一种检测ATP的电化学传感器及其制备方法与流程

文档序号：17351586发布日期：2019-04-09 21:13阅读：571来源：国知局

本发明涉及电化学传感器技术领域，特别涉及基于邻近诱导链置换和分支hcr检测atp的电化学传感器，还涉及其制备方法。

背景技术：

三磷酸腺苷（atp），细胞中最重要的能量来源，在细胞内新陈代谢、合成和生物化学过程中起着重要作用。值得注意的是，atp能够指示许多人类疾病。典型的，异常的atp浓度与一些疾病例如帕金森、低血糖、组织缺氧、局部缺血、心血管病等有着很大的关联。因此，构建一种有效的能够检测痕量atp的分析方法是很迫切而且重要的。

目前，常用的atp检测方法包括质谱，高效液相色谱等，这些方法往往存在仪器昂贵、分析周期长、样品预处理复杂、检测费用昂贵等问题，已经难以适应atp检测方便、快捷、灵敏度等方面的要求。因此，急需建立一种快速，准确，灵敏且高特异性的方法检测痕量atp。

技术实现要素：

为了解决以上现有技术中检测atp的方法特异性和灵敏度都比较低、成本高的问题，本发明提供了一种特异性和灵敏度高、成本低、检测速度快的基于邻近诱导链置换和分支hcr检测atp的电化学传感器。同时还提供了基于邻近诱导链置换和分支hcr检测atp的电化学传感器制备方法。

一种检测atp的电化学传感器，在电极上依次修饰有cp-sh层、ap层、hp1-hp2-hp3-hp4层、[ru(nh3)6]³⁺层；

所述的ap层由均相ap溶液反应获得，原料包括apt-1、apt-2、ap-tp杂交双链、fp以及待测目标物；

所述的cp-sh为cphp1的5’端修饰有巯基；

所述的碱基序列如下：

apt-1序列如seqno.1所示；

apt-2序列如seqno.2所示；

tp序列如seqno.3所示；

ap序列如seqno.4所示；

fp序列如seqno.5所示；

hp1序列如seqno.6所示；

hp2序列如seqno.7所示；

hp3序列如seqno.8所示；

hp4序列如seqno.9所示；

cp-sh序列如seqno.10所示。

所述的电化学传感器中hp1-hp2-hp3-hp4层中hp1、hp2、hp3、hp4的摩尔比为1：1：1：1。

所述的电化学传感器的制备方法，包括以下步骤：

（1）对电极进行预处理；

（2）将cp-sh层修饰到电极表面；

（3）将ap层修饰到电极表面；

（4）将hp1-hp2-hp3-hp4层修饰到电极表面；

（5）将[ru(nh3)6]³⁺层修饰到电极表面；

（6）电化学传感器检测atp。

所述的步骤（2）将cp-sh层修饰到电极表面的操作步骤如下：

将1μmcp-sh滴加10μl到经过预处理的电极表面，在37℃下孵育2h，清洗。

所述的步骤（3）将ap层修饰到电极表面的操作步骤如下：

s1将1xpbs缓冲液，1μmapt-1，1μmapt-2，1μmap-tp杂交双链，1μmfp和待测目标物各2μl、灭菌水8μl加入离心管中，震荡30s，放入37℃的恒温箱中孵育2h；

s2将孵育好的混合溶液滴加到修饰好cp-sh层的电极上，将电极继续放在37℃的恒温箱中孵育2h，清洗。

所述的步骤（4）将hp1-hp2-hp3-hp4层修饰到电极表面的操作步骤如下：

将1xpbs缓冲液，1μmhp1，1μmhp2，1μmhp3，1μmhp4各2μl加入离心管中，震荡30s，滴加到修饰ap-cp-sh层电极上，将电极继续于37℃的恒温箱中孵育2h，清洗。

所述的步骤（5）将[ru(nh3)6]³⁺层修饰到电极表面的操作步骤如下：

将10μl50μm[ru(nh3)6]³⁺滴加到第（4）步反应完成电极上，将电极继续放在37℃的恒温箱中孵育10min，清洗。

所述的步骤（1）对电极进行预处理操作为电极在0.3µm和0.05µm的氧化铝浆中进行抛光处理，直到呈镜面，用pbs和二次水冲洗。

所述的步骤（1）的电极为金电极。

所述的步骤（6）的检测条件：以ag/agcl为参比电极，以pt电极为对电极，电位设置为0到-0.5v，脉冲宽度0.05v，扫描速率为0.06s，采用差分脉冲伏安法读取电信号的变化，检测待测目标物。

