一种基于NMR代谢组学对玛咖不同品种的鉴别方法与流程

本发明属于中药材鉴定技术领域，特别是涉及一种应用¹h-nmr代谢组学技术研究玛咖不同品种的化学成分差异，进而对不同品种玛咖的真伪优劣进行评价的方法。

背景技术：

玛咖(lepidiummeyenii，maca)为十字花科(brassicaceae)独行菜属(lepidium)一年生草本植物，原生长于秘鲁海拔4000—4500m的安第斯山脉，其根作为当地一种药食同源的天然药物已有悠久的历史。传统传统用于提高性功能和生殖能力。现代研究表明玛咖具有抗疲劳、改善性功能、抗氧化、减少前列腺增生、缓解更年期综合症、抑制癌细胞、增加骨密度等多种功效。国内外专家对玛咖的营养成分及次生代谢物质进行了较深入的研究，玛咖不仅含有蛋白、氨基酸、脂肪及微量元素等营养成分，还含有多种次生代谢物质：玛咖烯(macaene)、生物碱(包括玛咖酰胺macamide)、芥子油苷及其水解衍生物、甾醇、多酚类及其他成分，这些次生代谢物质被认为与玛咖的保健功效有密切关系。有报道显示，玛咖以根的颜色区分至少分为8种。

玛咖素有“秘鲁人参”和“南美人参”的美誉，以玛咖为主要原料生产的各类保健品近年来在欧美、日本等市场上已得到越来越多消费者的青睐。随着玛咖在中国、美国、西班牙、日本等国家的引种成功，它已逐渐成为功能食品研究领域的热点，玛咖根可炒用，可煮用，可榨汁，也可磨粉应用，尤其是玛咖粉体，市场掺假现象尤为严重，为了防止商品玛咖被以假乱真，以劣乱优以及消费者准确鉴别各类品种，因此，如何对玛咖掺假和伪造现象进行精准、快速、经济的鉴别已经成为玛咖市场持续发展的有效途径，也在保证不同品种玛咖质量中起着重要的作用。

代谢组学技术以代谢物质群体指标分析为基础，借助高通量检测和数据处理手段，具有整体观的研究思路，特别适合这种多成分、复杂体系的分析。利用代谢组学的思维方式和分析方法在整体上分析玛咖各个品种初生代谢产物和次生代谢产物的成分差异及成分含量差异，从而能综合全面的评价各类玛咖的内在品质。基于核磁共振的代谢组学分析方法是一个简单、快速、系统、整体的分析平台，能同时检测到各种组群化合物的优势，此方法已成功运用于多种药物的分析中如中药复方制剂药效研究。

多元统计分析是针对多成分、多靶点复杂中药分析的最常用的化学计量学方法。主成分分析(pca)和偏最小二乘法判别分析(pls-da)和正交偏最小二乘判别分析(opls-da)等已经广泛用于食品、药品和农产品等的快速识别，pca利用降维思想，将观测指标的维数降低，已获得较低维数的指标，可大量的减少分析的数据而能够最大量的获得可供参考的数据信息。同时，pca是一种非监督性的的数据分析平台，想要获得更有力的信息，需对数据进一步考证分析，还需进行有监督的偏最小二乘法判别分析(pls-da)，可以提供除回归方程之外的主成分分析和典型相关分析的相关信息。正交偏最小二乘判别分(opls-da)是对pls的补充分析，结合了正交信号校正(osc)和pls两个方法，能够将x矩阵信息(nmr数据)分解成与y(分类信息)相关和不相关的两类信息，通过除去不相关的差异，相关的信息就集中表现在第一预测成分，因此可以通过对集中在第一预测成分上的变量的筛选找出特征性变量，从而找出特征性代谢物，因此，opls-da方法建立多元数据统计模型用于分子标志物的筛选。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是：提供一种基于nmr代谢组学对玛咖不同品种的鉴别方法，以秘鲁参、云南紫玛咖、黄玛咖、黑玛咖4个品种为研究对象，以核磁检测为技术手段，通过多元数据处理模式，用以判别玛咖真伪，该方法不仅可以保证玛咖品质和有助于玛咖质量标准的建立，也为其他中药鉴定研究提供了一定的思路。

一种基于nmr代谢组学对玛咖不同品种的鉴别方法，其特征是：包括以下步骤，且以下步骤顺次进行，

步骤一、取每种待测玛咖样品6个～10个，过筛保留50目～70目的粉体，每种样品取8批，每批1g，分别加入两相溶剂进行超声萃取处理20min～40min，在室温条件下，以3000r/min离心15min～35min，进行分层处理，过滤上层溶液，在60℃的条件下，氮气吹干，获得干膏；

步骤二、取所述步骤一获得的干膏20mg，加入500μl～700μl含4％～6％tsp总悬浮颗粒物的磷酸盐缓冲液，溶解离心后取上清液400μl～500μl，加入40ul～60μld2o，混匀后移至5mmnmr核磁管中进行¹h-nmr检测，获得玛咖样品的¹h-nmr检测图谱；

