一种核酸适配体与其靶标相结合的监测装置及其应用的制作方法

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种核酸适配体与其靶标相结合的监测装置及其应用。

背景技术：

适体，单链的核酸即rna或者单链dna(ssdna)，经自身卷曲折叠，形成特定的三维空间结构，他们能够通过非共价的形式高亲和力和特异性地结合于其靶标分子，从而具备类似抗体的性质，且靶标分子范围广泛包括小分子，离子，蛋白，细胞，组织乃至生物体。适体的制备无需使用动物，可以体外合成；具有分子量小，靶标更广泛，免疫源性低，质控和储存简单等优点。

适体由于具有广泛的前景而备受关注，但适体领域面临的瓶颈问题之一依然是筛选问题。适体，最先于1990年通过三个独立的研究人员独立开发，并且适体是通过(systematicevolutionofligandsbyexponentialenrichment，selex)技术体外筛选获得。通常从一个随机ssdna和rna(库容量为10¹⁵-10¹⁶)通过三个主要的步骤：筛选，分离以及扩增。尽管适体有可能实现高通量筛选、自动化筛选等等，但目前依然是高成本、高失败率、耗时费力的工作，很多研究者对此望而却步。在selex的每一轮筛选中对文库的富集情况进行监测是决定适体筛选方向是否正确以及保证筛选成功率和效率的关键步骤，现阶段也有很多的靶标和适体结合的测定方法例如点杂交(dotblotting)，凝胶迁移实验(electrophoreticmobilityshiftassay，emsa)，基于适体的免疫吸附实验(aptamer-linkedimmobilizedsorbentassay，alisa)，表面等离子体共振(surfaceplasmonresonance，spr)，石英晶体微天平(quartzcrystalmicrobalance，qcm)以及实时荧光定量pcr(real-timequantitativepcr，qpcr)等，但现阶段绝大多数方法均需要相对昂贵的仪器，需要对适体进行一定的化学修饰或者需要专业的仪器操作人员，因此，在常规筛选过程中存在着诸多的不足与不便。

cn204154725u公开了一种用于双向琼脂糖扩散试验的平皿，其在平皿主体上设计了凸起，在凝胶凝固后用打孔器对着凸起打孔，从而避免打穿凝胶，但其存在打孔底部不均一，打孔边缘不圆润等缺点。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术缺陷，提供一种核酸适配体与其靶标相结合的监测装置。

本发明的另一目的在于提供一种应用上述监测装置进行监测的方法。

本发明的技术方案如下：

一种核酸适配体与其靶标相结合的监测装置，包括

一底座，为一具有上开口的盒体，其底板的两侧分别具有一沿底板所在平面向外延伸的压板；

一托盘，其形状尺寸适配盒体的上开口，其两端的边缘分别向上形成二侧壁；

不同尺寸且可相互组合或替换的若干制孔模具，每一制孔模具均包括一顶板，该顶板的下表面为光滑的，该下表面向下凸设阵列分布、表面光滑且尺寸相同的若干圆柱状凸起；

一光滑玻璃板，其尺寸与托盘的尺寸适配，以于盒体内承托凝胶；

上述托盘通过底座的上开口置于底座的盒体的内腔，光滑玻璃板置于托盘上，上述若干制孔模具的至少之一盖设于盒体的上开口，以通过若干圆柱状凸起在上述凝胶上形成若干加样孔。

在本发明的一个优选实施方案中，所述盒体的内腔的长度为81-243mm，宽度为26-78mm，高度为8-15mm。

进一步优选的，所述托盘的长度比所述盒体的内腔的长度短0.5-1mm，所述托盘的宽度比所述盒体的内腔的宽度短0.5-1mm。

进一步优选的，所述托盘的二侧壁的高度比所述盒体的内腔的高度长10-20mm。

在本发明的一个优选实施方案中，所述圆柱状凸起的高度为2-8mm，直径为0.9-3mm。

本发明的另一技术方案如下：

一种用上述监测装置进行监测的方法，包括如下步骤：

(1)将所述托盘置于所述底座的盒体的内腔，在所述托盘上放置光滑玻璃板，向所述底座的盒体的内腔中倒入加入了核酸染料进行预染的凝胶溶液，然后盖上所述若干制孔模具的至少之一，待凝胶溶液凝固后，撤去所述若干制孔模具的至少之一，凝胶上形成若干阵列分布分布的若干加样孔；

(2)在所述若干加样孔中分别加入经预处理的适体、对应的靶标样品和对照，进行面对面扩散，即适体和靶标样品以及对照存在相互的扩散，且扩散期间保持凝胶的胶面与水平面平行，其中加入适体的加样孔位于加入靶标样品的加样孔和加入对照的加样孔的连线的中点；

