一种乙肝五项时间分辨荧光免疫层析测定试剂盒的制作方法

本发明属于传染病蛋白免疫分析技术领域，尤其是涉及一种乙肝五项时间分辨荧光免疫层析测定试剂盒及其制备方法。

背景技术：

乙型肝炎病毒(hbv)是一种很小的病毒，它属于嗜肝脱氧核糖核酸(dna)病毒组中的一个成员。病毒颗粒由外膜和内核两部分组成，完整的hbv颗粒是直径42nm的球形颗粒，其外膜厚7nm，由蛋白质的膜脂质组成，称作乙型肝炎表面抗原(hbsag)，是感染病毒的标志。乙型肝炎表面抗体(hbsab)是对乙肝病毒免疫的保护性抗体。它的出现标志对hbv感染产生特异性免疫，通常在hbv感染恢复期或注射乙肝疫苗后出现。

病毒中心部分的直径约为28nm，为病毒的核心，其中包括e抗原(hbeag)，是病毒复制的标志。以及核心抗原(hbcag)，hbcag在hbv感染中占有重要地位，他能反映血清中:dane颗粒的存在及肝内hbv的复制，并可与其他的hbv血清学标志物起互相配合和互相补充的作用。由于核心抗体(hbcab)具有很强的亲和力，能迅速地与血清中的hbcag结合，形成免疫复合物，因而难以在血清中测得游离的hbcag，因此乙肝检测的血清标志物通常为不含核心抗原在内的两对半。

乙肝的早期诊断和防治是避免大规模感染和传播的重要举措，否则无论是病情恶化还是病毒传播，都会给自身和他人的人身健康和财产状况带来损失。

目前，在临床检验中，主要以酶联免疫吸附法、胶体金免疫层析法、化学发光法和磁微粒化学发光法等不同形式和反应原理的检测方法。现有的检测方法存在一些缺点，诸如检测时间长、测试操作复杂。而普通的胶体金免疫层析虽然操作简便，但会出现检测的反应速度过慢，显色不均匀，检测结果判定模糊，灵敏度不佳的问题。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明旨在提出一种乙肝五项时间分辨荧光免疫层析测定试剂盒；该试剂盒能快速反应，灵敏度高、特异性强的检测乙肝两对半的试剂盒，以实现乙肝两对半检测过程中，便捷、快速的出具准确的检测结果。

为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：

一种乙肝五项时间分辨荧光免疫层析测定试剂盒，包括检测卡以及荧光微球工作液；

所述检测卡包括用于检测hbsag(乙肝表面抗原)的检测卡、用于检测hbeag(乙肝e抗原)的检测卡、用于检测抗-hbs(乙肝表面抗体)的检测卡、用于检测抗-hbe(乙肝e抗体)的检测卡和用于检测抗-hbc(乙肝核心抗体)的检测卡；

所述的用于检测hbsag的检测卡，包括硝酸纤维素膜，其上分别包被抗-hbs抗体和链霉亲和素在检测区和质控区；

所述的用于检测hbeag的检测卡，包括硝酸纤维素膜，其上分别包被有抗-hbe抗体和链霉亲和素在检测区和质控区；

所述的用于检测抗-hbs的检测卡，包括硝酸纤维素膜，其上分别包被有hbsag和链霉亲和素在检测区和质控区；

所述的用于检测抗-hbe的检测卡，包括硝酸纤维素膜，其上分别包被有hbeag和链霉亲和素在检测区和质控区；

所述的用于检测抗-hbc的检测卡，包括硝酸纤维素膜，其上分别包被有hbcag和链霉亲和素在检测区和质控区；

所述荧光微球工作液，包括生物素标记的时间分辩荧光微球与下述各抗体或抗原标记的时间分辨微球分别形成的混储液；抗体或抗原标记的时间分辨微球为，具有与检测区单抗不同位点的抗-hbs抗体标记的时间分辨荧光微球，具有与检测区单抗不同位点的抗-hbe抗体标记的时间分辨荧光微球，hbsag标记的时间分辨荧光微球，包含hbeag标记的时间分辨荧光微球，或包含hbcag标记的时间分辨荧光微球。

