一种检测猪尿液中氟苯尼考及代谢物氟苯尼考胺的方法与流程

本发明属于兽药残留检测领域，具体涉及一种检测猪尿液中氟苯尼考及代谢物氟苯尼考胺的方法。

背景技术：

氟苯尼考具有广谱、高效、低毒的优点，在我国广泛用于防治猪呼吸道感染。然而，不合理的使用可能导致治疗失败，诱导耐药性的生成，缩短氟苯尼考的使用寿命；也可能导致猪可食性组织中氟苯尼考及其代谢物残留超过最大残留限量，危害消费者健康和养殖业的可持续发展。为确保防治效果，避免因为滥用氟苯尼考带来的食品安全问题，制定合理的给药方案至关重要。

氟苯尼考在猪体内的清除与其抗菌效果和组织残留密切相关，是临床制定给药方案的重要依据。药动学研究表明：①氟苯尼考在猪体内可被代谢成没有抗菌活性的氟苯尼考醇、氟苯尼考草酸、单氯氟苯尼考和氟苯尼考胺等代谢物；②氟苯尼考胺在猪可食性组织中残留量较大，被指定为氟苯尼考的残留标志物；③氟苯尼考和氟苯尼考胺主要通过肾脏随尿液排除体外。测定猪尿液中氟苯尼考及氟苯尼考胺的浓度可反映出给药后氟苯尼考从猪体内的清除情况，为制定合理的给药方案提供参考。

截至目前，能够同时检测尿液中氟苯尼考和氟苯尼考胺的分析方法仅有两篇文献报道。它们分别是chiesa等人建立的同时测定猪尿中多种抗生素的液相色谱-串联质谱法和李建成建立的测定猪尿液中氟苯尼考和氟苯尼考胺的高效液相色谱法。尿液中含有大量的内源性干扰物。它们中的一些能够随氟苯尼考和氟苯尼考胺被共萃取，从而出现在待检测的样品中。这些共萃取的内源性干扰物往往有紫外吸收。它们在待测样品中的存在将严重干扰色谱分析。因此，chiesa等人选择了特异性和灵敏度更好的液相色谱-串联质谱仪来分析样品，而在李建成建立的液相色谱法中则采用了选择性较高的watersoasismcx固相萃取小柱对尿液提取物进行净化。液相色谱-串联质谱法的检测成本较高，同时分析仪器在各实验室的普及率较低。固相萃取技术(包括watersoasismcx固相萃取小柱在内)的样品净化效果往往并不令人满意，而且价格较为昂贵，在净化过程中消耗的有机溶剂也较多。薄层色谱是一种经典的色谱分离技术。它具有分离效果好、价格便宜，有机溶剂用量少的优点。将薄层色谱与高效液相色谱法结合，用于尿液中氟苯尼考和氟苯尼考胺的分析，将有望解决上述两种方法的不足。

对于高效液相色谱法而言，样品的前处理程序至关重要。采用什么样的样品前处理方案取决于目标化合物自身的理化性质和样品基质的特点。yang等人建立了氟苯尼考在动物饲料中的高效液相色谱法，wang等人建立了甲砜霉素在动物饲料中的高效液相色谱法。这两种方法以乙酸乙酯提取动物饲料中的氟苯尼考和甲砜霉素，提取液经过直接浓缩后以薄层色谱法净化，所得样品再经液相色谱检测。由于样品基质存在较大差异，氟苯尼考胺的理化性质也与氟苯尼考和甲砜霉素完全不同，这样的提取、净化步骤和色谱分析条件并不一定适合分析猪尿液中的氟苯尼考和氟苯尼考胺。比如氟苯尼考和甲砜霉素易溶于乙酸乙酯，而氟苯尼考胺则更易溶于中性和酸性水溶液，为了保证提取回收率，提取方案必然与上述文献不同；又比如zhang等人研究报道氟苯尼考胺在直接浓缩时可能大量丢失，在浓缩步骤需要采取与yang等人和wang等人不同的处理方法；再比如氟苯尼考胺侧链含有伯胺基，可能与硅胶上的硅醇基发生较强的吸附，其在薄层色谱板上色谱行为氟苯尼考和甲砜霉素完全不同，在液相色谱分析时也可能出现过色谱峰拖尾等现象。这些差异的存在显著增加了筛选最佳样品前处理程序的难度。

技术实现要素：

本发明旨在弥补现有检测技术的缺点与不足，在样品的提取及净化方面进行了改进，弥补了高效液相色谱仪匹配的检测器在特异性上的不足，提供一种更为可靠、便宜、简便的能同时检测猪尿液中氟苯尼考和氟苯尼考胺的方法。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

