谷丙转氨酶电化学检测组合物、其应用、电化学传感器及检测方法与流程

本发明涉及生物检测领域，特别是涉及一种谷丙转氨酶电化学检测组合物、其应用、电化学传感器及检测方法。
背景技术：
：谷丙转氨酶是人体新陈代谢的一种重要的酶。对人体内谷丙转氨酶浓度进行定量检测，可以了解人体目前肝功能损害程度以及判断治疗效果，也可以对健康人群进行常规肝功能检测。一般通过血液中谷丙转氨酶的检测表征人体谷丙转氨酶的浓度。电化学传感器是用于检测血液中组分浓度的一种方法。利用电化学传感器检测组分浓度可以通过采集指尖血进行测试，需血量比较少，大约为10ul左右，操作简单，可以进行定量检测。由于采血量少，电化学传感器对于精度的要求很高，检测过程中传感器也会对非目标组分的干扰比较敏感。而正常的指尖血中会存在内源性的丙酮酸，丙酮酸的存在会对谷丙转氨酶的检测造成干扰，导致检测结果不准确。技术实现要素：基于此，有必要提供一种能够排除内源性丙酮酸干扰，提高检测精确性的谷丙转氨酶电化学检测组合物、其应用、电化学传感器及检测方法。一种谷丙转氨酶电化学检测组合物，包括第一组合物和第二组合物，所述第一组合物包括水、第一缓冲液、第一电解质、第一表面活性剂、第一电子媒介体以及丙酮酸氧化酶，所述第二组合物包括水、第二缓冲液、第二电解质、第二表面活性剂、第二电子媒介体、α-酮戊二酸、l-丙氨酸以及丙酮酸氧化酶。在其中一个实施例中，所述第一组合物中的所述丙酮酸氧化酶的浓度为0.1mg/ml～10mg/ml。在其中一个实施例中，所述第二组合物中的所述丙酮酸氧化酶的浓度为0.1mg/ml～10mg/ml。在其中一个实施例中，所述第二组合物中的所述α-酮戊二酸的浓度为0.1mg/ml～10mg/ml，所述l-丙氨酸的浓度为0.1mg/ml～10mg/ml。在其中一个实施例中，所述第一组合物和/或所述第二组合物还包括多糖。在其中一个实施例中，所述第一组合物和/或所述第二组合物还包括二氧化硅。在其中一个实施例中，所述第一电子媒介体和/或所述第二电子媒介体选自氧化态的电子媒介体。在其中一个实施例中，所述氧化态的电子媒介体选自氧化态的醌、氧化态的醌衍生物、二茂铁、铁氰化物以及钌盐中的一种或多种。在其中一个实施例中，所述第一缓冲液和/或所述第二缓冲液的ph值为5～9。一种所述的谷丙转氨酶电化学检测组合物在制备用于谷丙转氨酶电化学传感器的检测材料中的应用。一种谷丙转氨酶电化学传感器，所述谷丙转氨酶电化学传感器包括多个连通的反应池，所述反应池设置有反应试剂层，至少有一个所述反应池的所述反应试剂层是将所述的谷丙转氨酶电化学检测组合物中的所述第一组合物经干燥形成，至少有一个所述反应池的所述反应试剂层是将所述的谷丙转氨酶电化学检测组合物中的所述第二组合物经干燥形成。一种谷丙转氨酶的检测方法，采用所述的谷丙转氨酶电化学传感器，并包括以下步骤：测定已知谷丙转氨酶浓度的样本在所述第一组合物形成的第一所述反应试剂层中的第一电流值以及在所述第二组合物形成的第二所述反应试剂层中的第二电流值，将所述第二电流值减去所述第一电流值得到相对电流值；按照一定谷丙转氨酶浓度梯度测定所述相对电流值，得到谷丙转氨酶浓度和所述相对电流值的标准曲线；测定待测样本的所述相对电流值；以及将所述待测样本的所述相对电流值代入所述标准曲线，得到所述待测样本中的谷丙转氨酶的浓度。本发明的所述谷丙转氨酶电化学检测组合物用于对检测样本中的谷丙转氨酶进行定量检测，谷丙转氨酶的电化学定量检测的原理为α-酮戊二酸和l-丙氨酸在谷丙转氨酶的催化作用下形成丙酮酸和l-谷氨酸，丙酮酸在丙酮酸氧化酶的作用下失电子而被氧化，电子被电子媒介体捕获并以电流的形式输出。根据电流值可以表征检测样本中产生的丙酮酸的浓度。