优选的，以相应的抗体、抗原或生物素标记物浓度计，抗-hbs抗体标记的时间分辨荧光微球的浓度为50～200μg/ml；抗-hbe抗体标记的时间分辨荧光微球的浓度为50～200μg/ml；hbsag标记的时间分辨荧光微球的浓度为50～200μg/ml；包含hbeag标记的时间分辨荧光微球的浓度以抗原浓度计为50～200μg/ml；包含hbcag标记的时间分辨荧光微球的浓度以抗原浓度计为50～200μg/ml；生物素标记的时间分辩荧光微球的浓度以生物素标记物浓度计为50～300μg/ml；优选的，抗-hbs抗体标记的时间分辨荧光微球的浓度为100μg/ml；抗-hbe抗体标记的时间分辨荧光微球的浓度为100μg/ml；hbsag标记的时间分辨荧光微球的浓度为100μg/ml；包含hbeag标记的时间分辨荧光微球的浓度以抗原浓度计为100μg/ml；包含hbcag标记的时间分辨荧光微球的浓度以抗原浓度计为100μg/ml；生物素标记的时间分辩荧光微球的浓度以生物素标记物浓度计为200μg/ml。

优选的，所述时间分辨荧光微球的粒径为100～300nm；且微球内包裹的镧系元素为铕，活性官能团为羧基。

优选的，所述的荧光微球工作液的制备方法，包括如下步骤，

a)荧光微球的活化：

用5-100mm的ph6.0-8.0缓冲液，将荧光微球的质量-体积浓度(固含量)调整为0.05％-0.2％，优选的浓度为0.05％；向体系中加入10-100μl浓度为10-50mg/ml的碳二亚胺溶液，超声混匀后加入10-100μl浓度为10-50mg/ml的n-羟基硫代琥珀酰亚胺，超声混匀后，常温混匀15-30分钟；离心处理反应后的荧光微球，弃上清后用5-100mm的ph5.0-6.5的mes缓冲液复溶至原体积；2-8℃环境下储存备用。

b)荧光微球与抗原/抗体蛋白的偶联：

向活化好的荧光微球溶液中加入终浓度为50-300μg/ml的抗原或抗体或生物素，优选的，抗体或抗原的终浓度为80-120μg/ml；生物素终浓度为180-220μg/ml；室温混匀2-4小时后，向其中加入封闭剂，室温混匀0.5-2小时；离心处理，弃上清，沉淀物用至少包含质量浓度0.1％-8％的蔗糖和体积分数0.01％-0.3％的proclin300的pbs或mes作为稀释液重悬至原标记体积，配制成各抗体、抗原或生物素标记的荧光微球浓储液；优选的，所述的稀释液为含蔗糖质量浓度为8％，海藻糖质量浓度为2％以及体积浓度为0.05％的procline的ph为6.0的20mmmes；用于稀释浓储配制工作液时，优选的，应包含bsa的质量浓度为0.5％、蔗糖的质量浓度为0.3％、海藻糖的质量浓度为0.2％、procline的体积浓度为0.05％、tween-20体积浓度为0.05％的ph为7.4的pbs缓冲液。

优选的，步骤b)中，封闭剂为牛血清白蛋白、酪蛋白、甘氨酸或脱脂乳粉中的一种或几种，其质量浓度为0.5-1.5％；优选的，抗原或抗体或生物素与荧光微球偶联后，将偶联抗体或抗原的荧光微球分别与偶联生物素的荧光微球按照体积比为1：1-3：1的比例配制成混合浓储液，优选的1：1；将混合浓储液与上述稀释液按体积比1：100—1：500的比例配制成微球工作液；优选的，1:200。

优选的，所述的检测区分别对应包被的抗-hbs、抗-hbe、hbsag、hbeag、hbcag浓度为0.5-2.0mg/ml；质控区包被的链霉亲和素浓度在0.5-2.0mg/ml。

