一种牛结核病γ-干扰素快速检测制品的制作方法

本发明属于动物疫病检测技术领域，具体涉及一种牛结核病γ-干扰素快速检测制品。

背景技术：

牛结核病是一种慢性消耗性的人兽共患传染病,是国际动物卫生组织(oie)规定必须通报的动物疫病，在我国属二类动物传染病，对养牛业、食品安全与人类健康构成重大威胁。据统计，人结核中约有5％是由牛分枝杆菌引起。因此掌握我国牛结核现状、检疫淘汰感染牛具有重要的公共卫生意义。牛结核病的检疫目前可归为三类，细菌学检测、分子生物学检测和免疫学检测。细菌学检测和分子生物学检测方法的样品采集需要屠宰牛，不适于活畜检疫。免疫学检测方法包括血清学检测和细胞免疫检测，由于分枝杆菌引起的机体免疫应答以细胞免疫为主，因此目前应用最广泛是结核菌素皮内变态反应和牛结核病γ-干扰素elisa检测技术。

牛结核菌素皮内变态反应是我国的法定检疫方法，检测试剂廉价易得，敏感性高，但操作繁琐，耗时较长，皮内注射后，尚需间隔72小时再赴现场测量皮厚以判定试验结果，难以满足牛结核病大量检疫的需求。

牛结核病γ-干扰素elisa检测技术已被oie批准为皮内变态反应的试验的替代试验。第一步是制备刺激上清。其过程如下：

①采血。采集牛的血液(至少5ml)放入肝素抗凝管中，轻轻颠倒几次混合血液，使肝素溶解。室温下运送到实验室并在采血后8个小时内进行培养。

②加样：将抗凝血加入24孔组织培养板，每头动物加3孔，每孔1.5ml抗凝血。

③加入刺激抗原。每头动物的3孔中，分别无菌加入100μl牛ppd、禽ppd和pbs(阴性抗原对照)。

④孵育。将含有血液和抗原的组织培养板在37℃湿温培养箱中孵育16-24小时。

⑤收样。用移液器小心吸取约400μl的上层血浆，转入独立的1.5ml离心管中。

牛结核病γ-干扰素elisa检测技术的第二步是使用elisa试剂盒检测已收获的刺激上清。其过程如下。

①所有试剂(除酶标抗体)恢复至室温22℃±3℃，在稀释板上每孔加入50μl样品稀释液，在稀释板上相应孔中每孔加入50μl样品和对照，震荡1分钟。

②盖上盖板，室温孵育(22℃±5℃)60±5分钟，弃去板内液体，洗涤6次，拍干。

③每孔加入100μl新鲜配制的酶标抗体。

④盖上盖板，室温孵育(22℃±5℃)60±5分钟，弃去板内液体，洗涤6次，拍干。

⑤每孔加入100μl新鲜配制的底物溶液。

⑥盖上盖板，避光，室温孵育(22℃±5℃)30±5分钟。

⑦每孔加入50μl终止液。

⑧终止后5分钟内读出od450nm，以620—650nm作为参照波长，然后用od值计算结果。结果判定的标准：牛ppd的od值－pbs的od值≥0.1且牛ppd的od值－禽ppd的od值≥0.1为阳性；牛ppd的od值－pbs的od值<0.1或牛ppd的od值－禽ppd的od值<0.1为阴性。

可见，现有牛结核病检测技术中，变态反应试验耗时72小时，需2次往返现场，操作过程复杂。而且γ-干扰素检测试验涉及制备刺激上清，进行elisa试验等过程，要求技术程度高，繁琐复杂。而且现有检测方法需同时使用牛型ppd和禽型ppd才可进行牛型和禽型分枝杆菌感染的鉴别诊断，排除非特异性反应，严重影响了牛结核病检疫工作的进行，亟需改进。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种牛结核病γ-干扰素快速检测制品，可以通过检测全血刺激上清中γ-干扰素的含量，进而诊断牛结核病，从而弥补现有技术的不足。

本发明所提供的牛结核病γ-干扰素快速检测制品，包含有采血器和牛结核病γ-干扰素胶体金试纸条检测卡，其中采血器的内筒内放入有肝素和鸡尾酒抗原的混合物，所述的鸡尾酒抗原包括esat6、cfp10、fixb和hspx蛋白，其中esat6、cfp10、fixb和hspx抗原蛋白的质量比为3:3:2:2；