(3)对凝胶进行成像，然后利用图片分析软件分别测量适体扩散的最外圈与加入靶标样品的加样孔的中心的第一距离以及与加入对照的加样孔的中心的第二距离，用第一距离除以第二距离，当结果大于1或出现核酸沉淀线时，表示监测到适体与靶标样品有结合。

在本发明的一个优选实施方案中，所述凝胶溶液由所述适体和靶标的结合缓冲液配制而成。

在本发明的一个优选实施方案中，所述核酸染料为单链dna或rna着色染料。

在本发明的一个优选实施方案中，所述预处理为：将适体在70-96℃保温8-12min后，缓慢降至室温或者直接冰浴使其形成空间构象。

本发明的有益效果是：

1、本发明的监测装置能够重复使用，所制得的加样孔的底部均一，边缘圆润，且尺寸一致性好。

2、本发明的监测方法将适体、靶标和对照面对面加到孔内，进行类双向免疫扩散，克服了现有结合监测测定方法的需昂贵的仪器设备以及适体需要化学标记的缺点；本发明的监测方法与常规的类免疫方法及荧光法相比减少了适体的标记的步骤(如biotin及fam等)；与利用spr及qcm等检测方法相比不需要复杂昂贵的检测设备，也不需要昂贵的芯片耗材，减低了成本；与利用qpcr进行检测相比，本实验操作简单，不存在由于pcr错误扩增等不稳定因素对结果造成影响，实验结果观测容易。

3、本发明的监测方法基于物质在凝胶中的自由扩散，这种扩散是以加样点为中心呈圆周扩散；当核酸适体(含偶联配体核酸)和其对应靶标加到不同的孔中，在一定的距离内，两者均呈现以加样孔为中心的圆周自由扩散，但当两者相遇接触后并开始结合形成复合物，核酸靶标复合物的扩散速度较自由核酸慢，从而与对照组相比出现了明显差异，这种差异可以通过凝胶成像技术进行检测。

4、本发明的监测方法中由于是基于物质在凝胶均相体系中的自由扩散，对靶标分子没有特殊的要求，与dotblotting，emsa，alsia以及spr等相比，靶标范围更广。

5、本发明的监测方法与常规的双向免疫扩散相比，制备的凝胶更为均一且孔底部与载玻片之间存在相同的间距，以保证扩散的均匀性和连续性，并且可以用适体和靶标的结合缓冲液进行凝胶配制，避免了缓冲液对适体和靶标结合的影响。

附图说明

图1为本发明的监测装置的组装状态部分结构剖视图。

图2为本发明的监测装置的俯视图。

图3为本发明的监测方法的原理示意图，其中，t：target，靶标组；a：aptamer，适体组；c：control，对照组；fdig为英文facetofacediffusioningel(凝胶中面对面扩散)的简写。

图4为本发明实施例2中的凝胶放置方向对单链dna扩散的影响结果照片。

图5为本发明实施例3中最佳扩散距离优化照片(以sa和生物素化单链dna(biotin-ssdna)结合监测为例)，其中sa为链霉亲和素，bsa为牛血清白蛋白，biotin-ssdna为生物素化单链dna；虚线为辅助线用于标示dna扩散状态；“箭头”指示处为核酸-靶标结合的“沉淀线”。

图6为本发明实施例4中的凝血酶与其适体相结合的监测结果照片，其中apt为适体，bsa为牛血清白蛋白，tba为凝血酶蛋白；1中蛋白浓度为1μg/μl，2中浓度为0.1μg/μl；虚线为辅助线用于标示dna扩散状态。

具体实施方式

以下通过具体实施方式结合附图对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。

实施例1

如图1和图2所示，一种核酸适配体与其靶标相结合的监测装置，包括一底座1、一托盘2、不同尺寸且可相互组合或替换的若干制孔模具3和一光滑玻璃板4，除光滑玻璃板4外，其余均优选由3d打印机利用sla技术进行打印完成，打印精度为0.10mm。

底座1，为一具有上开口的盒体，其底板10的两侧分别具有一沿底板10所在平面向外延伸的压板11；盒体的内腔的长度为81-243mm(优选81mm)，宽度为26-78mm(优选26mm)，高度为8-15mm(优选10mm)；

托盘2，其形状尺寸适配盒体的上开口，其两端的边缘分别向上形成二侧壁20；托盘2的长度比盒体的内腔的长度短0.5-1mm，托盘2的宽度比盒体的内腔的宽度短0.5-1mm，托盘2的二侧壁20的高度比盒体的内腔的高度长10-20mm，优选的，托盘2的长度为80.5mm，宽度为25.5mm，二侧壁20的高度为24.5mm；