本发明还提供了一种制备如上所述的乙肝五项时间分辨荧光免疫层析测定试剂盒的方法，包括检测卡的制备以及荧光微球工作液的制备；

所述检测卡的制备包括以下步骤，

1)检测区和质控区的制备；

将对应的抗体或抗原和链霉亲和素(sa)分别以0.5～2mg/ml和0.2～1mg/ml的终浓度均匀分散于含质量浓度为0.5％-1％海藻糖的缓冲液中，均匀的喷涂于硝酸纤维素膜的检测区和质控区，并在35-50℃条件下烘干固化。

2)检测卡组装

将吸水纸、含检测区和质控区的硝酸纤维素膜、滤血膜、样品垫依次搭接(1-2mm)的粘贴于底板，裁切成3-4mm的卡条，装入卡壳中。分别制成hbsag检测卡、hbeag检测卡、抗-hbs检测卡、抗-hbe检测卡、抗-hbc检测卡。

优选的，将对应的抗体或抗原和链霉亲和素分别以0.8mg/ml和0.5mg/ml的终浓度均匀分散于含质量浓度为1％海藻糖的缓冲液中，均匀的喷涂于硝酸纤维素膜的检测区和质控区，并在35～50℃条件下烘干固化。

本发明中，检测卡由依次粘贴在底板上的吸水纸、硝酸纤维素膜、滤血膜、样品垫和卡壳组成，硝酸纤维素膜上包被有检测区和质控区；荧光微球工作液中含有标记相应抗原或抗体的时间分辨荧光微球。检测过程中，结合在检测区和质控区的荧光微球复合物，在激发光的作用下，发射出的荧光，由荧光免疫分析仪采集处理，即可计算出检测结果。

本发明同时提供如上所述的试剂盒或如上所述的制备方法得到的检测盒在定量检测抗-hbs、抗-hbe、hbsag、hbeag、抗-hbc的含量的试剂中的应用。

相对于现有技术，本发明所述的试剂盒，具有以下优势：

(1)本发明所述的试剂盒，采用了时间分辨荧光免疫层析，特异性和灵敏度均达到98％以上。

(2)本发明所述的试剂盒，采用了侧向层析的方法，操作便捷快速。兼具了时间分辨的高灵敏度和侧向层析的便捷快速的优点。

附图说明

图1为磁微粒化学发光法与本方法试剂盒检测hbsab结果相关性；

图2为磁微粒化学发光法与本方法试剂盒检测hbsag结果相关性；

图3为磁微粒化学发光法与本方法试剂盒检测hbeab结果相关性；

图4为磁微粒化学发光法与本方法试剂盒检测hbeag结果相关性；

图5为磁微粒化学发光法与本方法试剂盒检测hbcab结果相关性。

具体实施方式

除有定义外，以下实施例中所用的技术术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的试验试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

所有的数字标识，例如ph、温度、时间、浓度，包括范围，都是近似值。要了解，虽然不总是明确的叙述所有的数字标识之前都加上术语“约”。同时也要了解，虽然不总是明确的叙述，本文中描述的试剂仅仅是示例，其等价物是本领域已知的。

下面结合实施例来详细说明本发明。

一、检测卡的制备

(1)检测区和质控区的制备；

hbsag检测卡：将抗-hbs抗体和sa分别以0.8mg/ml和0.5mg/ml的终浓度均匀分散于含质量浓度为1％海藻糖的缓冲液中，分别均匀的喷涂于硝酸纤维素膜的检测区和质控区，并在37℃条件下烘干固化。

hbeag检测卡：将抗-hbe抗体和sa分别以0.8mg/ml和0.5mg/ml的终浓度均匀分散于含质量浓度为1％海藻糖的缓冲液中，分别均匀的喷涂于硝酸纤维素膜的检测区和质控区，并在37℃条件下烘干固化。

抗-hbs检测卡：将hbsag和sa分别以0.8mg/ml和0.5mg/ml的终浓度均匀分散于含质量浓度1％海藻糖的缓冲液中，分别均匀的喷涂于硝酸纤维素膜的检测区和质控区，并在37℃条件下烘干固化。

