一种比率型广谱性光电免疫传感器的制备方法与流程

本发明涉及传感器技术领域，更具体地，涉及一种比率型广谱性光电免疫传感器的制备方法。

背景技术：

免疫传感器的信号检测是灵敏度的重要保障，常用手段是基于光、电、光电、质量等的单信号放大。但是，无论“signaloff”或“signalon”单信号检测有不确定性，如基底材料形貌、生物负载量存在批间差异性；检测本身涉及的化学反应存在假阳性等。

食品安全关乎公众身体健康和生命安全。我国是以农业生产为主的国家，农作物在生长、储存以及运输中都可能受到真菌毒素的污染，造成巨大经济损失。赭曲霉毒素(ochratoxins)是继黄曲霉毒素后又一个引起世界广泛关注的真菌毒素，主要有赭曲霉毒素a(ota)、赭曲霉毒素b(otb)和赭曲霉毒素c(otc)、ota-甲基酯、otb-甲基酯等。欧盟规定在未加工的谷物中，ota限量为5μg/kg，甚至规定牛奶、奶粉中ota限量为零，我国对食品中ota限量也为5μg/kg。

到目前为止，没有对otb和otc的限量规定，但是，并不代表otb与otc不值得我们重视。otb是ota的脱氯衍生物，otc是ota的乙基酯化物，在被污染的食物和动物饲料中，三者普遍共同存在。而且，otb和otc具有类似ota的毒性，甚至otc在免疫调节毒性和细胞毒性方面更强；otc、otb、ota之间存在相互转换。因此，如果只是单一地检测ota，赭曲霉毒素的总摄入量会被低估，容易造成食品安全事故。为了准确地评估赭曲霉毒素的毒性，发展快速、准确、灵敏的检测赭曲霉毒素技术具有重要意义。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题在于提供一种比率型广谱性光电免疫传感器的制备方法。

本发明另一要解决的技术问题在于提供上述方法制备的比率型广谱性光电免疫传感器。

本发明还一要解决的技术问题在于提供一种采用上述比率型广谱性光电免疫传感器的同时检测三种赭曲霉毒素含量的方法。

本发明目的通过以下技术方案予以实现：

提供一种比率型广谱性光电免疫传感器的制备方法，包括以下步骤：

s1.制备cds/mos2纳米复合材料修饰的fto：先在fto导电玻璃上合成片状mos2纳米片，得到mos2纳米片修饰的fto，然后在mos2纳米片上负载cds纳米颗粒，得到cds/mos2纳米复合材料修饰的fto；

s2.制备负载二抗的zns-ag2s@ab2溶液：先合成zns-ag2s纳米材料溶液，然后在zns-ag2s纳米材料上的修饰二抗ab2，得到zns-ag2s@ab2溶液；

s3.构建传感器：采用步骤s1所得的cds/mos2纳米复合材料修饰的fto，依次结合抗原、封闭剂、抗体，最后结合步骤s2所得的zns-ag2s@ab2溶液，构建比率型广谱性光电免疫传感器。

更具体地，步骤s1所述在fto导电玻璃上合成片状mos2纳米片的具体操作为：将na2moo4·2h2o和l-半胱氨酸加入到水和氨水的混合溶液中得混合溶液a；将fto与混合溶液a加入反应釜，水热反应后，洗涤、干燥，得到mos2纳米片修饰的fto。

更具体地，步骤s1所述在mos2纳米片上负载cds纳米颗粒的具体操作为：将cdcl2、nh4cl、硫脲、氨水加入到蒸馏水中加热，得溶液b；再将mos2纳米片修饰的fto加入溶液b中反应，洗涤、干燥，得到cds/mos2纳米复合材料修饰的fto。

更进一步地，将45mg的na2moo4·2h2o和100mg的l-半胱氨酸加入到15ml的水和氨水的混合溶液中混合溶液a，其中，控制水和氨水的体积比为2:1；将fto与混合溶液a加入反应釜，200℃下水热反应24小时，洗涤、干燥，得mos2纳米片修饰的fto；再将0.0013molcdcl2、0.0076molnh4cl、0.18mol硫脲、25.84ml氨水加入到500ml蒸馏水中加热到80℃，得溶液b；再将mos2纳米片修饰的fto加入溶液b中，反应5min；洗涤、干燥，得cds/mos2纳米复合材料修饰的fto。