如果检测样本中存在内源性的丙酮酸，会使得谷丙转氨酶的检测结果较实际值增大，造成检测结果不准确。本发明的所述第一组合物的丙酮酸氧化酶可以对检测样本中的内源性丙酮酸进行检测，所述第二组合物可以对检测样本中的内源性丙酮酸以及谷丙转氨酶催化α-酮戊二酸和l-丙氨酸形成的丙酮酸的总和进行检测，所述第二组合物形成的电流减去所述第一组合物形成的电流的差值可以表征检测样本中的谷丙转氨酶的浓度，从而排除不同检测样本中的内源性丙酮酸的干扰，检测结果更精确。附图说明图1为本发明一实施例的谷丙转氨酶电化学传感器的结构示意图；图2为本发明一实施例的谷丙转氨酶浓度和电流差值关系的标准曲线照片。具体实施方式为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下通过实施例，并结合附图，对本发明的谷丙转氨酶电化学检测组合物、其应用、电化学传感器及检测方法。进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。本发明实施例提供一种谷丙转氨酶电化学检测组合物，包括第一组合物和第二组合物，所述第一组合物用于检测内源性丙酮酸，所述第二组合物用于检测谷丙转氨酶和内源性丙酮酸，所述第一组合物包括水、第一缓冲液、第一电解质、第一表面活性剂、第一电子媒介体以及丙酮酸氧化酶，所述第二组合物包括水、第二缓冲液、第二电解质、第二表面活性剂、第二电子媒介体、α-酮戊二酸、l-丙氨酸以及丙酮酸氧化酶。本发明实施例的所述谷丙转氨酶电化学检测组合物用于对检测样本中的谷丙转氨酶进行定量检测，谷丙转氨酶的电化学定量检测的原理为α-酮戊二酸和l-丙氨酸在谷丙转氨酶的催化作用下形成丙酮酸和l-谷氨酸，丙酮酸在丙酮酸氧化酶的作用下失电子而被氧化，电子被电子媒介体捕获并以电流的形式输出。根据电流值可以表征检测样本中产生的丙酮酸的浓度。如果检测样本中存在内源性的丙酮酸，会使得谷丙转氨酶的检测结果较实际值增大，造成检测结果不准确。本发明实施例的所述第一组合物的丙酮酸氧化酶可以对检测样本中的内源性丙酮酸进行检测，所述第二组合物可以对检测样本中的内源性丙酮酸以及谷丙转氨酶催化α-酮戊二酸和l-丙氨酸形成的丙酮酸的总和进行检测，所述第二组合物形成的电流减去所述第一组合物形成的电流的差值可以表征检测样本中的谷丙转氨酶的浓度，从而排除不同检测样本中的内源性丙酮酸的干扰，检测结果更精确。在一实施例中，所述第一电子媒介体选自氧化态的电子媒介体。所述氧化态的电子媒介体将氧化还原反应过程中的电子捕获，以电流的形式输出。在一实施例中，所述氧化态的电子媒介体可以选自有机电子媒介体或无机电子媒介体，所述有机电子媒介体可以选自氧化态的醌、氧化态的醌衍生物和二茂铁中的一种或多种，所述无机电子媒介体可以选自铁氰化物和钌盐中的一种或多种。优选的，所述氧化态的电子媒介体可以为铁氰化物。在一实施例中，所述第二组合物中的所述第一电子媒介体的浓度可以为1mg/ml～50mg/ml。所述第二电子媒介体的种类及浓度可以与所述第一电子媒介体相同或不同。优选的，所述第二电子媒介体的种类及浓度与所述第一电子媒介体相同，保证所述第一组合物和所述第二组合物介导的氧化还原反应的电子传输性能相同，排除偶然误差。在所述第一组合物中，所述丙酮酸氧化酶用于将检测样本中的内源性丙酮酸氧化，使丙酮酸失去电子，失去的电子通过所述第一电子媒介体以电流的形式输出，从而表征检测样本中的内源性丙酮酸的相对浓度。在一实施例中，所述第一组合物中的所述丙酮酸氧化酶的浓度可以为0.1mg/ml～10mg/ml。在所述第二组合物中，所述α-酮戊二酸和所述l-丙氨酸作为反应底物，检测样本中的谷丙转氨酶作为催化剂，催化所述α-酮戊二酸和所述l-丙氨酸形成丙酮酸。