用于阿尔茨海默症的检测、诊断或风险预测的抗原蛋白组合以及包含其的试剂盒的制作方法

本发明属于生物检测领域，具体而言，本发明涉及一种用于检测哺乳动物样本中自身抗体的抗原组合及其应用，以实现对哺乳动物是否患有阿尔茨海默症的早期诊断。
背景技术：
：阿尔茨海默症(ad)，俗称老年性痴呆，是一组病因未明的原发性退行性脑变性疾病，多起病于老年期，病程缓慢且不可逆。阿尔茨海默症的临床表现主要为记忆和其他认知功能缺失，起病缓慢，不易被发现，以可能持续数年的预症状期为特征；同时，患者在临床症状出现之前即已发生神经退化，且在发病后具有相当长的病程。据世界卫生组织报道，当今世界65岁以上的老年人中有10％会发生阿尔茨海默症，而到80岁，该比例上升到30％以上。估计ad患者的平均生存期为10-15年，是老年人群中仅次于心脏病、恶性肿瘤和中风的第四位死亡原因。据中国阿尔茨海默病协会最新统计，我国目前ad患病人口已经接近800万，预计到2050年患病人口将超过2000万。贾建平教授及其团队发表论文《阿尔茨海默症在中国以及世界范围内疾病负担的重新评估》，文中指出，2015年中国阿尔茨海默症患者的年人均花费为19144.36美元(约合人民币13万元)，我国阿尔茨海默症所致社会经济负担总额达到1677.4亿美元(约合人民币11406亿元)。预计到2030年，我国阿尔茨海默症经济负担将达到2.54万亿美元(折合成人民币约17万亿元。随着人口的老龄化和人均寿命的延长，阿尔茨海默症正逐步成为中国乃至其他国家的重要疾病负担，造成日益严重的公共健康问题。这种疾病至今没有很好的治疗方法，但良好的延续护理措施可以延缓病情发展，防止患者的残存功能进一步受损。因此，对于患者来说，疾病得以早期诊断对于预防或延缓疾病发生或临床症状的出现至关重要。目前，阿尔茨海默症的诊断金标准是脑组织中淀粉样蛋白aβ的沉积。但是，这一诊断需要有创伤性的脑活检或病人去世后尸检才能实现，不适合用于临床检查。其它的检查方法还有头部ct和mri、淀粉样蛋白pet成像、基因检测、脑脊液淀粉样蛋白、tau蛋白检查等，这些指标通常在阿尔茨海默症已经进行多年出现临床症状后才能被检测或识别出来，因而难以实现早期诊断。血清中抗体的检测已经是一种很成熟的技术，这使得自身抗体的精确检测成为可能。例如，国内公司杭州凯保罗生物科技有限公司利用自身免疫抗体开发出采用抗原组合来检测肺癌的国内首个试剂盒，取得了非常好的临床效果。而对于阿尔茨海默症来说，已经有大量证据证实，人体免疫系统在ad发展的早期可以产生自身抗体，这为通过检测自身抗体来对阿尔茨海默症进行检测或诊断成为可能。但是，由于技术限制，阿尔茨海默症的很多自身抗体在早期很难被检测到；同时，虽然报道了多种自身抗体和ad具有相关性，但是哪些抗体具有广泛的临床意义，尚未可知。况且，即使有些自身抗体被认为与ad具有某种相关性，也只是停留于小范围的研究阶段，尚缺乏大规模、可重复的临床数据予以证明。因此，虽然当前诊断手段在不断地改进，但是本领域仍然需要阿尔茨海默症的新的检测或诊断手段；特别是，本领域仍然需要为ad的早期诊断和病程预测提供一种新的检测方法。技术实现要素：为了解决上述技术问题，本发明提供一种用于检测阿尔茨海默症的抗原蛋白组合，所述抗原蛋白组合包含至少四种蛋白，该蛋白均与阿尔茨海默症特异性相关，因此提供一种阿尔茨海默症的相对准确的早期检测或诊断工具。因此，本发明的一个目的是提供一种试剂盒，所述试剂盒包括抗原蛋白组合，所述抗原蛋白组合包含至少四种蛋白。本发明的另一个目的是提供所述抗原蛋白组合在制备用于阿尔茨海默症的检测、诊断或风险预测的试剂中的用途。本发明的还一个目的是提供一种阿尔茨海默症的检测、诊断或风险预测的方法。本发明的技术方案如下。