不同尺寸且可相互组合或替换的若干制孔模具3，每一制孔模具3均包括一顶板30，该顶板30的下表面为光滑的，该下表面向下凸设阵列分布、表面光滑且尺寸相同的若干圆柱状凸起31，圆柱状凸起31的高度为2-8mm(优选3.20mm)，直径为0.9-3mm(优选1.7mm)；

光滑玻璃板4，其尺寸与托盘2的尺寸适配，以于盒体内承托凝胶，该光滑玻璃板4优选为市售常规载玻片；

上述托盘2通过底座1的上开口置于底座1的盒体的内腔，光滑玻璃板4置于托盘2上，上述若干制孔模具3的至少之一盖设于盒体的上开口，以通过若干圆柱状凸起31在上述凝胶上形成若干加样孔。

如图3所示，用上述监测装置进行监测的方法，其原理为：

当核酸适体(含偶联配体核酸)和其对应靶标加到不同的加样孔中，在一定的距离内，两者均呈现以加样孔为中心的圆周自由扩散，但当两者相遇接触后并开始结合形成复合物，核酸靶标复合物的扩散速度较自由核酸慢，从而与对照组相比出现了明显差异，这种差异可以通过凝胶成像技术进行检测；

具体包括如下步骤：

(1)将所述托盘2置于所述底座1的盒体的内腔，在所述托盘2上放置光滑玻璃板4，向所述底座1的盒体的内腔中倒入加入了核酸染料(单链dna或rna着色染料，优选gelred或sybrgoldi)进行预染的凝胶溶液(由适体与靶标的结合缓冲液配制)，然后盖上所述若干制孔模具3的至少之一，待凝胶溶液凝固后，撤去所述若干制孔模具3的至少之一，凝胶上形成若干阵列分布分布的若干加样孔；

(2)在所述若干加样孔中分别加入经预处理的适体、对应的靶标样品和对照，进行面对面扩散，即适体和靶标样品以及对照存在相互的扩散，且扩散期间保持凝胶的胶面与水平面平行，其中加入适体的加样孔位于加入靶标样品的加样孔和加入对照的加样孔的连线的中点；上述预处理为：将适体在70-96℃保温8-12min后，缓慢降至室温或者直接冰浴使其形成空间构象；

(3)对凝胶进行成像，然后利用图片分析软件分别测量适体扩散的最外圈与加入靶标样品的加样孔的中心的第一距离以及与加入对照的加样孔的中心的第二距离，用第一距离除以第二距离，当结果大于1或出现核酸沉淀线时，表示监测到适体与靶标样品有结合。

实施例2凝胶放置方向对单链dna扩散的影响一、配制实验所需凝胶

1.本实施例应用实施例1的检测装置进行(加样孔孔内半径0.85mm)(如图4所示)；按照需要安装好实施例1的检测装置，使用琼脂糖(biowest，货号yzqzt-100g)利用bindingbuffer(20mmtris-hcl，ph7.5，100mmnacl，2mmmgcl2，5mmkcl，1mmcacl2，过0.22μm滤器)配制2％浓度的凝胶，在凝胶为凝固前添加1x的gelred(江苏凯基生物技术股份有限公司，货号为kgm025r)，室温凝固30min以上；

2.小心均匀取下制孔模具3，不可使孔边缘破坏及带出部分凝胶。

二、配制单链dna

3.利用bindingbuffer配制单链dna(终浓度为10μm)(序列：5’-tttttttttttttttggttggtgtggttgg-3’(seqidno01))，由上海生工合成，)，需在96℃保温10min，缓慢将至室温，使其恢复特定构象；

4.利用微量移液器小心吸取5μl配制好的单链dna，按照图3的加样方式进行加样；

7.加样前需提前观察凝胶的加样孔内是否有气泡，有的话需要赶出；另外切记不要将溶液漏到孔外的区域，以免造成误差。

8.扩散需要放置在保湿盒内进行，保湿盒内需加上蒸馏水；扩散温度为室温；

9.扩散时需保持凝胶及其载玻片保持贴合且其所在平面与水平面二面角为75°～80°，扩散时间为3h；

三、拍照及结果分析

10.将凝胶置于tanon凝胶成像系统(上海天能科技有限公司，model：4600sf)，静置3-5min使凝胶恢复原始形状，避免由于人为操作引起扩散的差异，随后进行紫外成像；

11.调节对比度等操作查看dna扩散情况。在对比度调整清晰时，保存图片，利用image-proplus6.0软件中的“measurelengthanddistance”工具测量上下左右边界离中心的距离。