第一方面，提供一种检测猪尿液中氟苯尼考及代谢物氟苯尼考胺的方法，包括以下步骤：

(1)准确称取新鲜猪尿液，加入氢氧化钠溶液，涡旋；其中，氢氧化钠溶液的终摩尔浓度为0.5-5n，氢氧化钠溶液和尿液的体积比为(0.01-0.1):(0.5-5)；

(2)在碱化后的尿液中加入乙酸乙酯，涡旋，离心，转移乙酸乙酯至另一干净离心管内；其中，碱化后的尿液与乙酸乙酯的体积比为(0.5-5):(5-50)；

(3)用等量乙酸乙酯重复上述操作一次，合并乙酸乙酯；

(4)分批次转移乙酸乙酯至含适量冰乙酸溶液的离心管内，空气流挥干乙酸乙酯；其中，冰乙酸溶液的体积百分比浓度为1％-10％，体积为0.2-1ml；

(5)剩余的冰乙酸溶液涡旋，离心，用空气流吹至体积约0.1ml；

(6)将上述冰乙酸溶液、氟苯尼考和氟苯尼考胺混合标准品分别点样于同一块gf-254硅胶薄层板的不同位置，于体积比二氯甲烷:丙酮:氨水等于(1-6):(4-9):(0.05-0.5)的混合液展开至顶端；所述氨水的体积百分比浓度为25％-28％；

(7)将gf-254硅胶薄层板取出，待溶剂挥干后于254-360nm下检视，根据氟苯尼考和氟苯尼考胺标准品的展开距离标记尿液提取液中氟苯尼考和氟苯尼考胺的大致位置，刮取对应位置的硅胶；

(8)于刮取的硅胶中加入乙腈-冰乙酸混合溶液0.5-5ml，涡旋，离心，取上清，通过滤膜过滤；其中，乙腈-冰乙酸混合溶液中冰乙酸的体积百分比浓度为1％-10％，乙睛与冰乙酸溶液的体积比为30:70-70:30；

(9)将过滤后的样品通过高效液相色谱检测氟苯尼考胺的含量；其中，高效液相色谱流动相为乙腈与磷酸盐缓冲液按体积比为30:70-70:30组成的混合液；磷酸盐缓冲液中含有质量百分比浓度为3％-10％的十二烷基磺酸钠，1％-4％二水磷酸氢二钠，体积百分比浓度为0.05％-2％的三乙胺和体积百分比浓度为83％-98％磷酸。

优选的，步骤(1)中：涡旋的时间为1-3min。

优选的，步骤(2)中：涡旋的时间为1-3min；离心的条件为3000-8000g离心5-10min。

优选的，步骤(4)中：空气流挥干的温度为35-60℃。

优选的，步骤(5)中：涡旋的时间为1-3min；离心的条件为3000-8000g离心5-10min，空气流挥干的温度为35-60℃。

优选的，步骤(8)中：涡旋的时间为1-3min；离心的条件为3000-8000g离心5-10min。

优选的，步骤(8)中：滤膜为0.22μm有机相滤膜。

优选的，步骤(9)中高效液相色谱的条件为：色谱分离在waterssymmetryc18色谱柱(250mm×4.6mmi.d，5μm)内完成，柱温为32-40℃，流速为0.5-1ml/min，检测波长为220-230nm。

更优选的，所述的一种检测猪尿液中氟苯尼考及代谢物氟苯尼考胺的方法，包括以下步骤：

(1)准确量取新鲜猪尿液0.5-5ml,加入0.5-5n的氢氧化钠溶液0.01-0.1ml，涡旋1-3min。

(2)在碱化后的尿液中加入乙酸乙酯5-50ml，涡旋1-3min，3000-8000g离心5-10min，转移乙酸乙酯至另一干净离心管内。

(3)用等量乙酸乙酯重复上述操作一次，合并乙酸乙酯。

(4)分批次转移乙酸乙酯至含1％-10％的冰乙酸溶液0.2-1ml的离心管内，35-60℃空气流挥干乙酸乙酯。

(5)剩余的冰乙酸溶液涡旋1-3min，3000-8000g离心5-10min，35-60℃空气流吹至体积约0.1ml。

(6)将上述冰乙酸溶液、氟苯尼考和氟苯尼考胺混合标准品分别点样于同一块gf-254硅胶薄层板的不同位置，于体积比二氯甲烷:丙酮:氨水等于(1-6):(4-9):(0.05-0.5)的混合液展开至顶端。

