本发明属于生物检测领域，具体涉及一种用于快速检测农药残留的复配酶液的制备方法。
背景技术：
：随着人们生活水平的不断提高，果蔬中农药残留的问题越来越受到社会各界的关注。有机磷和氨基甲酸酯类农药是我国目前使用量最大的农药，人摄入高剂量的农药会引起急性中毒，而长期摄入低剂量浓度的农药会引起神经传导阻碍等疾病。因此，果蔬农药残留的检测对于食品安全至关重要。传统的农药残留分析方法需要昂贵的仪器设备和专业技术人才，并且受到场地的限制。随着快速检测农药残留技术的出现，上述技术限制被打破。一般快速检测农药残留技术所应用原理是：在一定条件下，有机磷和氨基甲酸酯类农药对乙酰胆碱酯酶的活性具有抑制作用，其抑制率与农药的浓度呈正相关。乙酰胆碱酯酶（ache）是生物神经传导中的一种关键酶，在神经传导中起着至关重要的作用，能高效水解神经传递物质乙酰胆碱（ach），从而使胆碱能神经信号的传递终止。同时，乙酰胆碱酯酶也是有机磷和氨基甲酸酯类农药的靶向酶，有机磷和氨基甲酸酯类农药能使乙酰胆碱酯酶的活性显著降低。利用这一特性，在农药检测中，乙酰胆碱酯酶的活性变化可作为农药毒理学的一个敏感指标。因此，可以用乙酰胆碱酯酶的活性受抑制程度来检测果蔬中的农药残留量。目前乙酰胆碱酯酶提取的提取方法众多。中国专利文献cn101709304a中公开了突变的家蝇乙酰胆碱酯酶基因及其表达载体，其包含乙酰胆碱酯酶的提取方法，具体为通过基因工程改造得到突变的家蝇乙酰胆碱酯酶基因及其表达载体，在酵母细胞中表达突变基因，以此来获得有活性的乙酰胆碱酯酶；中国专利文献cn107513526a中公开了一种农残速测用酶的快速制备方法，旨在简化乙酰胆碱酯酶的制备工艺，其以家蝇为酶源，从家蝇中提取乙酰胆碱酯酶酶液，再经过分装、冷冻、干燥工序后，得到用于快速检测农残的乙酰胆碱酯酶；中国专利文献cn1472316中公开了一种乙酰胆碱酯酶的制备方法，以动物血液为酶源，其工艺步骤包括从酶源中提取乙酰胆碱酯酶酶液，以及用硫酸铵沉淀法纯化乙酰胆碱酯酶和用透析法脱硫酸铵，再将酶液浓缩，干燥，得到纯化的乙酰胆碱酯酶。通过上述专利文献的所述的方法均能得到经过纯化的乙酰胆碱酯酶，然而它们都涉及复杂的提取工艺，制备成本较高，制作周期较长，减弱了酶的活力，且纯化倍数低，无法满足批乙酰胆碱酯酶批量化生产的需求。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种用于快速检测农药残留的复配酶液的制备方法，该复配酶液为乙酰胆碱酯酶复配酶液，酶源丰富，提取简单，可有效缩短乙酰胆碱酯酶的制备时间和生产成本。本发明的目的通过以下技术方案实现：一种用于快速检测农药残留的复配酶液的制备方法，包含以下步骤：（1）将新鲜的蚯蚓清洗干净后冷却，然后与预冷后的磷酸盐缓冲溶液进行匀浆，得到蚯蚓血清酶液；（2）将新鲜的黄鳍鲷去骨、去皮，得到其肌肉组织，然后与预冷后的磷酸盐缓冲溶液进行匀浆，得到黄鳍鲷肌肉组织酶液；（3）取步骤（1）制得的蚯蚓血清酶液和步骤（2）制得的黄鳍鲷肌肉组织酶液，将两种酶液混合，加入tritonx-114或tritonx-100，再添加稳定剂和磷酸盐缓冲溶液制得混合酶液；（4）将步骤（3）制得的混合酶液在35～37℃的条件下加热，然后冷却至室温，并使用离心机离心，离心后取上清液，得到复配酶液。乙酰胆碱酯酶的生物来源主要包括动物的脑部、血液、内脏及肌肉组织。在对多种动物的血液、内脏和肌肉进行对比实验后发现，从动物血清和鱼肉肌肉组织中提取到的乙酰胆碱酯酶酶活较高，用于检测农药残留的效果非常好。蚯蚓和黄鳍鲷都是容易从市场上购买的原材料，而且价格低廉，从蚯蚓和黄鳍鲷肌肉中提取到的乙酰胆碱酯酶酶活较高，适合批量生产乙酰胆碱酯酶的要求。