一种检测副溶血性弧菌的光电化学生物传感器及其制备方法与流程

本发明属于电化学检测领域，指一种检测副溶血性弧菌的光电化学生物传感器及其制备方法。

背景技术：

副溶血性弧菌(vp)是一种革兰氏阴性嗜盐细菌，是引起腹泻、头痛、呕吐、恶心、腹部痉挛和低发热的人胃肠炎的主要原因。这种细菌已经成为全世界海鲜相关疾病爆发的重要原因，也是海产品中生物安全问题的主要来源。目前用于检测副溶血性弧菌的方法主要有传统方法、pcr、lamp、基因芯片、elisa、upt-lf等方法。以上几种方法有的存在检测速度过慢、成本高、仪器复杂、灵敏度差等缺点。因此，建立相关快速准确的检测方法，对海产品相关安全问题的检测尤为重要。

光电化学分析是一种新型分析技术，由于其高灵敏度、选择性和特异性而被广泛用于设计生物传感器筛选分子标记物、药物、有毒物质、环境污染物等。然而除了以上的优点以外，其廉价性，以及潜在的便携性，决定了其具有重要的研究价值。

技术实现要素：

为解决上述技术问题，本发明结合传感器的快速性，以及免疫反应的准确性，建立了一种用于快速检测副溶血性弧菌的光电化学免疫传感器方法。提出基于稀土元素掺杂tio2并结合cdse量子点修饰的一步无标记的免疫传感器，用于在海水和海鲜中快速和超敏感检测副溶血性弧菌。具有高敏感性、高特异性、检测时间短、成本低廉的优点。

本发明完整的技术方案包括：

一种检测副溶血性弧菌的光电化学生物传感器的制备方法，其步骤如下：

步骤1、制备tm/yb共掺杂tio2纳米粒子

将tm2o3和yb2o3分别溶于浓硝酸中，生成tm和yb的硝酸盐溶液。再将正钛酸四丁酯溶解乙醇中，磁力搅拌下逐渐滴加tm和yb的硝酸盐溶液，将混合均匀的悬浊液转移到反应釜中，200℃保持10小时，收集沉淀物并用蒸馏水和乙醇分别洗涤3次，80℃真空条件下干燥10小时。

步骤2、制备水溶性tga-cdse量子点溶液

取3ml超纯水于10ml试管中，通入高纯氮气3分钟，分别将0.012g、0.020g、0.028g、0.040gse粉和0.036g、0.06g、0.084g、0.12gnabh4依次倒入瓶中，同时停止通氮气，塞上橡胶塞，置于冰浴中，反应一段时间至黑色se粉完全溶解，待反应结束后生成淡黄色澄清溶液，制备前驱体溶液；

将cdcl2·2.5h2o溶于蒸馏水中，磁力搅拌下加入tga，产生沉淀的溶液用naoh调节至澄清，转移到三颈烧瓶中，氮气下充分反应，加入前躯体溶液，继续滴加naoh调节ph值，充分反应后即获得水溶性tga-cdse溶液。

步骤3、构建检测副溶血性弧菌的光电化学生物传感器工作电极

将tm/yb-tio2纳米粒子置于水中超声处理至混合均匀得悬浊液，移取10μl置于fto玻璃上，氮气下干燥，再在450℃马弗炉中煅烧30分钟，冷却至室温滴加8μltga-cdse量子点溶液，氮气下干燥，在干燥后的fto上滴加5μledc/nhs，4℃冰箱充分孕育，滴加anti-vp，继续滴加bsa阻断非特异性，最后滴加含有vp的样品溶液，成功构建工作电极。

步骤4、构建检测副溶血性弧菌的光电化学生物传感器

将上述步骤3所制备的电极作为工作电极，铂丝电极为对电极，饱和甘汞电极为辅助电极，分别置于pbs溶液中构建三电极体系，aa作为电子供体，成功构建检测副溶血性弧菌的光电化学生物传感器，氙灯光源照射进行光电化学分析。