一方面，本发明提供一种试剂盒，所述试剂盒包括抗原蛋白组合，所述抗原蛋白组合包含至少四种蛋白，所述蛋白选自rabpt5、rage、cryab、srpk1、mapt、mbp、plp1、ptcd2、frmd8、pomc、dnajc8、centa2、hsp60、adarb1、asxl1、edrk、gdf11、p21、ccl2、il18、vegf、leng1和mrpl34。所述抗原组合用于检测生物样品、例如血清中阿尔兹海默症的自身抗体存在与否。因此，本发明提供的试剂盒可以用于阿尔兹海默症的检测或诊断，尤其是早期检测或诊断；还可用于阿尔兹海默症的患病风险预测。上述蛋白的序列示例性地见表1。表1.抗原蛋白组合中包含的蛋白的序列蛋白数据库id蛋白数据库idrabpt5nm_004703.6centa2nm_018404ragenm_001136.5hsp60nm_002156.5cryabnm_001289807.1adarb1nm_001112.4srpk1nm_003137.5asxl1nm_015338.5maptnm_016835.4edrknm_001199875.1mbpnm_001025101.2gdf11nm_005811plp1nm_000533.5p21nm_000389ptcd2nm_024754.5ccl2nm_002982.4frmd8nm_031904il18nm_001562.4pomcnm_000939.4vegfnm_001025366.2dnajc8nm_014280leng1nm_024316.2mrpl34nm_023937.3在本发明提供的试剂盒中，优选地，所述蛋白选自rage、hsp60、mrpl34、ccl2、mbp、p21、centa2、asxl1、adarb1、dnajc8、mapt和gdf11；以及任选地，选自rabpt5、cryab、srpk1、plp1、ptcd2、frmd8、pomc、edrk、il18、vegf和leng1。更优选地，所述抗原蛋白组合包含至少三种或至少四种选自rage、hsp60、mrpl34、ccl2、mbp、p21、centa2、asxl1、adarb1、dnajc8、mapt和gdf11的蛋白。进一步地，按照以下对蛋白的分组，所述抗原蛋白组合包含至少两种选自第(1)组的蛋白、至少一种选自第(2)组的蛋白以及任选的至少一种选自第(3)组的蛋白：(1)rage、hsp60、mrpl34、ccl2、mbp、p21、centa2；(2)asxl1、adarb1、dnajc8、mapt和gdf11；(3)rabpt5、cryab、srpk1、plp1、ptcd2、frmd8、pomc、edrk、il18、vegf和leng1。更优选地，所述抗原蛋白组合包含至少三种选自所述第(1)组的蛋白和至少一种选自所述第(2)组的蛋白。根据本发明的具体实施方式，在本发明提供的试剂盒中，所述抗原蛋白组合包含蛋白rage和dnajc8；优选地，所述抗原蛋白组合进一步包含蛋白mrpl34；更优选地，所述抗原蛋白组合进一步包含蛋白hsp60；进一步优选地，所述抗原蛋白组合进一步包含蛋白adarb1。根据本发明的具体实施方式，在本发明提供的试剂盒中，所述抗原蛋白组合包含蛋白rage、dnajc8、hsp60和mrpl34；优选地，所述抗原蛋白组合进一步包含蛋白adarb1；或者，在本发明提供的试剂盒中，所述抗原蛋白组合包含蛋白rage、dnajc8、mrpl34和adarb1；优选地，所述抗原蛋白组合进一步包含蛋白hsp60。具体而言，所述抗原蛋白组合包含蛋白rage、dnajc8、hsp60和mrpl34，并且还包含蛋白centa2；优选地，所述抗原蛋白组合进一步包含蛋白cryab；优选地，所述抗原蛋白组合进一步包含蛋白srpk1；优选地，所述抗原蛋白组合进一步包含蛋白frmd8。