12.结果显示，凝胶处于接近垂直状态扩散时，在3h内对dna的扩散行为没有显著的影响，其仍呈现以加样孔为中心的圆周扩散。但是经image-proplus6.0测量扩散距离，发现上下左右间还有细微的差异，因此，后期实验时还是以水平放置为宜。

实施例3：最佳扩散距离优化(以sa和生物素化dna(biotin-ssdna)相结合监测实验为例)

一、配制实验所需凝胶

按照实施例2的步骤1和2进行实验凝胶配制，区别在于所述制孔模具3为(孔内半径为0.85mm，孔间距分别为1.0，1.5，2.0，2.5，3.0mm)(如图5所示)；

二、配制sa、bsa以及biotin-ssdna

3.利用bindingbuffer(配方同实施例1)配制biotin-ssdna(终浓度为10μm)(biotin-ssdna由上海生工进行修饰合成，序列为：5’-biotin-agcttgctgcagcgattcttgatcgccacagagct-3’(seqidno02))，同时用pbs(ph7.4)配制sa(1μg/μl)和bsa(1μg/μl)，sa和bsa均购自北京索莱宝科技有限公司，货号分别为s9170-1mg和a8020；

三、进行面对面扩散

4.利用微量移液器小心吸取5μl配制好的biotin-ssdna，sa以及bsa蛋白样品，按照图4的加样方式进行加样；

5.加样前需提前观察加样孔内是否有气泡，有的话需要赶出；另外切记不要将溶液漏到孔外的区域，以免造成误差。

6.面对面扩散需要放置在保湿盒内进行，保湿盒内需加上蒸馏水；扩散温度为室温；

7扩散时需保持凝胶及其载玻片平稳且与水平面平行，扩散时间为3h；

四、拍照及结果分析

8.将凝胶连同光滑玻璃板置入tanon凝胶成像系统，静置3-5min使凝胶恢复原始形状，避免由于人为操作引起扩散的差异，随后进行紫外成像；

9.调节对比度等操作查看适体扩散情况；在对比度调整清晰时，保存图片，利用image-proplus6.0软件中的“measurelengthanddistance”工具测量距离，得到以pixels为单位的测量数据，通过计算靶标组和对照组的比率监测结合。

10.结果显示，如图5，绝大多数(4/5)扩散距离组均显著观察到了sa抑制dna扩散的现象，说明sa和biotin-ssdna有结合。但是，距离为1.5和1.0，孔间距太小，导致扩散均没过了加样孔，从而导致无法计算距离，不过也呈现出了sa组的“特有沉淀线”。距离为3.0时，扩散距离偏大，在3h扩散时间内，导致结果不明显(比率为1.021)且还未出现明显的“沉淀线”差异；其中，距离2.0和2.5，孔间距适中，可以通过计算比率监测结合情况，通过计算距离2.0和2.5的比值分别为1.273和1.286(均大于1.0)，并且在这个距离下还可以通过“沉淀线”进行判断，从而使结果的判断更加准确。，

从这个结果也可以得知，不同靶标以及适体利用本实施例进行结合行为监测时，扩散距离也是一个比较关键的因素。

实施例4：凝血酶(tba)适体和凝血酶相结合监测实验按照实施例3所述步骤1-9的方法进行处理，其区别尽在所述监测装置更换了另一种不同的制孔模具3(如图6所示，孔内半径为0.85mm，孔中心间距2.50mm)，靶标蛋白为tba(组1和组2分别为1μg/μl和0.1μg/μl)购自haematologictechnologiesinc，货号为hct-0020。适体由上海生工合成，序列：5’-tttttttttttttttggttggtgtggttgg-3’(seqidno01)。本实施例中所用tba与其适体经dotblotting验证能够结合(数据未展示)；此外，按照实施例2所述步骤，在其步骤3之后步骤4之前需要将适体置于96℃保温10min，迅速置于冰上5min，室温恢复5min，使其恢复特定构象；并且所配制的蛋白在未加入凝胶之前需要冰上保存。最后，步骤7扩散时间为6h。

结果显示：如图6，tba组1(1μg/μl)和组2(0.1μg/μl)的比率分别为1.148和1.172(均大于1.0)，且从图中也可能清晰看出tba组的扩散速率明显慢于bsa组，说明tba和适体有结合。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。

序列表

<110>华侨大学

<120>一种核酸适配体与其靶标相结合的监测装置及其应用

<160>2

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>30

<212>dna

<213>artificalsequence

<400>1

tttttttttttttttggttggtgtggttgg30

<210>2

<211>35

<212>dna

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<400>2

agcttgctgcagcgattcttgatcgccacagagct35