加入表面活性剂tritonx-114或tritonx-100，可使得酶分子构象发生改变，酶活性位点凸显，有利于酶与底物结合。作为本发明推荐的一种实施方式，所述步骤（1）中，蚯蚓与磷酸盐缓冲溶液以质量比1:1～1:4的比例进行匀浆；所述步骤（2）中，黄鳍鲷肌肉组织与磷酸盐缓冲溶液以质量比1:1～1:4的比例进行匀浆。优选地，步骤（3）所述的混合酶液中，蚯蚓血清酶液的含量为5.0～20.0g/l；黄鳍鲷肌肉组织酶液的含量为10.0～50.0g/l。在实验对比后发现，使用对应含量范围内的两种酶液制得的复配酶液用于有机磷和氨基甲酸酯类农药的检测效果最好。优选地，步骤（3）所述的稳定剂为丙三醇。优选地，步骤（3）中tritonx-114或tritonx-100的添加量为0.02～0.10%，w/v；丙三醇的添加量为2.5～10%，w/v。上述添加量均以步骤（3）所述混合酶液的总体积为基准。作为本发明第一种实施方式：所述的磷酸盐缓冲溶液的ph值为7.5～8.0；步骤（4）混合酶液的加热过程中，使用水浴加热10～30min；步骤（4）所述的离心速度为5000～12000r/min，离心过程的温度为0～4℃，离心时间为10～30min。与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：1.本发明所述的复配酶液，作为酶源的蚯蚓和黄鳍鲷来源广泛、易得、价格低廉；且复配酶液的制作过程简单，制备周期短，能有效降低生产成本；2.本发明所述的复配酶液酶活高，大于1.2u/ml，表面活性剂的加入，使得酶分子构象发生改变，酶活性位点凸显，有利于酶与底物结合，从而使得用本发明所述的复配酶液检测有机磷和氨基甲酸酯类农药在果蔬上的残留时，可以提高灵敏度，扩宽检测范围。具体实施方式以下通过具体的实施例对本发明作进一步的说明。以下实施例在对复配酶液酶活的测定方法具体为：（1）取ph值为7.5～8.0的磷酸盐缓冲溶液2.5～10ml于比色皿中，加入50～200μl的复配酶液和50～200μl二硫代二硝基苯甲酸，混匀后在水浴锅中保温10～30min；（2）将紫外分光光度计预热20～30min，在经过步骤（1）处理后的比色皿中加入50～200μl碘化硫代乙酰胆碱溶液，于400～450nm的波长范围内进行比色；（3）按照以下公式计算酶活：酶活力（u/ml）=（v×δa×106）/（t×ε×v×ι）公式（1）其中：v为反应体系的总体积，数值为5.3×10-3l；δa为3min前后的吸光度变化值；t为反应时间；ε为黄色产物摩尔消光系数，数值为1.36×104l/（mol·cm）；v为复配酶液的体积；ι为比色皿光程，数值为1cm。实施例1（1）将新鲜的蚯蚓清洗干净后于4℃的冰箱中冷却，然后与预冷后的ph值为7.5的磷酸盐缓冲溶液以质量比1:4的比例进行匀浆，得到蚯蚓血清酶液；（2）将新鲜的黄鳍鲷去骨、去皮，得到其肌肉组织，然后与预冷后的ph值为7.5的磷酸盐缓冲溶液以质量比1:4的比例进行匀浆，得到黄鳍鲷肌肉组织酶液；（3）取步骤（1）制得的蚯蚓血清酶液和步骤（2）制得的黄鳍鲷肌肉组织酶液，将两种酶液混合，加入0.02%，w/v的tritonx-114，再添加10%，w/v丙三醇和ph值为7.5的磷酸盐缓冲溶液制得蚯蚓血清酶液的含量为10.0g/l、黄鳍鲷肌肉组织酶液的含量为10.0g/l的混合酶液；（4）将步骤（3）制得的混合酶液在35℃的条件下水浴加热10min，然后冷却至室温，并使用离心机在0℃、5000r/min的条件下离心30min，离心后取上清液，得到复配酶液。