或者，所述抗原蛋白组合包含蛋白rage、dnajc8、mrpl34和adarb1，并且还包含蛋白rabpt5；优选地，所述抗原蛋白组合进一步包含蛋白plp1；优选地，所述抗原蛋白组合进一步包含蛋白ptcd2；优选地，所述抗原蛋白组合进一步包含蛋白pomc。根据本发明的具体实施方式，在本发明提供的试剂盒中，所述抗原蛋白组合可以为：1)rage、dnajc8、hsp60、mrpl34；2)rage、dnajc8、hsp60、mrpl34、centa2、cryab、srpk1；3)rage、dnajc8、hsp60、mrpl34、centa2、cryab、srpk1、frmd8；4)rage、dnajc8、hsp60、mrpl34、centa2、cryab、srpk1、frmd8、edrk；5)rage、dnajc8、hsp60、mrpl34、adarb1、ccl2、mapt、asxl1、gdf11；6)rage、dnajc8、hsp60、mrpl34、adarb1、ccl2、mapt、mbp、gdf11；7)rage、dnajc8、mrpl34、adarb1、rabpt5、plp1、ptcd2；8)rage、dnajc8、mrpl34、adarb1、rabpt5、plp1、ptcd2、pomc；9)rage、dnajc8、mrpl34、adarb1、rabpt5、plp1、ptcd2、pomc、p21；或10)rage、dnajc8、il18、vegf、centa2、cryab、srpk1、leng1。本发明提供的蛋白可以根据序列，在大肠杆菌、酵母或哺乳动物细胞中表达获得，并任选地，经ni柱、分子筛、离子柱或疏水柱等纯化。优选地，本发明提供的试剂盒还包括固相载体，所述抗原蛋白组合中包含的蛋白分别固定于固相载体上。优选地，所述固相载体例如是酶标板微孔、磁珠、亲和膜或液相芯片；所述蛋白的固定包括蛋白直接固定于固相载体上，或经由中间连接部分间接固定于固相载体上，例如通过生物素与链霉亲和素之间的特异性反应。本发明提供的试剂盒可以用于检测生物样品(例如血清)中的自身抗体，该检测通过试剂盒中包含的抗原蛋白组合进行，所述组合中的蛋白作为抗原可以与生物样品中的对应的自身抗体(如果存在的话)发生抗原-抗体特异性反应，反应的检测结果可以指示生物样品中的自身抗体的存在与否，进而指示生物样品的来源(通常为哺乳动物，例如人)是否患有阿尔兹海默症或具有患上阿尔兹海默症的风险。因此，相应地，本发明提供的试剂盒还可以包括其他试剂或组分，所述其他试剂或组分在采用所述抗原蛋白组合检测生物样品中自身抗体中使用。根据本发明的具体实施方式，本发明提供的试剂盒可以用于通过酶联免疫吸附法来检测生物样品(例如血清)中的自身抗体。对于通过酶联免疫吸附法进行检测，本发明提供的试剂盒可以是酶联免疫检测试剂盒。出于检测目的，例如，所述蛋白可连接有标签肽，优选地，所述标签肽选自his标签、gst标签、c-myc标签、flag标签、ha标签和生物素标签。又如，本发明提供的试剂盒还可以包括阳性质控品、阴性质控品或标准品。例如，所述阳性质控品或标准品为重组人免疫球蛋白g或其片段。本发明提供的试剂盒还可以包括带有酶标记的免疫球蛋白、包被缓冲液、封闭液、20×洗涤液、血清/抗体稀释液、tmb显色剂、终止液等。基于本发明提供的抗原蛋白组合，可以采用本领域常规技术制备相应的试剂盒。根据本发明的具体实施方式，可以参考中国专利申请公开文件cn103869086a中公开的检测试剂盒的制备方法。另一方面，本发明提供所述试剂盒或其中的抗原蛋白组合在制备用于阿尔茨海默症的检测、诊断或风险预测的试剂中的用途。还一方面，本发明提供一种阿尔茨海默症的检测、诊断或风险预测的方法，所述方法包括，使所述抗原蛋白组合与生物样品相接触。