(7)将gf-254硅胶薄层板取出，待溶剂挥干后于254-360nm下检视，根据氟苯尼考和氟苯尼考胺标准品的展开距离标记组织提取液中氟苯尼考和氟苯尼考胺的大致位置，刮取对应位置的硅胶。

(8)于硅胶中加入体积比乙睛:冰乙酸溶液(1％-10％)为30:70-70:30的混合液0.5-5ml，涡旋1-3min，3000-8000g离心5-10min，取上清，用0.22μm有机滤膜过滤。

(9)过滤后的样品通过高效液相色谱检测氟苯尼考和氟苯尼考胺的量。

第二方面，提供一种薄层色谱分离猪尿液中氟苯尼考及代谢物氟苯尼考胺的方法，包括上述方法的步骤(1)-(8)。

第三方面，提供上述检测猪尿液中氟苯尼考及代谢物氟苯尼考胺的方法在检测猪尿液中氟苯尼考及代谢物氟苯尼考胺的应用。

上述方法中，猪尿液中氟苯尼考和氟苯尼考胺的浓度由标准曲线进行定量，具体为：称取含5-20mg氟苯尼考和氟苯尼考胺的标准品加到10ml容量瓶中，用乙睛溶解、定容、摇匀，备用；取供试标品，以流动相逐级稀释成系列浓度，每浓度标品以10-50μl进样，重复三次，以氟苯尼考或氟苯尼考胺浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，得到氟苯尼考的回归方程y＝143064x-1045.3和氟苯尼考胺的回归方程y＝275826x+1888.8，其中x为氟苯尼考或氟苯尼考胺浓度，y为峰面积；将所测样品经高效液相色谱检测到的氟苯尼考或氟苯尼考胺峰面积带入上述线性方程，经计算即可得到猪尿液中氟苯尼考或氟苯尼考胺残留浓度。

本发明具有如下优点和有益效果：本发明在适当的碱性环境下以乙酸乙酯从尿液中提取氟苯尼考和氟苯尼考胺，在去除尿液中大量酸性干扰物的同时获得了令人满意的提取回收率；在乙酸乙酯提取液中加入适量冰乙酸溶液，避免了浓缩时氟苯尼考胺的丢失；尿液提取物经薄层色谱净化，去除了大量干扰液相色谱测定的内源性干扰物，保证了良好的特异性，大幅降低了检测成本，减少了有机溶剂的用量，弥补了高效液相色谱仪匹配的检测器在特异性上的不足，拓宽了高效液相色谱法在临床药代动力学中的应用。定量分析结果可靠，适用于基层检测单位对猪尿液中氟苯尼考及代谢物氟苯尼考胺进行日常监控。

附图说明

图1是实施例1中各种样品净化技术处理空白猪肌肉的净化效果比较。其中，(a)为氟苯尼考和氟苯尼考胺标准物质(1μg/ml)，(b)为空白猪尿液提取液直接分析的色谱图，(c)为空白猪尿液提取液经过固相萃取净化后的的色谱图，(d)为空白猪尿液提取液经过薄层色谱净化后的的色谱图。由图可知，空白猪尿液提取液经过薄层色谱净化后在氟苯尼考和氟苯尼考胺保留时间附近无杂质峰，方法特异性好。

图2是实施例2中不同样品的色谱图，其中，(a)为氟苯尼考和氟苯尼考胺标准物质(1μg/ml)，(b)为空白猪尿液，(c)为添加0.25μg/ml的氟苯尼考和氟苯尼考胺的猪尿液，(d)为添加0.5μg/ml的氟苯尼考和氟苯尼考胺的猪尿液，(e)为添加1μg/ml的氟苯尼考和氟苯尼考胺的猪尿液。