更具体地，步骤s2所述制备负载二抗的zns-ag2s@ab2溶液的具体操作为：将zn(ac)2和l-半胱氨酸加入乙二醇和水的混合溶液中，水热反应，离心洗涤，分散在甲醇溶液中，得zns的甲醇溶液；将agno3溶液滴加到zns的甲醇溶液中搅拌，离心洗涤后分散在水中，得到zns-ag2s纳米材料溶液；在zns-ag2s纳米材料溶液中加入巯基乙酸，室温下搅拌，离心洗涤后，分散在edc/nhs溶液中活化，得混合溶液c；将混合溶液c再次离心洗涤后，分散在pbs溶液中，加入二抗ab2反应，制得溶解在pbs中的zns-ag2s@ab2溶液。

更进一步地，将zn(ac)2和l-半胱氨酸加入乙二醇和水的混合溶液中，水热反应，离心洗涤，产物分散在甲醇溶液中，得zns的甲醇溶液；将agno3溶液滴加到zns的甲醇溶液中搅拌，离心洗涤后分散在水中，得zns-ag2s纳米材料溶液；在zns-ag2s纳米材料溶液中加入巯基乙酸，室温下搅拌，离心洗涤后，分散在edc/nhs溶液中活化，得混合溶液c；将混合溶液c再次离心洗涤后，分散在pbs溶液中，加入二抗ab2反应，制得溶解在pbs中的zns-ag2s@ab2溶液。

优选地，所述乙二醇和水的混合溶液中乙二醇和水的比例为1:4。

更具体地，步骤s3的具体操作为：将cds/mos2纳米复合材料修饰的fto在半胱氨酸盐酸盐溶液中浸泡，在电极表面上修饰羧基，洗涤后滴加edc/nhs溶液活化羧基，再滴加抗原溶液孵化；经过pbs溶液冲洗、氮气吹干后滴加封闭剂反应，然后滴加抗体溶液反应，洗涤吹干，最后滴加zns-ag2s@ab2溶液，洗涤吹干。

更进一步地，将cds/mos2纳米复合材料修饰的fto在半胱氨酸盐酸盐溶液中浸泡6小时，在电极表面上修饰羧基，洗涤后继续滴加20μl的edc/nhs溶液活化羧基，其中，edc的浓度为20mg·ml^-1，nhs的浓度为10mg·ml^-1；1小时后再滴加20μl的溶解在pbs溶液中的抗原溶液，在37℃下孵化1小时，其中抗原溶液的浓度为10μg·ml^-1，pbs溶液的ph为7.4，浓度为0.01m；经过pbs溶液冲洗、氮气吹干后滴加20μl的封闭剂反应1小时；继续滴加20μl的抗体反应1小时后洗涤吹干，其中抗体溶液的浓度为10μg·ml^-1，pbs溶液的ph为7.4，浓度为0.01m；最后滴加20μl的zns-ag2s@ab2溶液，洗涤吹干。

优选地，所述抗体为赭曲霉毒素抗体，可识别赭曲霉毒素a、赭曲霉毒素b和赭曲霉毒素c。

提供上述方法制备的比率型广谱性光电免疫传感器。

提供一种同时检测三种赭曲霉毒素含量的方法，采用上述比率型广谱性光电免疫传感器，通过将步骤s1所得的cds/mos2纳米复合材料修饰的fto，依次结合抗原、封闭剂、抗体与毒素混合溶液，最后结合步骤s2所得的zns-ag2s@ab2溶液，对待测样品进行光电流检测和dpv检测。