优选地，所述生物样品来自哺乳动物，优选人；优选地，所述生物样品为血清。根据报道，迄今为止已有超过30种自身抗体和ad有相关性，但是，哪些抗体具有ad早期检测或诊断乃至风险预测具有普遍的临床意义，尤其在中国人群中具有临床意义还不清楚，因此，即使是利用自身抗体来对阿尔茨海默症进行诊断，其可行性仍存在疑问。相比之下，本发明提供了一种新型的抗原蛋白组合，所述抗原蛋白组合包含至少四种与阿尔茨海默症特异性相关的蛋白，由此为高灵敏性和高特异性地检测或诊断阿尔茨海默症提供了一种新型工具。相对于现有技术，本发明的技术方案具有以下有益效果：首先，本发明的发明人对50种已知蛋白进行了筛选，发现，相比于其他蛋白，有23种蛋白作为抗原时，可以与阿尔茨海默症患者的自身抗体发生较强特异性反应，由此证明了通过检测受试者的自身抗体来检测或诊断阿尔兹海默症的可行性。并且，本发明的发明人还提供一种抗原蛋白组合，该组合包含筛选出的23种蛋白中的至少四种。进一步地，该23种蛋白可以被分入不同的蛋白组中，通过从不同组的蛋白中选择形成抗原蛋白组合，可以兼顾检测结果的高灵敏度和高特异性。实验证明，在来自阿尔兹海默症患者或健康受试者的生物样品中，本发明提供的抗原蛋白组合实现了高灵敏度和特异性的检测效果，由此提供了一种阿尔茨海默症的相当准确的早期检测、诊断或风险预测工具。本发明提供的抗原蛋白组合可以制成试剂盒，并可用于相关检测方法，从而在受试者例如人中进行阿尔兹海默症的早期筛查、检测、诊断或风险预测，真正实现临床上对阿尔兹海默症的早期筛查，在阿尔兹海默症瘤的诊断和治疗方面具有良好的应用前景。并且，采用抗原蛋白对受试者例如人的生物样品例如血清中自身抗体进行检测，是一种无创性的检测方法，具有使用方便、受试者顺应性好的优势。附图说明以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：图1示出了23种蛋白检测血清中自身抗体的敏感性和特异性。图2示出了不同抗原蛋白组合检测血清中自身抗体的敏感性和特异性，其中2a为总体敏感性和特异性，2b为早期、中期、晚期的敏感性。具体实施方式以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的药材原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。除了抗原蛋白组合，用于检测自身抗体的酶联免疫检测试剂盒(固定抗原)的组成根据需要可包括以下成分：1)用于包被抗原蛋白的酶标板；2)辣根过氧化物酶标记的羊抗人免疫球蛋白，浓度为100ng/ml；3)阳性质控品(标准品)：人抗c-myc标签免疫球蛋白g(购自tribioscience公司)；4)阴性质控品；5)封口膜；6)包被缓冲液，封闭液，20×洗涤液，血清/抗体稀释液，tmb显色剂，终止液，其中：包被缓冲液为pbs，ph7.4，制备方法：取3.58gna2hpo4·12h2o，0.24gkh2po4·2h2o，0.2gkcl及8.0gnacl，使用双蒸水溶解后定容至1l；封闭液的制备方法：将5g酪蛋白溶解于pbs溶液，然后定容至1l；20×洗涤液的制备方法：20×pbs，ph7.4，加入0.5％tween20；血清/抗体稀释液的制备方法：将1g酪蛋白和10g牛血清白蛋白溶解于pbs溶液，然后定容至1l；tmb显色剂的制备方法：50mm咪唑缓冲液ph5，7.5mmpeg3350，2.94mm过氧化氢尿素，1.6mmtmb；终止液的制备方法：2m硫酸。