具体实施方式

通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。

实施例1各种样品净化技术净化效果的比较

一、方法

(1)准确量取新鲜空白猪尿液2ml，加入2.5n的氢氧化钠溶液0.06ml，涡旋1min。

(2)在碱化后的尿液中加入乙酸乙酯8ml，涡旋2min，5000g离心5min，转移乙酸乙酯至另一干净离心管内。

(3)用等量乙酸乙酯重复上述操作一次，合并乙酸乙酯。

(4)分批次转移乙酸乙酯至含5％的冰乙酸溶液0.6ml的离心管内，50℃空气流挥干乙酸乙酯。

(5)剩余的冰乙酸溶液分别按照以下三种方式处理(每种方式重复5个样品)：①不净化，将冰乙酸溶液于45℃空气流吹干，加入流动相1ml复溶残渣，过0.22μm有机滤膜，待测；②以固相萃取净化，向剩余冰乙酸溶液中加入5％冰乙酸溶液1.5ml，涡旋2min，加入已经平衡好的watersoasismcx固相萃取小柱(60mg,3ml)，然后用5％冰乙酸溶液2ml洗涤，最后用体积比为10:90的氨水-甲醇混合溶液2ml洗脱，洗脱液于45℃空气流吹干，加入流动相1ml复溶残渣，过0.22μm有机滤膜，待测；③以薄层色谱净化，剩余冰乙酸溶液于50℃空气流吹至体积约0.1ml。然后将上述冰乙酸溶液和氟苯尼考和氟苯尼考胺混合标准品分别点样于同一块gf-254硅胶薄层板的不同位置，于体积比二氯甲烷:丙酮:氨水等于5:5:0.25的混合液展开至顶端。将gf-254硅胶薄层板取出，待溶剂挥干后于254nm下检视，根据氟苯尼考和氟苯尼考胺标准品的展开距离标记组织提取液中氟苯尼考和氟苯尼考胺的大致位置，刮取对应位置的硅胶。于硅胶中加入体积比乙睛:冰乙酸溶液(5％)为30:70的混合液1ml，涡旋2min，8000g离心5min，取上清，用0.22μm有机滤膜过滤，待测。

(6)上述样品在waters1525高效液相色谱系统中检测，该系统包括1525二元泵、2489uv检测器和2707自动进样器。色谱分离在waterssymmetryc18色谱柱(250mm×4.6mmi.d，5μm)内完成，柱温为38℃；流动相为乙腈与磷酸盐缓冲液(每500ml磷酸盐缓冲液含0.34g十二烷基磺酸钠、0.78g二水磷酸氢二钠、0.5ml磷酸、0.5ml三乙胺)按体积比为33.3:66.7组成的混合液，流速为0.6ml/min，流动相中的乙睛为色谱纯、水为纯化水；检测波长为225nm。

二、结果

按照上述样品前处理程序处理空白猪尿液，所得典型色谱图如图1所示。结果表明：在上述色谱条件下氟苯尼考和氟苯尼考胺标准物质保留时间分别为9.146min和10.767min，峰型尖锐对称；空白猪尿液的提取液不经过固相萃取或薄层色谱净化直接分析，在氟苯尼考和氟苯尼考胺保留时间附近有杂质峰，方法特异性差，无法准确定量尿液中的氟苯尼考和氟苯尼考胺；空白猪尿液的提取液经过固相萃取净化后分析，在氟苯尼考保留时间附近仍然一定干扰；空白猪尿液的提取液经过薄层色谱净化后分析，在氟苯尼考和氟苯尼考胺保留时间附近无杂质干扰，方法特异性好，可以准确定量猪尿液中的氟苯尼考和氟苯尼考胺。

实施例2猪尿液中氟苯尼考和氟苯尼考胺的准确度和精确度试验

一、方法

(1)准确量取猪尿液2ml，在其中加入0.25、0.5和1μg/ml的氟苯尼考和氟苯尼考胺，每个浓度重复5个样品，连续重复三批。

(3)按照实施例1所示的提取、浓缩和薄层色谱净化程序处理上述样品，并按照实施例1所示的色谱条件分析。氟苯尼考和氟苯尼考胺采用标准曲线进行定量，通过高效液相色谱检测系列浓度氟苯尼考胺标准品，以氟苯尼考胺浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，得到氟苯尼考的回归方程y＝143064x-1045.3和氟苯尼考胺的回归方程y＝275826x+1888.8，其中x为氟苯尼考或氟苯尼考胺浓度，y为峰面积；将所测样品经高效液相色谱检测到的氟苯尼考或氟苯尼考胺峰面积带入上述线性方程，经计算即可得到猪尿液中氟苯尼考或氟苯尼考胺残留浓度。

二、结果

方法检测猪尿液中氟苯尼考和氟苯尼考胺的典型色谱图如图2所示，测得氟苯尼考和氟苯尼考胺的平均回收率为86.62-110.78％，日内相对标准偏差小于11.74％，日间相对标准偏差小于8.75％。准确度和精确度试验结果如表1所示。

表1猪尿中方法的准确度和精确度结果

以上结果表明，本发明的检测方法具有较高的准确度和精确度，可用于猪尿液中氟苯尼考和氟苯尼考胺的测定。

以上所述的实施例对本发明的技术方案和有益效果进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充和等同替换等，均应包含在本发明的保护范围之内。