其中：pbs缓冲液是由传统方法配制：na2hpo4(10mm)，nah2po4(10mm)，nacl(140mm)，kcl(1mm)，mgcl2(1mm)，cacl2(1mm)，最终溶液的ph值为7.4。并且，配置的pbs缓冲液与超纯水均需进行高温灭菌处理。具体方法是，将pbs和超纯水分别放置在不同的锥形瓶中，然后用锡箔纸和报纸进行封口。在高压灭菌锅中120℃的温度下灭菌20min。

该发明的检测方式是电化学检测，利用传统的三电极体系。ag/agcl为参比电极，铂丝为对电极，修饰的金电极为工作电极。在检测之前，先通过au-s键将cp-sh固定到电极表面。将反应后的均相ap溶液修饰到电极表面，然后37℃孵育2h使ap打开cp-sh。再滴加hp1-hp2-hp3-hp4溶液37℃孵育2h形成分支hcr。加入[ru(nh3)6]³⁺后，继续孵育10min。然后用三电极工作体系检测信号峰。电位设置为0到-0.5v，脉冲宽度0.05v，扫描速率为0.06s，采用差分脉冲伏安法读取电信号的变化，检测待测目标物。

本发明一共用到了10条dna链，其序列分别是：

apt-1:5’-acctgggggagtatataagcaccacatctcat-3’

apt-2:5’-ccttatgctgcttatttgcggaggaaggt-3’

tp:5’-cagtatgagatgtggtagccagtatgagatgtggtagcataagg-3’

ap:5’-aatagctaccacatctcatactg-3’

fp:5’-gctaccacatctcatactggctaccacatctcatactg-3’

hp1:5’-cagtatgagatgtggtaggcttagttaacgtcgtctctaccacatctc-3’

hp2:5’-ctaccacatctcatactggagatgtggtagagacgatccatc-3’

hp3:5’-ttaacgtccatcagtttcgatggacgttaactaagc-3’

hp4:5’-gaaactgatggacgttaagcttagttaacgtccatc-3’

cp-sh:5’-sh-tttttcagtatgagatgtggtaggcttagttaacgtcgtctctaccacatctc-3’

其中，apt-1与apt-2的单下划线部分为atp劈开的适配体，在atp存在时，其能够拉近apt-1与apt-2，使两部分双下划线序列邻近，共同进入下一步反应。

tp的双下划线和单下划线部分为相同序列，可以同时与ap的单下划线部分杂交形成双链。这部分需要提前杂交好才能加入反应体系。在atp拉近apt-1与apt-2后，拉近的两端可以与tp的斜体部分杂交，置换掉tp上单下划线部分杂交的ap。然后，fp能够与tp的单双下划线部分共同杂交，置换掉tp上双下划线部分的ap以及apt-1-apt-2-atp部分。

ap的单下划线序列能够打开hp1单下划线序列，紧接着打开的hp1的双下划线序列能够打开hp2的双下划线部分，打开的hp2单下划线部分继续打开hp1，形成第一步hcr（杂交链式反应）。而hp1与hp2两个的无下划线部分通过hcr连接在一起能够打开hp3的单下划线部分，打开的hp3双下划线序列又可以打开hp4的双下划线部分，hp4单下划线部分继续打开hp3，形成第二步hcr，即分支hcr部分。

cp-sh的5’端修饰有巯基(-sh)，可以与金电极形成稳定au-s键，从而固定在电极表面；其与hp1具备相同序列，相同作用，sh的修饰是为了使得到的分支hcr部分固定在电极表面。加入三氯六氨合钌[ru(nh3)6]³⁺，其能够在dna链上静电吸附，通过电化学差分脉冲伏安法可以得到明显增强的电信号，我们就是通过检测该信号来达到定量检测目标物的目的。