步骤1中，tm离子的掺杂量为1mol％，yb离子的掺杂量分别为2-8mol％。

步骤2中，cd和se离子数目比为1:(0.3-1.5)，ph值范围为9-11，反应时间3-8h。

步骤3中，tm/yb-tio2纳米粒子的浓度范围为2-30mg/ml。

步骤4中，aa浓度为0.1m，pbs溶液ph值为6-10，三电极间距为1cm。

有益效果：本发明制备了cdse量子点和tm/yb-tio2纳米材料修饰fto，构建出光电化学生物传感器用于检测副溶血性弧菌，其优点以及特色如下：

(1)稀土元素tm/yb共掺杂tio2，极大的提高了光电流响应能力。

(2)tm/yb-tio2结合cdse纳米粒子，一方面半导体的复合提升了载流子的数量，另一方面cdse优良的电化学性质，放大了对光电流的响应能力。

(3)通过副溶血性弧菌菌体抗原与其抗体的特异性结合，大大提高了实验的准确性以及特异性。

(4)检测副溶血性弧菌具有速度快、成本低廉、潜在的便携性等优点。

附图说明

图1为本发明传感器工作电极构建过程。

图2为不同比例tm/yb共掺杂tio2的xrd图谱和光电流图，图2(a)为xrd图谱，图2(b)为光电流图。

图3为不同物质修饰到工作电极所引起的电流变化情况比较图。

图4为光电化学传感器的标准曲线。

图5为免疫传感器的特异性实验结果。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明做进一步说明。如图1所示，本发明光电化学适配体传感器工作电极的构建过程，包括在fto电极表面依次修饰稀土掺杂tio2纳米粒子、cdse量子点、nhs/edc、anti-vp、bsa、vp，获得光电化学生物传感器工作电极，具体步骤如下：

步骤1：制备tm/yb掺杂tio2纳米粒子

将0.039gtm2o3溶于10ml浓硝酸中，生成tm³⁺的硝酸盐溶液；分别将0.158g、0.197g、0.236gyb2o3溶于10ml浓硝酸中，生成不同浓度的yb³⁺硝酸盐溶液；取0.02mol正钛酸四丁酯溶解于30ml乙醇中，磁力搅拌下分别逐渐滴加所制备的含有tm³⁺和yb³⁺离子的溶液，将混合均匀的悬浊液转移到反应釜中，200℃保持10小时；收集沉淀物并用蒸馏水和乙醇分别洗涤3次，80℃真空下干燥10小时，即可制得不同配比的tm³⁺/yb³⁺掺杂的tio2纳米粒子(tm³⁺/yb³⁺-tio2)，其中tm³⁺:yb³⁺分别为1:4、1:5、1:6。

图2为不同比例tm/yb共掺杂tio2的xrd图谱和光电流图，图中曲线a为纯tio2，曲线b中tm/yb比例为1:4，曲线c中tm/yb比例为1:5，曲线d的tm/yb比例为1:6，可以看出，稀土掺杂后，特征峰的峰高明显变高，1:5时光电流最大。

步骤2：制备水溶性tga-cdse量子点溶液

取3ml超纯水于10ml试管中，通入高纯氮气3分钟，分别将0.012g、0.020g、0.028g、0.040gse粉和0.036g、0.06g、0.084g、0.12gnabh4依次倒入瓶中，同时停止通氮气，塞上橡胶塞，置于冰浴中，反应一段时间至黑色se粉完全溶解，待反应结束后生成淡黄色澄清溶液，成功制备前驱体溶液；

将1.14gcdcl2·2.5h2o溶于超纯水中，磁力搅拌条件下加入120μl巯基乙酸(tga)，溶液立即产生沉淀，用1mnaoh调节ph值至11，转移到三颈烧瓶中，氮气下30℃加热1小时，迅速加入上述前驱体溶液，反应温度30℃，充分反应1小时，即获得水溶性tga-cdse溶液。