更具体地，所述方法的具体操作为：将cds/mos2纳米复合材料修饰的fto在半胱氨酸盐酸盐溶液中浸泡，在电极表面上修饰羧基，洗涤后滴加edc/nhs溶液活化羧基，再滴加赭曲霉毒素抗原溶液孵化；经过pbs溶液冲洗、氮气吹干后滴加封闭剂反应，然后滴加赭曲霉毒素抗体与待测样品的混合溶液，进行免疫竞争反应，之后洗涤吹干，最后滴加zns-ag2s@ab2溶液，洗涤吹干，放入含有pbs缓冲液的电解池中进行光照，测试光电流，之后经过盐酸处理，放入含有hac-naac溶液中测试dpv。

本发明的有益效果是：

1.本发明提供了一种基于功能化纳米复合材料的光电化学免疫传感器的制备方法，是在基体电极上负载片状复合金属化合物后，再加入负载抗体标记物的镂空球状材料后，形成的一种基于光电信号和电信号的双信号的比率型免疫传感器。

2.本发明方法克服了单信号检测有不确定性，创造性地构建了双信号的免疫传感器，即光电材料的光电信号响应和电化学探针的电信号响应，首先制备了片状mos2材料，提升基底的表面积，再控制通过化学沉积法在mos2上沉积cds纳米颗粒的时间，作为光电极，实现了可见光下的稳定光电流。其次，制备了三维zns-ag2s纳米笼来固定二抗，不仅ag2s和cds之间良好的能级配对可以降低光电流的变化信号，而且hcl处理材料后可释放zn²+，可以产生电化学的微分脉冲信号。特别是，在对物质的响应过程中，随着物质浓度的增加，光电流增加，微分脉冲电流减小，不仅这两个信号相互之间进行佐证，而且可以构建比率型的信号来提升对物质的响应能力。

3.本发明方法构建的比率型广谱性光电免疫传感器以cds/mos2作为光电基底，多孔状zns-ag2s作为标记物，在fto电极表面合成的cds/mos2纳米复合光电材料具有良好的光电性能，能够与ag2s发生能级匹配，产生光电淬灭降低光电流。在合成的功能化多孔状zns-ag2s材料上同时负载用于特异识别的ab2，滴加盐酸使锌离子溶出，使用微分脉冲法测量锌离子浓度，产生dpv信号从而实现双信号。该方法可以有效降低背景噪音，提高检测准确性。

4.本发明方法以赭曲霉毒素的检测为例，实现了对三种赭曲霉毒素的同时检验，使用一种广谱性的抗原抗体，该抗抗体可以实现同时对三种赭曲霉毒素otc、otb、ota的特异性识别。游离的赭曲霉毒素小分子与固定在cds/mos2表面的抗原竞争一抗，因此低浓度的赭曲霉毒素小分子对一抗的结合少，导致与抗原结合的一抗数量增加，结合在基底上的多标增多，导致光电路响应的光电流信号较小，而电化学响应的微分脉冲信号较强。反之，当赭曲霉小分子数量多时，则相应的电流变化相反。由此构建比率型免疫传感器，实现了赭曲霉毒素在0.001μg/l～1μg/l浓度范围内的准确测量。

附图说明

图1mos2纳米片的sem图。

图2cds/mos2纳米复合材料的sem图。

图3水与乙二醇不同比例下zns的sem图。(a)4:1，(b)3:2，(c)2:3，(d)1:4。

图4zns-ag2s纳米材料的sem图。

图5zn离子出峰位置与ph值对信号的影响。

图6检测赭曲霉毒素的电流变化示意图。

具体实施方式

下面结合附图及具体实施例进一步说明本发明。下述实施例仅用于示例性说明，不能理解为对本发明的限制。除非特别说明，下述实施例中使用的试剂原料为常规市购或商业途径获得的试剂原料。

实施例1

一种比率型广谱性光电免疫传感器的制备方法，包括以下步骤：

s1.在fto上合成cds/mos2纳米复合材料：在fto导电玻璃上合成片状mos2纳米片，得mos2纳米片修饰的fto，然后在mos2纳米片上负载cds纳米颗粒，得cds/mos2纳米复合材料修饰的fto；