均相中发生的反应主要有：在有目标物atp存在的情况下，apt-1与apt-2由atp拉近，共同去置换下tp-ap双链中与tp单下划线杂交的ap。加入fp后，fp能够继续置换下与tp双下划线杂交的ap以及apt-1-apt-2-atp部分。apt-1-apt-2-atp继续置换tp-ap，这是第一步循环放大。释放的两部分ap能够打开电极上已经修饰好的cp-sh。加入hp1，hp2，hp3，hp4后，形成ap-hp1-hp2-hp3-hp4分支hcr聚合体，这是第二步信号扩增。加入[ru(nh3)6]³⁺后，其能够在dna链上静电吸附，从而得到明显增强的电信号。在均相反应中，反应条件均为37℃，反应时间是2h。

本发明中atp的检测是在电极上实现的，通过一步循环和一步扩增的方式来实现信号的增大，从而实现atp的高灵敏检测，并获得较低的检测下限。

本发明的有益效果：

1、检测限低

利用适配体的特异性识别实现了对目标物atp的高特异性检测；利用atp对两个适配体的拉近作用，实现了目标物的循环利用，起到了第一步信号增大的作用；利用分支hcr反应，实现了信号的第二步扩增，实现了对目标物的高敏检测，提高了检测的灵敏度；检测限为1pm。

2、检测速度快

检测原理的主要过程均是在电极上实现的，提高了反应速度，降低了操作的复杂程度，实现了目标物的快速，简单，灵敏的检测；该传感器的反应条件温和，反应速度快。

3、可工业化生产

由于使用金电极，其电极简便、小型化、易携带、可多次使用；制备方法简单，性能稳定，电极的重复性好，适用于痕量atp的检测和生物传感器产业化的实际应用；制作电极的工艺成本低，适用于产业化中价廉的要求。

附图说明

图1为该实验的原理图；

图2为实施例1cp-sh浓度优化检测结果图；

图3为实施例2hp1浓度优化检测结果图；

图4为实施例3传感器检测atp的工作曲线。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步说明。

实施例1

一种本发明所述电化学生物传感器的制备方法：

a、金电极首先在0.3和0.05µm的氧化铝浆中进行抛光处理，直到呈镜面，用pbs和二次水反复冲洗；

b、将10μl(0μm，0.5μm，1μm，1.5μm，2μm)的cp-sh滴加到电极表面，在室温下孵育2h，清洗。

至此电极的修饰过程先告一段落，下面介绍一下均相溶液中发生的反应，均相反应中的主要步骤：

a、将1xpbs缓冲液，1μmapt-1，1μmapt-2，1μmap-tp杂交双链，1μmfp和待测目标物各2μl、灭菌水8μl加入离心管中，震荡30s，放入37℃的恒温箱中孵育2h；

b、将a步反应后的溶液(10μl)滴加到预先修饰好cp-sh的电极上。然后将电极继续放在37℃的恒温箱中2h；

c、用磁力搅拌器在pbs溶液中清洗电极，每次10min，共清洗3次；

d、将1xpbs缓冲液，1μmhp1，1μmhp2，1μmhp3，1μmhp4各2μl加入离心管中，震荡30s，滴加到c步反应的电极上，将电极继续放在37℃的恒温箱中孵育2h；

e、用磁力搅拌器在pbs溶液中清洗电极，每次10min，共清洗3次；

f、将10μl50μm[ru(nh3)6]³⁺滴加到e步反应后的电极上，然后将电极继续放在37℃的恒温箱中10min；

g、用磁力搅拌器在pbs溶液中清洗电极，每次10min，共清洗3次。

以ag/agcl为参比电极，以pt电极为对电极，采用差分脉冲伏安法(dpv)进行信号的检测，dpv检测的底液是pbs(10mm，ph为7.4)，电位设置为0到-0.5v，扫描速率为0.06s，脉冲宽度为0.05v。

结果见图2，从图中可以看出，检测到的电流信号随着cp-sh的浓度在0-1μm区间内增大而增大，当浓度超过1μm后，电流趋于稳定，所以cp-sh的最佳浓度为1μm。