所述的肝素和鸡尾酒抗原的质量比为1:1。

其中肝素和鸡尾酒抗原的混合物是处于干燥状态，例如粉末状态。

所述的采血器，还包含有以过渡配合方式安装在内筒1内的活塞2和控制活塞2运动的拉杆3，以及针头4，所述的针头4优选通过采血器帽5安装在内筒1上；

所述的采血器帽5是通过螺旋方式安装在内筒1的前端；

所述的采血器帽5内还有滤膜6。

所述的牛结核病γ-干扰素胶体金试纸条检测卡，包括载体板、样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，其中样品垫和吸水垫位于载体板的两端，硝酸纤维素膜位于载体板的中部；样品垫与硝酸纤维素膜交界处设有载有金标单抗的金标垫，金标垫一端边缘重叠在样品垫之下，另一端边缘重叠在硝酸纤维素膜之上；硝酸纤维素膜上从靠近金标垫一侧开始设有检测线(t)和质控线(c)，其中检测线为抗γ-干扰素单抗，质控线c包被有羊抗鼠igg。

本发明在采血器内放入肝素和筛选获得的鸡尾酒抗原的混合物，可以简化繁琐复杂的刺激上清制备过程，将采血、加样、加入刺激抗原、孵育和收样等简化为采血、孵育后直接进行检测的试验过程。同时节约了细胞培养板等试剂耗材。让必须在条件较好、且配备生物安全柜的高级实验室进行的操作，在普通实验室即可进行。

本发明鸡尾酒抗原可以鉴别诊断牛分枝杆菌感染和禽分枝杆菌感染，排除禽分枝杆菌感染，增强试验的特异性；而不需要需同时应用牛型ppd和禽型ppd来制备刺激血清。

本发明通过试纸条方法，取代原有的elisa检测方法，将稀释上清、加入上清样品、洗涤、加入酶标抗体、洗涤、加入底物、终止反应、酶标仪读值、计算等过程，简化为加样、加入稀释液、观察结果共3个步骤，节省时间达3.5小时，同时无需酶标仪等高值仪器，无需熟练技术工人，让原本在县级兽医实验室难以进行的牛结核病的γ-干扰素试验，变得极易普及。

附图说明

图1：本发明的采血器结构示意图

图2：本发明的采血器帽的结构示意图；

其中1、内筒2、活塞3、拉杆4、针头5、采血器帽6、滤膜；

图3：鸡尾酒抗原组分筛选图；

图4：牛结核病γ-干扰素胶体金试纸条检测卡的结构图。

具体实施方式

本发明在采血器内放入肝素和筛选获得的鸡尾酒抗原的混合物，可以简化繁琐复杂的刺激上清制备过程，将采血、加样、加入刺激抗原、孵育和收样等简化为采血、孵育后直接进行检测的试验过程，并鉴别诊断牛型分枝杆菌和禽型分枝杆菌感染。同时节约了细胞培养板等试剂耗材。让必须在条件较好、且配备生物安全柜的高级实验室进行的操作，在普通实验室即可进行，让原本在县级兽医实验室难以进行的牛结核病的γ-干扰素试验，变得极易普及。

下面结合实施例和附图对本发明进行详细的描述。

实施例1：牛结核病专用采血器

本发明中，肝素和筛选获得的鸡尾酒抗原的混合物进行干燥后，可以放入常规使用的采血器中；下面对本发明所使用的一种采血器进行描述。

如图1和图2所示，所述的采血器，还包含有以过渡配合方式安装在内筒1内的活塞2和控制活塞2运动的拉杆3，以及针头4，所述的针头4优选通过采血器帽5安装在内筒1上；所述的采血器帽5是通过螺旋方式安装在内筒1的前端；所述的采血器帽5内还有滤膜6。

本实施例的采血器内筒(采血器器体)使用的原料为聚苯乙烯，拉杆、活塞使用的原料为聚丙烯；滤膜60.12微米孔径,复合pp+pet材料，即(聚丙烯+聚苯二甲酸乙二醇酯)。