抗-hbe检测卡：将hbeag和sa分别以0.8mg/ml和0.5mg/ml的终浓度均匀分散于含质量浓度为1％海藻糖的缓冲液中，分别均匀的喷涂于硝酸纤维素膜的检测区和质控区，并在37℃条件下烘干固化。

抗-hbc检测卡：将hbcag和sa分别以0.8mg/ml和0.5mg/ml的终浓度均匀分散于含质量浓度为1％海藻糖的缓冲液中，分别均匀的喷涂于硝酸纤维素膜的检测区和质控区，并在37℃条件下烘干固化。

(2)检测卡组装

将吸水纸、硝酸纤维素膜(含检测区和质控区)、滤血膜、样品垫依次搭接(1-2mm)的粘贴于底板，裁切成3-4mm的卡条，装入卡壳中。分别制成hbsag检测卡、hbeag检测卡、抗-hbs检测卡、抗-hbe检测卡、抗-hbc检测卡。

二、荧光微球标记抗体(或抗原)的制备

(1)荧光微球的活化

取50μl初始浓度(固含量即质量-体积浓度)为1％的荧光微球(采购于bangslaboratories,inc.fceu003)，加入至950μlph为6.0的20mmmes缓冲液中，混匀，12000g离心15min。弃上清，上述mes缓冲液重悬至1ml。

分别依次加入10mg/ml的edc和nhs各50μl，室温混匀20min后，12000g离心15min，弃上清，用上述mes缓冲液复溶至1ml，置于2-8℃储存备用。

(2)荧光微球与抗体(或抗原或生物素)偶联

向上述溶液中加入一定量的抗体(抗原或生物素)，使抗体/抗原的终浓度为100μg/ml，生物素的终浓度为200μg/ml。室温混匀2小时。

(3)终止偶联

向偶联体系中加入终止液bsa，使其终浓度(质量浓度)为1％，室温连续混匀1小后，12000g离心15min，弃上清，用含蔗糖质量浓度为8％，海藻糖质量浓度为2％以及体积浓度为为0.05％的procline的ph为6.0的20mmmes缓冲液，将沉淀物重悬至1ml，得到荧光微球标记抗体(抗原或生物素)的浓储液。

(4)工作液的配制

配制含bsa的质量浓度为0.5％、蔗糖的质量浓度为0.3％、海藻糖的质量浓度为0.2％、procline的体积浓度为0.05％、tween-20体积浓度为0.05％的ph为7.4的pbs缓冲液。

各抗原抗体标记得到的荧光微球浓储分别与生物素标记的荧光微球浓储按体积比1：1混合，并用上述bsa的质量浓度为0.5％、蔗糖的质量浓度为0.3％、海藻糖的质量浓度为0.2％、procline的体积浓度为0.05％、tween-20体积浓度为0.05％的ph为7.4的pbs缓冲液作为稀释液，将得到的含抗原抗体标记荧光微球与生物素标记荧光微球体积比为1：1的混合浓储液，按照混合浓储液与稀释液体积比为1：200进行稀释，得到微球工作液，按100μl/支分装，或置于一个试剂瓶中储存，待使用前分装成100μl/支用于检测。

本发明试剂盒的使用方法

所有检测组份与待检样本置于室温下，平衡至室温。

使用时，取上述制备好的检测卡与荧光微球工作液，将25μl待检样本加入到上述配制并分装为100μl的工作液中，混匀后向检测卡加样孔中加入混合样本100μl。15min后，将检测卡插入荧光免疫分析仪，进行检测。读取检测结果。检测120例标本结果与已经取得注册证的博奥赛斯(天津)生物科技有限公司生产的乙肝5项的磁微粒化学发光试剂盒检测结果进行比对。

分析其灵敏度、特异性以及测试相关性。

灵敏度＝a/(a+c)×100％；

特异性＝d/(b+d)×100％；

统计结果如下：

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。