在以下实施例中，利用酶标板以elisa检测血清样本的操作包括：用包被缓冲液将抗原稀释到终浓度为100nm，每孔加入50μl到酶标板上，4℃包被过夜；次日倒掉溶液，把板拍干后，用250μl洗涤液洗三次；加入250μl封闭液，室温孵育封闭1hr后，将板抽干，用250μl洗涤液洗三次，并再次抽干；加入用血清稀释液稀释的血清样本(稀释度1:100)，每孔加50μl，室温置于微孔板振荡仪振荡孵育1hr后，将板抽干，用250μl洗涤液洗三次，并再次抽干，加入用抗体稀释液稀释的辣根过氧化物酶标记的重组羊抗人免疫球蛋白g抗体(1:20000)，每孔加50μl，室温置于微孔板振荡仪振荡孵育0.5hr，将板抽干，用250μl洗涤液洗三次，并再次抽干；每孔加50μltmb显色剂，室温显色15min后，每孔加入50μl终止液；酶标仪于450nm波长下读板，然后再对数据进行分析。实施例1作为自身抗体的抗原的蛋白筛选通过文献检索，选取了50种与阿尔兹海默病相关的已知蛋白，见表2。表2.待测试蛋白的序列以人类cdna文库(购自invitrogen公司)或者全基因合成的dna为模板，采用pcr扩增或者酶切的方法制备所需的重组抗原蛋白片段。例如，将扩增获得的pcr产物纯化后，连接到pet28载体上，并在抗原编码序列上游加入his、c-myc等合适标签以形成融合蛋白，然后将重组载体转化至大肠杆菌dh5α感受态细胞中。获得的重组质粒采用菌落pcr、酶切和测序鉴定确认包含正确的外源片段。将获得的包含融合抗原片段的重组质粒转化至大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞中，经异丙基硫代-β-d-半乳糖苷(iptg)诱导表达，获得重组抗原蛋白，该蛋白经ni-nta柱和分子筛两步纯化后用bradford法定量，采用sds-page鉴定确认抗原蛋白表达、纯化和定量结果。以上述方法获得的抗原包被平板，再以上述elisa检测血清样本的操作步骤检测了94例阿尔兹海默症患者和94例健康受试者产生的对应每种抗原的自身抗体。以94例健康受试者血清为阴性参考样本，计算所有阴性参考样本的检测信号(s)的平均值(m)及标准差(sd)，以m+3sd为cutoff值，检测信号(s)大于或等于cutoff值的样本则定为阳性，即s≥m+3sd则为阳性，检测信号(s)小于cutoff值的样本则定为阴性，即s<m+3sd则为阴性。基于阳性和阴性结果计算特异性和敏感性。其中特异性是指健康受试者样本被正确地判定为阴性的比例，即在阴性样本中被正确地判定为阴性的数量除以阴性样本总数；敏感性是指阿尔兹海默症患者样本被正确地判定为阳性的比例，即在阳性样本中被判定为阳性的数量除以阳性样本总数。通过计算得出每个被测试的蛋白作为抗原，进行样本检测时的敏感性和特异性，结果如表3所示。表3.蛋白作为抗原测试的敏感性和特异性通过比较每个测试抗原的敏感性和特异性，以敏感性≥10％且特异性≥90％的抗原作为候选抗原。最终筛选出23种蛋白可以作为区分阿尔兹海默症患者和健康受试者的理想候选抗原，筛选结果如表4所示。表4.筛选出的抗原蛋白候选抗原敏感性特异性候选抗原敏感性特异性rage35.1％94.7％srpk120.2％98.9％dnajc836.2％92.6％rabpt523.4％98.9％hsp6034.0％98.9％plp113.8％97.9％mrpl3431.9％93.6％ptcd216.0％98.9％adarb129.8％95.7％frmd819.1％97.9％ccl228.7％94.7％pomc21.3％98.9％mapt29.8％100.0％edrk18.1％100.0％asxl127.7％97.9％p2113.8％98.9％gdf1124.5％98.9％il1811.7％97.9％mbp21.3％98.9％vegf16.0％93.6％centa219.1％97.9％leng112.8％97.9％cryab21.3％98.9％实施例2候选的抗原蛋白组合在阿尔兹海默症患者和健康受试者中的检测表现将阿尔兹海默症患者和健康受试者按简易精神状态检查表(mini-mentalstateexamination，mmse)-folstein版进行评分，分数在为27-30的测试者为正常人，分数为21-26的测试者为轻度(早期)患者，分数为10-20的测试者为中度(中期)患者，分数为0-9的测试者为重度(晚期)患者。