所述在fto导电玻璃上合成片状mos2纳米片的具体操作为：将na2moo4·2h2o和l-半胱氨酸加入到水和氨水的混合溶液中得混合溶液a；将fto与混合溶液a加入反应釜，水热反应后，洗涤、干燥，得修饰了mos2纳米片的fto。

所述在mos2纳米片上负载cds纳米颗粒的具体操作为：将cdcl2、nh4cl、硫脲、氨水加入到蒸馏水中加热，得溶液b；再将mos2纳米片修饰的fto加入溶液b中反应，洗涤、干燥，得cds/mos2纳米复合材料修饰的fto。

更具体地，将45mg的na2moo4·2h2o和100mg的l-半胱氨酸加入到15ml的水和氨水的混合溶液中混合溶液a，其中，控制水和氨水的体积比为2:1；将fto与混合溶液a加入反应釜，200℃下水热反应24小时，洗涤、干燥，得mos2纳米片修饰的fto；再将0.0013molcdcl2、0.0076molnh4cl、0.18mol硫脲、25.84ml氨水加入到500ml蒸馏水中加热到80℃，得溶液b；再将mos2纳米片修饰的fto加入溶液b中，反应5min；洗涤、干燥，得cds/mos2纳米复合材料修饰的fto。

s2.合成zns-ag2s@ab2多标溶液：先合成zns-ag2s纳米材料，然后在zns-ag2s纳米材料上的修饰二抗ab2，得zns-ag2s@ab2；

所述合成zns-ag2s纳米材料的具体操作为：将zn(ac)2和l-半胱氨酸加入水和氨水的混合溶液中，水热反应，离心洗涤，分散在甲醇溶液中，得zns的甲醇溶液；将agno3溶液滴加到zns的甲醇溶液中搅拌，离心洗涤后分散在水中，得zns-ag2s纳米材料的溶液；

所述在zns-ag2s纳米材料上的修饰二抗ab2的具体操作为：在zns-ag2s纳米材料中加入巯基乙酸，室温下搅拌，离心洗涤后，分散在edc/nhs溶液中活化，得混合溶液c；将混合溶液c再次离心洗涤后，分散在pbs溶液中，加入二抗ab2反应，制得溶解在pbs中的zns-ag2s@ab2溶液。

更具体地，将zn(ac)2和l-半胱氨酸加入乙二醇和水的混合溶液中，水热反应，离心洗涤，产物分散在甲醇溶液中，得zns的甲醇溶液；将agno3溶液滴加到zns的甲醇溶液中搅拌，离心洗涤后分散在水中，得zns-ag2s纳米材料溶液；在zns-ag2s纳米材料溶液中加入巯基乙酸，室温下搅拌，离心洗涤后，分散在edc/nhs溶液中活化，得混合溶液c；将混合溶液c再次离心洗涤后，分散在pbs溶液中，加入二抗ab2反应，制得溶解在pbs中的zns-ag2s@ab2溶液。其中，乙二醇和水的混合溶液中乙二醇和水的比例为1:4。

s3.构建传感器：采用步骤s1所得的cds/mos2纳米复合材料修饰的fto，依次结合抗原、封闭剂、抗体，最后结合步骤s2所得的zns-ag2s@ab2，构建比率型广谱性光电免疫传感器。

所述构建传感器的具体操作为：将cds/mos2纳米复合材料修饰的fto在半胱氨酸盐酸盐溶液中浸泡，在电极表面上修饰羧基，洗涤后滴加edc/nhs溶液活化羧基，再滴加抗原溶液孵化；经过pbs溶液冲洗、氮气吹干后滴加封闭剂反应，然后滴加抗体溶液反应，洗涤吹干，最后滴加zns-ag2s@ab2溶液，洗涤吹干。