实施例2（1）将新鲜的蚯蚓清洗干净后于4℃的冰箱中冷却，然后与预冷后的ph值为8.0的磷酸盐缓冲溶液以1:1的比例进行匀浆，得到蚯蚓血清酶液；（2）将新鲜的黄鳍鲷去骨、去皮，得到其肌肉组织，然后与预冷后的ph值为8.0的磷酸盐缓冲溶液以1:1的比例进行匀浆，得到黄鳍鲷肌肉组织酶液；（3）取步骤（1）制得的蚯蚓血清酶液和步骤（2）制得的黄鳍鲷肌肉组织酶液，将两种酶液混合，加入0.10%，w/v的tritonx-100，再添加5%，w/v丙三醇和ph值为8.0的磷酸盐缓冲溶液制得蚯蚓血清酶液的含量为20.0g/l、黄鳍鲷肌肉组织酶液的含量为50.0g/l的混合酶液；（4）将步骤（3）制得的混合酶液在37℃的条件下水浴加热15min，然后冷却至室温，并使用离心机在4℃、9000r/min的条件下离心20min，离心后取上清液，得到复配酶液。实施例3（1）将新鲜的蚯蚓清洗干净后冷却，然后与预冷后的ph值为7.8的磷酸盐缓冲溶液以1:2的比例进行匀浆，得到蚯蚓血清酶液；（2）将新鲜的黄鳍鲷去骨、去皮，得到其肌肉组织，然后与预冷后的ph值为7.8的磷酸盐缓冲溶液以1:2的比例进行匀浆，得到黄鳍鲷肌肉组织酶液；（3）取步骤（1）制得的蚯蚓血清酶液和步骤（2）制得的黄鳍鲷肌肉组织酶液，将两种酶液混合，加入0.08%，w/v的tritonx-114，再添加2.5%，w/v丙三醇和ph值为7.8的磷酸盐缓冲溶液制得蚯蚓血清酶液的含量为5.0g/l、黄鳍鲷肌肉组织酶液的含量为40.0g/l的混合酶液；（4）将步骤（3）制得的混合酶液在35～37℃的条件下水浴加热30min，然后冷却至室温，并使用离心机在2℃、12000r/min的条件下离心10min，离心后取上清液，得到复配酶液。计算实施例2所制得的复配酶液，于412nm波长处进行比色，得到其吸光度变化值δa=1.137，代入公式（1）中计算得到所述复配酶液的酶活为1.477u/ml。使用实施例2所制得的复配酶液对部分有机磷和氨基甲酸酯类农药的检出限进行检测，结果如下表-1所示：表-1农药名称检出限（mg/kg）农药名称检出限（mg/kg）杀扑磷0.1丁柳克百威0.02杀螟硫磷0.1敌敌畏0.1水胺硫磷0.1对硫磷0.1三唑磷0.1辛硫磷0.3灭线磷0.1甲胺磷1.5马拉硫磷3.0氧化乐果0.2丙溴磷0.2灭多威0.1敌百虫0.1呋喃丹0.02三羟基克百威0.1地虫硫磷0.1下表-2所示为蚯蚓血清对部分有机磷和氨基甲酸酯类农药的检出限的测试结果。表-2农药名称检出限（mg/kg）农药名称检出限（mg/kg）杀扑磷1.0丁柳克百威0.5杀螟硫磷1.2敌敌畏0.2水胺硫磷2.0对硫磷/三唑磷3.0辛硫磷0.8灭线磷/甲胺磷/马拉硫磷/氧化乐果1.0丙溴磷1.0灭多威0.4敌百虫0.25呋喃丹0.2三羟基克百威0.8地虫硫磷/下表-3所示为罗非鱼对部分有机磷和氨基甲酸酯类农药的检出限的测试结果。表-3农药名称检出限（mg/kg）农药名称检出限（mg/kg）杀扑磷0.5丁柳克百威0.5杀螟硫磷0.5敌敌畏0.2水胺硫磷0.8对硫磷/三唑磷0.8辛硫磷0.75灭线磷0.5甲胺磷5.0马拉硫磷5.0氧化乐果1.0丙溴磷0.8灭多威0.25敌百虫0.2呋喃丹0.05三羟基克百威0.5地虫硫磷1.0从上表-1、表-2、表-3可以看出，相比于蚯蚓血清和罗非鱼，实施例2所制备的乙酰胆碱酯酶复配酶液酶活较高，对各种有机磷和氨基甲酸酯类农药的检出限都处在一个更低的数值水平，说明其农药残留检测灵敏度高，可有效保证食品安全。需要指出的是，上述实施例仅是对本发明的进一步说明，而不是限制，本领域技术人员在与本发明技术方案的相当的含义和范围内的任何调整或改变，都应认为是包括在本发明的保护范围内。当前第1页12