所述注射器的尺寸：

器体：长6cm、直径1.7cm

拉杆：长8cm

活塞：直径1.5

采血器帽：直径1.8

针头：可使用6号和7号针头。

2、肝素锂

将肝素锂用灭菌0.9％生理盐水配制成3mg/ml的浓度，置4℃备用。

3、鸡尾酒抗原

①抗原组分的筛选

将esat6、cfp10混合作为一种抗原称之为ec，其浓度按照单组分浓度标识。将ec、fixb、mpb83和hspx四种抗原稀释为终浓度10μg/ml的浓度。将ec作为必备组分，与其他各组分进行组合，形成ec/fixb(简写为ecf)、ec/mpb83(简写为ecm)、ec/hspx(简写为ech)等3种组合，同时以ppdb/ppda(简写为ba)作为传统方法对照。将它们作为刺激抗原，使用自然感染牛、禽分枝杆菌感染牛和健康牛等3组动物进行牛结核病γ-干扰素elisa试验。结果认为ecfh优于ecf和ech。因此确定以esat6/cfp10/fixb/hspx组合作为鸡尾酒抗原组分(图3)。

②4种抗原的浓度筛选

将ec、fixb、hspx3种抗原蛋白分别做梯度稀释为5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml、40μg/ml,分别作为刺激抗原，使用自然感染牛、禽分枝杆菌感染牛和健康牛等3组动物进行牛结核病γ-干扰素elisa试验。结果认为ec的最佳使用浓度30μg/ml，fixb和hspx的最佳使用浓度为20μg/ml。

③抗原制备

将上述的esat6、cfp10、fixb和hspx蛋白，调整为100μg/ml浓度，按照3:3:2:2的比例混合。取100ul鸡尾酒抗原，与50ul稀释好的肝素锂混合。

④抗原加样

将采血器置于试管架上，针头端朝上，拧开采取器帽，将上述鸡尾酒抗原和肝素锂混合物加入内筒。置湿度25％以下房间的电热恒温干燥箱中，40℃烘干3小时，此时液体消失，偶见白斑遗留在内筒的活塞上面。拧上采血器帽。

4.采血器的包装

在湿度25％以下房间，取出处理后的采血器，装入包装袋，充入氮气、加入干燥剂后封口，置室温保存。

5.采血器的检查

本发明与常规的采血器外观基本一致，由内筒、活塞、拉杆、针头、2种采血器盖和外包装组成。其中采血器的活塞上面含有干燥后的肝素及鸡尾酒抗原，部分采血器肉眼观察不到；部分采血器可见白斑，但采血后会溶解、消失。检查合格后即可包装进入牛结核病γ-干扰素快速检测制品中。

实施例2：牛结核病γ-干扰素胶体金试纸条检测卡

如图4所示，本发明提供的牛结核病γ-干扰素胶体金试纸条检测卡，卡内包括载体板、样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，其中样品垫和吸水垫位于载体板的两端，硝酸纤维素膜位于载体板的中部；样品垫与硝酸纤维素膜交界处设有载有金标牛γ-干扰素单抗mt307的金标垫，金标垫一端边缘重叠在样品垫之下，另一端边缘重叠在硝酸纤维素膜之上；硝酸纤维素膜上从靠近金标垫一侧开始设有检测线(t)和质控线(c)，其中检测线为牛γ-干扰素单抗mt17.1，质控线c包被有羊抗鼠igg。