实施例2

一种本发明所述电化学生物传感器的制备方法：

a、金电极首先在0.3和0.05µm的氧化铝浆中进行抛光处理，直到呈镜面，用pbs和二次水反复冲洗；

b、将10μl1μm的cp-sh滴加到电极表面，在室温下孵育2h，清洗。

至此电极的修饰过程先告一段落，下面介绍一下均相溶液中发生的反应，均相反应中的主要步骤：

a、将1xpbs缓冲液，1μmapt-1，1μmapt-2，1μmap-tp杂交双链，1μmfp和待测目标物各2μl、灭菌水8μl加入离心管中，震荡30s，放入37℃的恒温箱中孵育2h；

b、将a步反应后的溶液(10μl)滴加到预先修饰好cp-sh的电极上。然后将电极继续放在37℃的恒温箱中2h；

c、用磁力搅拌器在pbs溶液中清洗电极，每次10min，共清洗3次；

d、将1xpbs缓冲液，(0μm，0.5μm，1μm，1.5μm，2μm)hp1，1μmhp2，1μmhp3，1μmhp4各2μl加入离心管中，震荡30s，滴加到c步反应的电极上，将电极继续放在37℃的恒温箱中孵育2h；

e、用磁力搅拌器在pbs溶液中清洗电极，每次10min，共清洗3次；

f、将10μl50μm[ru(nh3)6]³⁺滴加到e步反应后的电极上，然后将电极继续放在37℃的恒温箱中10min；

g、用磁力搅拌器在pbs溶液中清洗电极，每次10min，共清洗3次。

结果见图3，从图中可以看出，检测到的电流信号随着hp1的浓度在0-1μm区间内增大而增大，当浓度超过1μm后，电流趋于稳定，所以hp1的最佳浓度为1μm。此外，由于hp1，hp2，hp3和hp4能够在ap作用下产生分支hcr反应，因此，其浓度比应该是1：1：1：1的关系。即：hp1，hp2，hp3和hp4的最佳浓度都是1μm。

实施例3

一种本发明所述电化学生物传感器的制备方法：

a、金电极首先在0.3和0.05µm的氧化铝浆中进行抛光处理，直到呈镜面，用pbs和二次水反复冲洗；

b、将10μl1μm的cp-sh滴加到电极表面，在室温下孵育2h，清洗。

至此电极的修饰过程先告一段落，下面介绍一下均相溶液中发生的反应，均相反应中的主要步骤：

a、将1xpbs缓冲液，1μmapt-1，1μmapt-2，1μmap-tp杂交双链，1μmfp和待测目标物(0pm，1pm，10pm，100pm，1nm，10nm，100nm，1μm，5μm)各2μl、灭菌水8μl加入离心管中，震荡30s，放入37℃的恒温箱中孵育2h；

b、将a步反应后的溶液(10μl)滴加到预先修饰好cp-sh的电极上。然后将电极继续放在37℃的恒温箱中2h；

c、用磁力搅拌器在pbs溶液中清洗电极，每次10min，共清洗3次；

d、将1xpbs缓冲液，1μmhp1，1μmhp2，1μmhp3，1μmhp4各2μl加入离心管中，震荡30s，滴加到c步反应的电极上，将电极继续放在37℃的恒温箱中孵育2h；

e、用磁力搅拌器在pbs溶液中清洗电极，每次10min，共清洗3次；

f、将10μl50μm[ru(nh3)6]³⁺滴加到e步反应后的电极上，然后将电极继续放在37℃的恒温箱中10min；

g、用磁力搅拌器在pbs溶液中清洗电极，每次10min，共清洗3次。

结果见图4。从图4a中可以看出，检测到的电流信号随着目标物浓度在1pm-1μm区间内增大而增大，图4b显示atp浓度的对数与电流峰值大小呈正比关系，拟合曲线：i=0.83+0.50lg(c/pm)（相关系数是0.95771，其中c代表了atp的浓度），同时，我们在1pm的浓度基础上继续向更低的浓度检测，经检测当浓度低于1pm时，atp浓度的对数与电流峰值大小恰好不再符合拟合曲线规律，即图中的电流峰值最低值。因此，可得到该方法检测下限为1pm。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受实施例的限制，其它任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、组合、替代、简化均应为等效替换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>济南大学

<120>一种检测atp的电化学传感器及其制备方法

<160>10

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>32

<212>dna