以检测赭曲霉毒素为例，将cds/mos2纳米复合材料修饰的fto在半胱氨酸盐酸盐溶液中浸泡6小时，在电极表面上修饰羧基，洗涤后继续滴加20μl的edc/nhs溶液活化羧基，其中，edc的浓度为20mg·ml^-1，nhs的浓度为10mg·ml^-1；1小时后再滴加20μl的溶解在pbs溶液中的赭曲霉毒素抗原溶液，在37℃下孵化1小时，其中赭曲霉毒素抗原溶液的浓度为10μg·ml^-1，pbs溶液的ph为7.4，浓度为0.01m；经过pbs溶液冲洗、氮气吹干后滴加20μl的封闭剂反应1小时；继续滴加20μl的赭曲霉毒素抗体反应1小时后洗涤吹干，其中赭曲霉毒素抗体溶液的浓度为10μg·ml^-1，pbs溶液的ph为7.4，浓度为0.01m；最后滴加20μl的zns-ag2s@ab2溶液，洗涤吹干。所述赭曲霉毒素抗体，可识别赭曲霉毒素a、赭曲霉毒素b和赭曲霉毒素c。

实施例2cds/mos2纳米复合材料表征

cds/mos2纳米复合材料的合成：

(1)在fto导电玻璃上合成片状mos2。将45mg的na2moo4·2h2o和100mg的l-半胱氨酸加入到15ml的水和氨水的混合溶液中，控制中水和氨水的体积比为2:1。然后，将fto放入反应釜中，并将上述溶液加入反应釜，200℃下水热反应24小时。反应结束后，取出mos2纳米片修饰的fto，洗涤、干燥。

(2)在mos2纳米片上负载cds纳米颗粒。将0.0013molcdcl2、0.0076molnh4cl、0.18mol硫脲、25.84ml氨水加入到500ml蒸馏水中加热到80℃，再将mos2-fto加入，反应5min。结束后取出cds/mos2纳米复合材料修饰的fto，洗涤、干燥。

mos2纳米片的sem图结果见附图1，结果显示呈大面积的多边片状mos2，由于二硫化钼的特殊性质，只有边缘具有良好的导电性，因此这种多边片状的二硫化钼具有良好的导电性能，能够快速的将电子导出和传递。

cds/mos2纳米复合材料的sem图结果见附图2，结果显示cds通过原位生长的方法在mos2纳米片的边缘上原位合成，形成了大量的cds纳米颗粒包裹在边缘上。硫化镉在光照下产生的电子能够通过mos2快速导出并产生电流，使cds/mos2复合材料具有突出的光电性能。

实施例3zns-ag2s@ab2纳米材料表征

zns-ag2s@ab2多标的合成

(1)合成zns-ag2s纳米材料。0.023gzn(ac)2和0.03gl-半胱氨酸加入到15ml体积比为1:4的乙二醇/水的混合溶液中，150℃水热12小时。离心洗涤，分散在20ml的甲醇溶液中。将20μl浓度为5g/lagno3溶液滴加到zns的甲醇溶液中搅拌，离心洗涤后分散在5ml水中。

(2)二抗在zns-ag2s上的修饰。在2mlzns-ag2s溶液中，加入0.2ml的巯基乙酸在室温下搅拌12小时，离心洗涤后，分散在1mledc/nhs溶液(20mg·ml^-1/10mg·ml^-1)中活化1小时。再次离心洗涤后，分散在1ml的磷酸盐缓冲溶液中(pbs,ph7.4,0.01m)，加入1mg/ml的二抗10微升，4℃下反应24小时，制备的zns-ag2s@ab2溶解在1mlpbs溶液中(ph7.4,0.01m)。

通过调节乙二醇与水的体积比，控制合成了具有较大孔隙结构的zns纳米球。如附图3所示，乙二醇与水的体积比对zns的结构有重要影响。从附图3(b)中可以看出，当乙二醇与水的体积比为40％，zns纳米球开始出现多孔结构，并且随着乙二醇用量的增加而逐渐变得明显。从附图3(d)中可以看出，zns直径约为2微米，由大量纤维状结构组成，具有较大的比表面可以连接较多的二抗，提高响应能力，同时这种中空的孔状结构在加入盐酸溶解时更容易完全溶解，增加zn离子的溶出量，提高电化学信号强度。进一步修饰ag2s后，见附图4，相比附图3(d)，表面的纤维状结构不再明显，表明这些纤维表面已经修饰了ag2s。