根据mmse评分，取阿尔兹海默症患者早期120例，中期87例，晚期75例作为检测样本，取94例mmse评分正常的健康受试者作为健康受试者的样本，测试各组抗原蛋白组合的敏感性和特异性。根据实施例1中的筛选结果，从23种蛋白中选择多种蛋白作为抗原组合，以抗原固定的方式，通过elisa使用抗原蛋白组合检测在阿尔兹海默症患者和健康受试者血清中的自身抗体。同样地，以94例健康受试者血清为阴性参考样本，计算所有阴性参考样本的检测信号(s)的平均值(m)及标准差(sd)，以m+3sd为cutoff值，检测信号(s)大于或等于cutoff值的样本则定为阳性，即s≥m+3sd则为阳性，检测信号(s)小于cutoff值的样本则定为阴性，即s<m+3sd则为阴性。基于一个抗原组合中包含的所有抗原各自的阳性和阴性结果计算该组合在不同时期患者样本中的敏感性，以及总体敏感性和总体特异性。其中，排除不同抗原得到的重复结果，计算早期敏感性，其是指120例早期阿尔兹海默症患者样本被正确地判定为阳性的比例，即在早期阿尔兹海默症患者样本中被判定为阳性的数量除以早期阿尔兹海默症患者样本总数；计算中期敏感性，其是指87例中期阿尔兹海默症患者样本被正确地判定为阳性的比例，即在中期阿尔兹海默症患者样本中被判定为阳性的数量除以中期阿尔兹海默症患者样本总数；计算晚期敏感性，其是指75例晚期阿尔兹海默症患者样本被正确地判定为阳性的比例，即在晚期阿尔兹海默症患者样本中被判定为阳性的数量除以晚期阿尔兹海默症患者样本总数。另外，计算总体敏感性，其是指在120例早期、87例中期、75例晚期阿尔兹海默症患者样本总共被正确地判定为阳性的比例，即在所有阿尔兹海默症患者样本中被判定为阳性的数量除以所有阿尔兹海默症患者样本总数；计算总体特异性，其是指94例健康受试者样本被正确地判定为阴性的比例，即在94例健康受试者样本中，健康受试者样本中被判定为阴性的数量除以健康受试者样本总数。兼顾敏感性和特异性，以总体敏感性≥50％且特异性≥85％的抗原组合作为理想抗原组合,筛选出的理想抗原蛋白组合见表5。不同的理想抗原蛋白组合在检测不同时期的阿尔兹海默症患者和健康受试者样本中自身抗体的表现见表6。表5.理想抗原组合表6.不同抗原蛋白组合的检测表现早期敏感性中期敏感性晚期敏感性总体敏感性总体特异性组合175.0％44.8％32.0％54.3％90.4％组合275.0％51.7％44.0％59.6％89.4％组合375.0％58.6％36.0％59.6％88.3％组合477.5％58.6％36.0％60.6％88.3％组合587.5％72.4％76.0％79.8％90.4％组合687.5％72.4％82.5％83.0％90.4％组合782.5％72.4％36.0％67.0％87.2％组合882.5％75.9％36.0％68.1％87.2％组合982.5％79.3％36.0％69.1％87.2％组合1072.5％62.1％48.0％62.8％90.4％通过比较发现，每个组合的总体敏感性都大于54％和特异性都大于87％。相比于中期和晚期，在早期样本中，每个组合都具有更高的敏感性，都大于72％，组合5和组合6的敏感性都达到87.5％。因此，本发明为阿尔茨海默病的诊断、尤其是早期诊断提供了更为精确的检测方法。以上对本发明具体实施方式的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范围。当前第1页12