一、制备牛结核病γ-干扰素胶体金试纸条检测卡

(一)所需仪器以及试剂

1xyz-3000三维喷点仪:美国biodot公司产品。

2金标耗材：检测卡、玻璃纤维、吸水棉、支持扳，上海金标公司产品。

3氯金酸：由上海化学试剂公司提供，用去离子水配成1％溶液使用。

4单抗：mabtakmt17.1和mt307单抗。

5羊抗鼠抗体：sigma公司产品。

6硝酸纤维素薄膜(nc)膜:ff170，millipore公司产品，

7切割机：美国biodot公司产品。

8压膜机：美国biodot公司产品。

9封口机：上海森合包装器材有限公司。

10稀释液：0.1％tbs，自己配制。

11牛血清蛋白：购自sigma公司。

12柠檬酸三钠：购自中国上海试剂一厂。

13冷冻离心机：sigma公司。

(二)金标垫制备

1胶体金的制备：100ml去离子水置于洁净的锥形瓶中，加入1ml1％的氯金酸，颜色由黄色变为紫红色后，继续煮沸3-5min，取下冷却至室温，避光4℃保存备用。

2金标垫制备

2.1用0.1m的碳酸钾调胶体金ph8.8，分别取1ml胶体金置10个1.5ml离心管中，梯度加入单抗mt307，充分摇匀后每个离心管加入0.1ml的nacl，观察2h，以颜色由红变蓝的前一管蛋白含量即为稳定1ml胶体金所需的单抗mt307量。本试验稳定1ml胶体金所需的单抗mt307量为2.0ul，标记时增加20％蛋白用量，即2.0×(1.0+20％)＝2.4ul。

2.2取240ul单抗mt307，加入少许去离子水，用碳酸钾溶液调其ph为9.0(用精密ph试纸测ph值)，同时将胶体金溶液的ph值调至9.0。在磁力搅拌下，将100ml胶体金溶液加入至单抗mt307中，继续搅拌10min，置4℃冰箱保存备用。

2.3将金标单抗mt307以2500r/min离心15min(以除去其中的胶体金聚合物)取上清液，以10000r/min离心1h,可见离心物分为3层，上清液含有大量的尚未结合的单抗，最下面的深黑色斑点即为尚未结合的胶体金颗粒聚集物。中间呈黄红色的絮状沉淀物即为结合良好的胶体金-单抗复合物，也即金标单抗。倾去上清液，收集絮状沉淀物，用含0.1％犊牛血清白蛋白(bsa)的0.01mph8.2磷酸盐缓冲液(pb)混悬至原量，同上重复离心2次，最后收集金标单抗，用0.01mph8.2pb液混悬为原体积的10％，滤膜除菌，分装，于4℃冰箱保存备用。

2.4应用xyz-3000三维喷点仪中的airjet喷制胶金抗体棉。将玻璃纤维放于xyz-3000三维喷点仪的平台上，用ph8.20.1％tbs将金标单抗mt307作1：8稀释后，放于样品池a中，将置于平台上的玻璃纤维展平，并放上压条，58℃干燥后，加入干燥剂和变色硅胶，密封保存于4℃冰箱中。

(三)印膜的制备

单抗mt17.1用于检测线的显示，羊抗鼠抗体用于质控线的显示。将ff170硝酸纤维素膜放于xyz-3000三维喷点仪平台上，将单抗mt17.1用0.01mph9.0tbs液作1:1稀释后放于样品池b，羊抗鼠抗体用0.01mph9.0tbs液作1：4稀释后放于样品池c。将置于平台上的硝酸纤维素膜展平，并放上压条，检测线与质控线相距0.5cm，位于膜的中间，距膜的边距分别为0.75cm。开机后用biojet1和biojet2将单抗mt17.1及羊抗鼠抗体分别点射于膜上形成两条线，置室温自然干燥后，密闭保存备用。

(四)检测卡的组装

1印膜的粘贴:将印膜平贴于8cm×30cm支持板的中央，两端边距各为3cm。要注意伸展平贴，贴后不能有空隙或气泡。

2金标垫粘贴(试纸板样品端):将1cm×30cm的胶金抗体棉平贴于印膜阳性线的下方，重叠印膜0.25cm。

3吸水棉的粘贴(试纸板吸水端、手柄端):将3.25cm×30cm吸水棉平放于印膜对照线的一端，重叠nc印膜0.25cm。

4试纸板压膜:把粘贴好的试纸板放于压膜机的凹陷处,盖好压膜机,真空压膜5min,取下,将试纸板密闭保存备用。

5试纸条的切割：将切割机启动，选择试纸条宽度(0.4cm)及切割速度，将试纸板放入槽内，进行切割。

6组装检测卡：将切割好的试纸条装入检测卡内，注意使抗原检测线和阴性对照线均在检测卡的结果区，胶体金线在加样孔的靠近结果区的一侧。

(五)检测卡装袋

将1个检测卡加入1份干燥剂，在30％以下湿度环境中，放入铝箔袋中，用封口机封好，贴上标签。

实施例3：牛结核病γ-干扰素快速检测制品的组装

将上述实施例1制造的20个牛结核病专用采血器和实施例2制造的20个牛结核病γ-干扰素胶体金试纸条检测卡组合在一起，加入1管稀释液，1份说明书，20个滴管，使用试剂盒包装好，贴上标签和生产日期等标识，即制成牛结核病γ-干扰素快速检测试剂盒。