实施例4双信号的检测与构建

将cds/mos2在半胱氨酸盐酸盐溶液中浸泡6小时，在电极表面上修饰羧基，洗涤后继续滴加20μl的edc/nhs溶液(20mg·ml^-1/10mg·ml^-1)活化羧基，1小时候再滴加20μl的抗原溶液(10μg/ml,0.01mpbs7.4)，在37℃下孵化1小时，pbs冲洗、氮气吹干后滴加20μl的封闭剂反应1小时，继续滴加20μl的抗体溶液(10μg/ml,0.01mpbs7.4)，反应1小时后洗涤吹干，最后滴加20μl的zns-ag2s@ab2溶液，洗涤吹干后进行测试。

将上述光电极作为工作电极放入电解池中，对电极为铂电极，参比电极为ag/agcl电极，电解液为ph值7.4的pbs溶液。光电化学测试条件为20秒开关灯间隔，可见光光源强度为20mw/cm²。光电测试后将电极取出用氮气吹干，滴加20μlph值为1的盐酸反应20min，再将电极放入ph值为4.5的hac-naac缓冲溶液中进行溶出伏安测试(dpv)。先用循环伏安法在-1.2v到-0.6v的范围对电极进行活化，再在-1.30v下沉积锌离子200s，静置时间20s，在-1.2到-0.95v电压范围进行测试，记录溶出电流。

首先通过400s的开关灯实验测试了电极的稳定性，光电流在400s内几乎不发生变化。对光电极修饰抗原、抗体、多标二抗等各个步骤的光电流变化进行监测，证实了抗原抗体等各种生物分子在光电极上的成功修饰。同时，对多标进行了对比实验，zns-ag2s@ab2和zns@ab2作对比，发现zns-ag2s@ab2作为多标电流下降明显，而zns@ab2电流几乎并无下降，原因是硫化银能够和光电基底上的硫化镉发生能级匹配，使在硫化镉上激发的电子和空穴重新在硫化银上复合，导致电子无法导出从而降低光电流，达到了光电信号放大的目的。

其次，对溶解的ph值进行了测试，由于zns能在盐酸中完全溶解，因此选择盐酸作为溶解zns的溶液，发现在ph值为2的时候zns开始溶解，ph值为1时完全溶解，因此，ph1的盐酸溶液作为溶解的最佳条件(见附图5b)。由于zns的溶度积远高于cds的溶度积，因此zns的溶解意味着表面的cds也会完全溶解。在dpv对照试验中，分别加入zn²⁺和cd²⁺，发现zn²⁺的出峰电位在-1.1v至-1.0v而cd²⁺的电位在-0.95v至-0.8v,因此cd²⁺的溶出不会干扰zn²⁺的出峰强度(见附图5a)。

实施例5对赭曲霉毒素的检测性能

基于间接竞争法构建了双信号广谱电化学免疫传感器对三种赭曲霉毒素进行检测。游离的赭曲霉毒素小分子与固定在cds/mos2表面的抗原竞争一抗，因此低浓度的赭曲霉毒素小分子对一抗的结合少，导致与抗原结合的一抗数量增加，结合在基底上的多标增多，导致光电路响应的光电流信号较小，而电化学响应的微分脉冲信号较强。反之，当赭曲霉小分子数量多时，则相应的电流变化相反。因此，将光电信号与微分脉冲信号构建比率信号，与免疫竞争法相结合，利用广谱性抗体，构建了比率型的广谱型免疫传感器，实现对三种赭曲霉毒素的同时检验。

如附图6所示，分别为检测ota、otb、otc示意图，左图为在优化后的条件下，对应的赭曲霉毒素在0.001μg/l～1μg/l的浓度范围内，光电信号和dpv信号分别随浓度增加而增大和减小的示意图。右图为根据其光电信号和dpv信号比值与浓度的关系构建的标准曲线图。说明构建的比率型的光谱性光电免疫传感器，能够给实现在0.001μg/l～1μg/l浓度范围内的准确测量。