步骤三、对所述步骤二获得的¹h-nmr检测图谱进行数据处理和导出，获得所有分析数据；

步骤四、将所述步骤三获得的数据进行多元统计分析，将得分投影图与载荷图相结合，获得不同品种玛咖差异性代谢产物组成及其相对含量，并对玛咖样品进行综合性分析，得出结论。

所述步骤一中的两相溶剂为体积比为7.5ml:7.5ml:15ml的甲醇-水-氯仿溶液。

所述步骤二中的¹h-nmr检测在brukeravanceiii500谱仪上完成，¹h-nmr谱使用标准的noesyprgp1d脉冲序列，3s等待时间和300ms混合时间中采用低功率连续波脉冲进行水峰抑制，其中90°脉宽约为12.08μs，谱宽为5498.53hz，采样时间1.68s。

所述步骤三中采用mestrenova核磁数据处理软件进行¹h-nmr检测图谱进行数据处理和导出。

所述步骤四中的多元统计分析采用simca-p14软件进行。

通过上述设计方案，本发明可以带来如下有益效果：一种基于nmr代谢组学对玛咖不同品种的鉴别方法，与现有技术相比，具有以下优势，

全面性，与以往鉴定技术，该发明更全面，从整体上阐明玛咖的代谢产物，能系统的比较代谢产物之间的差异；

关联性，pca、pls-da与opls-da层层递进，环环相扣，相互关联，才能保证实验结果的准确性；

准确性，丰富的分析数据结合现代高科技分析软件，能保证实验结果的稳定、可控，具有宏观准确性和微观精确性；

广泛性，该发明具有外延性，在一定的程度上也适合于其他中药的分析鉴定和质量保证；

简便性，该鉴定方法简单、方便、快速、经济，适合于市场和一般个体应用。

附图说明

以下结合附图和具体实施方式对本发明作进一步的说明：

图1为本发明一种基于nmr代谢组学对玛咖不同品种的鉴别方法实施例玛咖1h-nmr图。

图2为本发明一种基于nmr代谢组学对玛咖不同品种的鉴别方法实施例pca得分图。

图3为本发明一种基于nmr代谢组学对玛咖不同品种的鉴别方法实施例pls-da图ⅰ。

图4为本发明一种基于nmr代谢组学对玛咖不同品种的鉴别方法实施例pls-da图ⅱ。

图5为本发明一种基于nmr代谢组学对玛咖不同品种的鉴别方法实施例opls-da图。

图6为本发明一种基于nmr代谢组学对玛咖不同品种的鉴别方法操作流程示意框图。

具体实施方式

一种基于nmr代谢组学对玛咖不同品种的鉴别方法，如图6所示，包括以下步骤，

步骤一、对不同品种的玛咖样品进行粉碎处理；

步骤二、对粉碎后的玛咖样品进行进一步提取处理；

步骤三、对提取后的玛咖样品进行核磁测定前处理；

步骤四、对核磁测定前处理好的玛咖样品进行¹h-nmr测定；

步骤五、对¹h-nmr测定的玛咖样品图谱进行一系列数据整理；

步骤六、对整理好的数据进行多元统计分析，得出不同品种玛咖差异性代谢产物；

步骤七、根据多元统计分析得到的得分投影图与载荷图结合，得到不同品种玛咖差异性代谢产物组成及其相对含量，并对玛咖样品进行综合性分析，得出结论。

实施例一、

一种基于nmr代谢组学对玛咖不同品种的鉴别方法，该方法所包括的步骤如下：

步骤一，每个品种取8个形状均一的干燥玛咖根进行粉碎，粉体粒度为60目，共32份，分装备用。

步骤二，将样品的粉末各量取1g，加7.5ml的水、7.5ml甲醇、15ml三氯甲烷进行超声提取30min。取出，离心(3000r/min25min),提取液分为两层(上层为水相，下层为有机相)，将上下层分别用滤纸过滤于50ml离心管中，置于水浴锅中用风扇吹至半固体，再将其放在氮吹仪于60℃吹至干燥即可，放于干燥器中备用。

步骤三，精密称取水相干燥后膏子20mg于2ml离心管中，溶于600μl磷酸盐缓冲液(含0.05％tsp)并离心(11180×g，10min)后，移取450μl上清液和50uld2o至5mmnmr样品管中进行nmr检测。

步骤四，样品在brukeravanceiii500谱仪上完成核磁检测。¹h-nmr谱使用标准的noesyprgp1d脉冲序列，等待时间(3s)和混合时间(300ms)中用低功率连续波脉冲进行水峰抑制。实验中90°脉宽约为12.08μs，谱宽为5498.53hz，采样时间1.68s。

步骤五，将32份样品的¹h-nmr图谱进行mestrenova数据处理软件进行标峰、定位、归一化、分段处理、保存等一系列操作，最终将¹h-nmr图谱数据化，得到所有下一步分析所需的数据。

步骤六，将经mestrenova分析的数据用excell表综合整理，导入simca-p14软件进行多元统计分析，即用主成分分析(pca)、偏最小二乘法判别分析(pls-da)和正交偏最小二乘判别分析(opls-da)，得到相应的图示和数据。