步骤3：构建检测副溶血性弧菌的光电化学生物传感器工作电极

称取步骤1所制备的tm³⁺/yb³⁺-tio2纳米粒子置于10ml超纯水中超声处理至悬浊液混合均匀，移取10μl置于fto导电玻璃上，氮气下干燥，再在450℃马弗炉中煅烧30分钟，冷却至室温滴加8μl步骤2所制备的水溶性tga-cdse量子点溶液，氮气下干燥30min，超纯水清洗电极表面，在干燥后的fto上滴加10μl酶混液，4℃冰箱放置，直至干燥，工作电极被成功构建，具体步骤如下：

(1)将宽1cm长2cm的fto玻璃，依次在丙酮、水和乙醇混合液、水中超声清洗15min，清洗干净后放于烘箱中烘干；

(2)取tm³⁺:yb³⁺为1:4的tm³⁺/yb³⁺-tio2纳米粒子于10ml水中，其中tm³⁺/yb³⁺-tio2纳米粒子分别为0.05g、0.1g、0.15g、0.2g，使tm³⁺/yb³⁺-tio2纳米粒子的浓度分别为5mg/ml、10mg/ml、15mg/ml、20mg/ml，直至悬浊液混合均匀，移取10μl置于fto玻璃上，氮气下干燥，再在450℃马弗炉中煅烧30分钟，冷却至室温；

(3)取8μltga-cdse量子点溶液于上述tm³⁺/yb³⁺-tio2纳米粒子膜表面，氮气下干燥30分钟，并用超纯水清洗电极表面；

(4)干燥后的fto玻璃上继续滴加5μlnhs/edc溶液，移至4℃冰箱内充分反应5小时；

(5)取出用双蒸水淋洗，洗去多余nhs/edc，再滴加5μlanti-vp，移至4℃冰箱内充分反应2小时；

(6)取出用双蒸水淋洗，洗去多余anti-vp，再滴加bsa，用以阻断非特异性吸附，并移至4℃冰箱内充分反应。

(7)滴加不同稀释度的vp溶液，光电化学免疫传感器工作电极构建完成。

光电化学免疫传感器灵敏性检测

将所制备的光电化学生物传感器用于副溶血性弧菌的灵敏性检测，步骤如下：

(1)配制不同浓度梯度的副溶血性弧菌菌液；浓度分别为100cfu/ml、10³cfu/ml、10⁴cfu/ml、10⁵cfu/ml、10⁶cfu/ml、10⁷cfu/ml、10⁸cfu/ml、10⁹cfu/ml。

(2)取步骤(1)所配制的副溶血性弧菌菌液滴加至工作电极表面；

(3)将所制备的电极(tm³⁺/yb³⁺-tio2纳米粒子的浓度为5mg/ml)作为工作电极，铂丝电极为对电极，饱和甘汞电极为辅助电极，分别置于上述步骤4获得的pbs溶液中构建三电极体系，ph＝7，加入0.1maa，氙灯光源照射进行光电化学分析，i-t图像为实验依据，如图3所示，a为裸fto电极，b为修饰稀土掺杂tio2后电极，c为修饰了cdse后电极，d为修饰了nhs/edc后电极，e为修饰了anti-vp后电极，f为修饰了bsa后电极，g为修饰了vp后电极，绘制标准曲线，如图4所示，其中图4(a)为滴加不同稀释度的vp溶液测得的光电流，图4(b)为拟合标准曲线图；得到线性关系公式为y＝4×10^-6x+10^-5r²＝0.9941；因此副溶血性弧菌的线性检测范围为10²cfu/ml-10⁹cfu/ml，检测限为25cfu/ml。

特异性实验

将所制备的光电化学免疫传感器用于特异性实验：将步骤3的步骤(7)的滴加副溶血性弧菌，分别改为滴加无菌水、大肠杆菌、单增李斯特菌液、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌菌液，如图5所示，图中图例自左向右分别为：a为副溶血性弧菌，b为无菌水，c为大肠杆菌，d单增李斯特菌，e为沙门氏菌，f为金黄色葡萄球菌。实验结果表明，除了副溶血性弧菌以外，其他菌液不会对光电流产生明显变化。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效结构变化，均仍属于本发明技术方案的保护范围内。