)封闭工艺；

将点样好的黑玻片没入封闭液(内含1％牛血清白蛋白的pbs缓冲液)中10h，之后取出黑玻片，并离心去除残余封闭液，制得所述蛋白芯片。

(4)样本处理

a.称取2.0±0.05g均质后的组织样本至50ml聚苯乙烯离心管中；

b.先加入1ml1mhcl振荡混匀，再加入6ml乙酸乙酯-乙睛溶液用振荡器振荡混匀，混匀后，4000g室温(20-25℃)离心10min；

c.取3ml上清液于另一个洁净的10ml离心管中，于60℃水浴锅中氮吹，直至吹干为止；

d.向10ml离心管中加入1ml正己烷，振荡混匀；再加入1ml复溶液，振荡混匀，混匀后，4000g室温(20-25℃)离心10min；

e.去掉离心后的上层液，取100ul下层液用于检测。

(5)试剂盒

将所述蛋白芯片、残留兽药的相应抗体溶液与标记有hrp酶的第二抗体溶液(浓度为1ug/ml，其中介质为外购的赛默飞公司的酶标二抗稀释液，ph＝6.0)、样本稀释液(0.01mpbsph-7.4)、检测液a(含1％鲁米诺和2％tris)和检测液b(含1％过氧化氢)共同包装成试剂盒。

实施例2

一种用于兽药残留检测的蛋白芯片，所述蛋白芯片的制备方法包括如下步骤：

(1)黑玻片预处理；

①将黑玻片置于含有2％naoh的玻片预处理液中浸泡24h，之后采用纯化水清洗2～8次；

②将黑玻片置于质量浓度为0.5％的硅烷溶液(介质为25％乙醇)中浸泡30min；

③将浸泡好的黑玻片氮气吹扫后放入烘箱中，于140℃条件下烘烤0.5h。

(2)抗原溶液点样；

参考图1，采用机器自动化点样clen抗原溶液、rac抗原溶液、sal抗原溶液、cap抗原溶液、cpz抗原溶液、amc抗原溶液，抗原溶液浓度为0.05mg/ml，每点点样20nl，各抗体点样分布如图1所示。

(3)封闭工艺；

将点样好的黑玻片没入封闭液(内含2％卵清蛋白的pbs缓冲液)中24h，之后取出黑玻片，并离心去除残余封闭液，制得所述蛋白芯片。

(4)样本处理

a.称取2.0±0.05g均质后的组织样本至50ml聚苯乙烯离心管中；

b.先加入1ml1mhcl振荡混匀，再加入6ml乙酸乙酯-乙睛溶液用振荡器振荡混匀，混匀后，4000g室温(20-25℃)离心10min；

c.取3ml上清液于另一个洁净的10ml离心管中，于60℃水浴锅中氮吹，直至吹干为止；

d.向10ml离心管中加入1ml正己烷，振荡混匀；再加入1ml复溶液，振荡混匀，混匀后，4000g室温(20-25℃)离心10min；

e.去掉离心后的上层液，取100ul下层液用于检测。

(5)试剂盒

将所述蛋白芯片、残留兽药的相应抗体溶液与标记有hrp酶的第二抗体溶液(浓度为1ug/ml，其中介质为外购的赛默飞公司的酶标二抗稀释液，ph＝6.0)、样本稀释液(0.01mpbsph-7.4)、检测液a(含1％鲁米诺和2％tris)和检测液b(含1％过氧化氢)共同包装成试剂盒。

实施例3

一种用于兽药残留检测的蛋白芯片，所述蛋白芯片的制备方法包括如下步骤：

(1)黑玻片预处理；

①将黑玻片置于含有2％naoh的玻片预处理液中浸泡20h，之后采用纯化水清洗2～8次；

②将黑玻片置于质量浓度为1％的硅烷溶液(介质为25％乙醇)中浸泡20min；

③将浸泡好的黑玻片氮气吹扫后放入烘箱中，于100℃条件下烘烤0.6h。

(2)抗原溶液点样；

参考图1，采用机器自动化点样clen抗原溶液、rac抗原溶液、sal抗原溶液、cap抗原溶液、cpz抗原溶液、amc抗原溶液，抗原溶液浓度为0.05mg/ml，每点点样20nl，各抗体点样分布如图1所示。

(3)封闭工艺；

将点样好的黑玻片没入封闭液(内含3％牛血清白蛋白的tris缓冲液)中8h，之后取出黑玻片，并离心去除残余封闭液，制得所述蛋白芯片。

(4)试剂盒组装

将所述蛋白芯片、残留兽药的相应抗体溶液与标记有hrp酶的第二抗体溶液(浓度为1ug/ml，其中介质为外购的赛默飞公司的酶标二抗稀释液，ph＝6.0)、样本稀释液(0.01mpbsph-7.4)、检测液a(含1％鲁米诺和2％tris)和检测液b(含1％过氧化氢)共同包装成试剂盒。

测试例：

猪肉样本处理

a.称取2.0±0.05g均质后的组织样本至50ml聚苯乙烯离心管中；

b.先加入1ml1mhcl振荡混匀，再加入6ml乙酸乙酯-乙睛溶液用振荡器振荡混匀，混匀后，4000g室温(20-25℃)离心10min；

c.取3ml上清液于另一个洁净的10ml离心管中，于60℃水浴锅中氮吹，直至吹干为止；

d.向10ml离心管中加入1ml正己烷，振荡混匀；再加入1ml复溶液，振荡混匀，混匀后，4000g室温(20-25℃)离心10min；

e.去掉离心后的上层液，取100ul下层液用于检测。

使用本公司生产的slxp-001型生物芯片阅读仪对上述兽药残留样本进行检测，slxp-001型生物芯片阅读仪的工作过程如下：

仪器自动吸取100ul待测样本至反应杯中，仪器自动吸取取100ul抗体溶液至反应杯中，混匀，然后仪器将本发明实施例制得的蛋白芯片自动地放入待测样本反应杯中，30℃孵育40分钟，随后仪器夹爪将芯片取出，经仪器自动冲洗后投入到标记有hrp酶的第二抗体溶液(200ul，仪器自动提前吸好)，再次孵育40分钟后，仪器夹爪将芯片再次取出，经仪器自动冲洗后投入到发光底物溶液中(由100ul的检测液a和100ul的检测液b混合而成，由仪器自动吸取和混合)，最后对蛋白芯片进行拍照成像，软件自动分析图片，给出分析结果。检测结果如表1、表2所示，参比值为hplc的单指标测定结果。

表1

表2

由上表可见，本发明所提供的试剂盒，同时检测clen、rac、sal、cap、cpz、amc六个指标，可以获得与hplc测定结果相近的结果，由于企业、检测机构、政府执法部门有自己判断阴阳性的标准，本发明不进行阴阳性的判断。使用本试剂盒可以实现高效率，简操作，低成本，用时短等多个优点，非常有助于及时，准确地通过检测结果发现猪肉中是否含有哪种抗生素，及时的进行相应的处理。