实施例4：检测制品的应用

本发明将原牛结核病γ-干扰素elisa方法的上清制备及elisa检测的13个步骤简化为以下4个步骤。

1.采血。打开外包装，取出专用采血器，采集2-3ml牛的全血，将采血器轻轻颠倒几次混合血液，使内含的肝素及鸡尾酒抗原溶解。拧下采血用采血器帽，盖上孵育用采血器帽；拧下拉杆，室温(22±5℃，避免温度过高或过低)下运送到实验室；

2.孵育。将装有全血的采血器放入试管架中，试管架约呈45度倾斜放入37℃湿温培养箱中孵育16-24小时；

3.检测。取出检测卡，放于洁净的平台上；使用滴管吸取采血器中的刺激上清，加1滴至检测卡样品孔(s)中；约经10秒左右，使用稀释液管垂直加入6滴稀释液；20分钟后观察结果。

4.结果判定

检测卡上只在对质控线(c)上出现一条红线，表示为牛结核病为阴性结果；

检测卡上在检测线(t)和质控线上出现两条红线，表示为牛结核病为阳性结果；

检测卡上未出现红线，表示试验失败，需要重新取卡检测。

使用效果表明，与传统方法相比，本发明制品将传统方法的检测工作时间，由每30头牛约需6小时，缩短为每30头牛约需半小时；将传统方法的13个步骤简化为4个步骤，可以省略加入刺激抗原、细胞培养、抽取刺激上清、elisa试验等多项技术操作，显著减少工作量，降低了工作的技术难度；本发明无需使用酶标仪等贵重仪器，无需消耗细胞培养板等器材，节省了试验成本；用本发明检测10头禽分枝杆菌阳性牛，结果均为阴性，证实本发明采用的鸡尾酒抗原可以排除禽分枝杆菌等引发的非特异性反应，有效鉴别牛型分枝杆菌和禽型分枝杆菌感染，增强试验的特异性。

下面对本发明的制品的使用效果描述如下：

1、本发明制品的检测敏感性

对10头经病理解剖和细菌分离确诊的结核分枝杆菌感染牛，用本发明制品进行检测，结果均为阳性，与已有的方法相比，本发明制品的相对敏感性为100％。

2、本发明制品的检测特异性

γ-干扰素elisa试验阴性牛70头，用本发明检测，检出阳性2头，相对特异性为97％(68/70)。禽分枝杆菌阳性牛、布病阳性牛、副结核病阳性牛各10头，用本发明检测，结果均为阴性(见表1)。表明本发明的制品与禽分枝杆菌阳性牛、布病阳性牛、副结核病阳性牛均没有交叉反应，可以排除禽分枝杆菌等造成的非特异性反应。

表1：特异性试验结果

3、本发明方法与其他方法的符合率试验

对结核病γ-干扰素elisa试验阳性牛和阴性牛各15头，用本发明进行检测，结果15头结核病γ-干扰素elisa试验阳性牛均为阳性，15头结核病γ-干扰素elisa试验阴性牛均为阴性。本发明与牛结核病γ干扰素elisa试验的符合率为100％(表2)。

表2：符合率试验结果(单位：头)

4、重复性试验

用γ-干扰素elisa试验阴性牛10头，阳性刺激上清5头；不同的人进行检测，结果见表3。用3个不同阰次生产的本发明进行检测，其检测结果完全一致。见表4。证明本发明具有较好的重复性。

表3：不同人的检测结果

表4：不同阰次制品的检测结果

5、保存期试验。

将本发明制品置室温保存，每隔2个月检测阳性牛和阴性牛各5头，结果见表5。证明本发明制品在室温下保存可达12个月。

表5：保存期试验结果