步骤七，将所得的得分投影图和载荷图结合不同品种玛咖差异性代谢产物组成对玛咖样品进行综合性分析结果如下：

对玛咖代谢产物进行¹h-nmr图谱指认，结合现有技术，分析玛咖代谢产物的化学位移和偶合常数，发现其代谢产物包括氨基酸、有机酸、脂类和其他等。氨基酸包括异亮氨酸isoleucine(δ1.95，m)，丙氨酸alanine(δ3.77，q,j＝7.23hz)，赖氨酸lysine(δ3.76，t,j＝6.11hz)，精氨酸arginine(δ1.89，m)，脯氨酸proline(δ3.34，m)，谷氨酸glutamate(δ2.35，m),苯丙氨酸phenylalanine(δ3.29，dd)，色氨酸tryptophan(δ7.49，d)，结果显示玛咖代谢产物氨基酸的化学位移在δ1.89到δ7.49。有机酸包括3-羟基丁酸3-hydroxybutyrate(δ2.41，m)，β-甲基-α-酮戊酸(δ1.13，d,j＝8.44hz),乳酸lacticacid(δ1.33，t，j＝6.6hz)，γ-氨基丁酸γ-aminobutyricacid(δ2.31，t,j＝7.2hz)，乙酸aceticacid(δ1.92，s)，丙酮酸pyruvicacid(δ2.23,s)，琥珀酸succinicacid(δ2.41,s),牛磺酸taurine(δ3.24,t),甲酸formicacid(δ8.46,s),其化学位移在δ1.13到δ8.46。脂类包括丙酮酸脂pyruvate(δ2.38，s)，甘油磷脂酰胆碱glycerophospho-choline(δ3.63，m)，其化学位移在δ2.38到δ3.63。其他包括乙酰胺acetamide(δ1.99，s)，甜菜碱betaine(δ3.27，s)，甘油glycerol(δ3.55，dd，4.2，9.6)，鲨肌醇scyllo-inositol(δ3.36，s)，5-羟甲基糠醛5-hmf(δ4.61，s)，α-gluα-glucose(δ5.24，d，3.6)，尿嘧啶uracil(δ5.80，d,j＝9.23hz),玛咖代谢产物氨基酸的化学位移在δ1.99到δ5.80。

如图1～图5所示，其中bmk:白玛咖，hmk:黑玛咖，zmk:紫玛咖，m：秘鲁参，四个玛咖品种在pca图(pc1:86.43％；pc2:8.17％)上的差异，又进一步采用pls-da探索代谢产物之间的差异，r2的参数(0.72),q2(0.65)表示模型的良好的建立。用s-plot视觉方式,可以用来选择生物标志物，离原点最远的变量在s-plot选为潜在的生物标记物，相应的s-plot分析表明不同品种玛咖样品中乳酸、丙氨酸、β-甲基-α-酮戊酸、γ-氨基丁酸、异亮氨酸、赖氨酸、牛磺酸、脯氨酸、3-羟基丁酸、乙酸和精氨酸的含量在云南紫玛咖、黄玛咖、黑玛咖中相对接近归为一组，并呈现出云南紫玛咖、黄玛咖、黑玛咖组明显高于秘鲁参的特征。在得分投影图中云南紫玛咖、黄玛咖、黑玛咖与秘鲁参也明显分为两大组，且云南紫玛咖、黄玛咖、黑玛咖组中三者能够各自清楚区分开。

本发明通过¹h-nmr代谢组学的研究思路和多元统计分析途径，对秘鲁参、紫玛咖、黄玛咖和黑玛咖的差异标志性成分进行研究。采用核磁共振仪采集样品信息，通过多元统计分析的方法分析检测所得代谢产物，结果表明，秘鲁参、紫玛咖、黄玛咖和黑玛咖的初生代谢产物存在着明显差异，其中s-plot和v-plot中vip值位列前三的依次是乳酸、丙氨酸、β-甲基-α-酮戊酸。分析表明不同品种玛咖样品中乳酸、丙氨酸、β-甲基-α-酮戊酸、γ-氨基丁酸、异亮氨酸、赖氨酸、牛磺酸、脯氨酸、3-羟基丁酸、乙酸和精氨酸的含量在云南紫玛咖、黄玛咖、黑玛咖中相对接近归为一组，并呈现出云南紫玛咖、黄玛咖、黑玛咖组明显高于秘鲁参的特征。在得分投影图中云南紫玛咖、黄玛咖、黑玛咖与秘鲁参也明显分为两大组，且云南紫玛咖、黄玛咖、黑玛咖组中三者能够各自清楚区分开。本发明可全面、系统的对玛咖代谢产物进行整体分析，避免经典范式对玛咖鉴别的片面性，操作简单、快速，结论准确可靠。

本发明需要声明的是，该法不仅仅局限于本专利所给实施案例还可以用于其他方面的鉴别分析，只要不改变本专利的发明核心，在此基础上对此法进行相应的修改和拓展，都是对本发明的应用。