通过所述丙酮酸的形成量表征待检测样本中的谷丙转氨酶的浓度。在一实施例中，所述第二组合物中的所述α-酮戊二酸的浓度可以为0.1mg/ml～10mg/ml、所述l-丙氨酸的浓度可以为0.1mg/ml～10mg/ml。由于所述α-酮戊二酸和所述l-丙氨酸按照1:1的比例发生反应，优选的，所述α-酮戊二酸和所述l-丙氨酸的浓度相同。在所述第二组合物中，所述丙酮酸氧化酶用于将检测样本中的内源性丙酮酸和所述谷丙转氨酶催化形成的丙酮酸氧化，使丙酮酸失去电子，失去的电子通过所述第二电子媒介体以电流的形式输出，从而表征检测样本中的内源性丙酮酸和所述谷丙转氨酶催化形成的丙酮酸的总和的浓度。所述第二组合物测得的丙酮酸的总和减去所述第一组合物测得的内源性丙酮酸得到所述谷丙转氨酶催化得到的丙酮酸的浓度，所述谷丙转氨酶催化得到的丙酮酸的浓度与所述谷丙转氨酶的浓度成正相关。即，所述第二组合物得到的电流值和第一组合物得到的电流值的差值与检测样本中的所述谷丙转氨酶的浓度成正相关。在一实施例中，所述第二组合物中的所述丙酮酸氧化酶的浓度为0.1mg/ml～10mg/ml。表面活性剂用于分散所述第一组合物的各组分和所述第二组合物的各组分。在一实施例中，所述第一表面活性剂可以选自聚乙二醇辛基苯基酶类，如tritonx-100；聚氧乙烯失水山梨醇单月桂酸酯，如吐温20；胆酸衍生物类，如3-[(3-胆酰胺基丙基)二甲基铵基]-1-丙磺酸盐、脱氧胆酸钠；十二烷基聚乙二醇醚，如brij35；及季铵盐类，如十六烷基三甲基溴化铵中的一种或多种。所述第一表面活性剂在所述第一组合物中的浓度可以为0.1mg/ml～50mg/ml。所述第二表面活性剂的种类及浓度可以与所述第一表面活性剂的种类及浓度相同或不同。缓冲溶液在所述谷丙转氨酶电化学检测组合物中起到缓冲作用，用于维持所述谷丙转氨酶电化学检测组合物的ph相对稳定性。所述第一缓冲溶液可以选自tris、4-羟乙基哌嗪乙磺酸(hepes)、tes及磷酸缓冲盐溶液(pbs)中的一种或多种。优选的，所述第一缓冲溶液的ph值可以为5～9，在该范围内，使得第一组合物更稳定，氧化还原反应进行更迅速，更有利于血液中内源性丙酮酸的检测准确性。优选的，所述第一缓冲溶液为ph为5～9的tris缓冲溶液。tris缓冲溶液不会对内源性丙酮酸检测过程中的电信号造成干扰。在一实施例中，在所述第一组合物中，所述第一缓冲溶液的浓度可以为0.1mg/ml～20mg/ml。所述第二缓冲液浓度、ph及种类可以和所述第一缓冲液相同或不同。优选的，所述第一缓冲液和所述第二缓冲液的浓度、ph及种类相同，保证所述第一组合物和所述第二组合物检测环境的一致性，降低丙酮酸检测的偶然误差。电解质在所述谷丙转氨酶电化学检测组合物中用于传导电子和导电。在一实施例中，所述第一电解质可以选自氯化钠、氯化钾及硫酸钠中的一种或多种。优选的，所述第一电解质为氯化钠。在所述第一组合物中，所述第一电解质的浓度可以为0.1mg/ml～10mg/ml。在该浓度范围内，可以使所述丙酮酸氧化酶与内源性丙酮酸的电化学反应速度加快，并且使电化学反应进行更稳定，提高检测重复性。所述第二电解质的浓度及种类可以和所述第二电解质相同或不同。优选的，所述第二电解质和所述第二电解质的浓度及种类可以相同，保证所述第一组合物和所述第二组合物检测环境的一致性，降低丙酮酸检测的偶然误差。优选的，所述第一组合物还包括多糖。所述多糖在所述第一组合物中的作用是减少负溶解的速率，提高检测精密度。在一实施例中，所述多糖可以选自海藻酸钠、海藻糖、甘露醇、山梨醇、蔗糖、淀粉及纤维素中的一种或多种。优选的，所述多糖至少包括纤维素。所述纤维素用于稳定血液组分，避免血液的负溶解。在所述第一组合物中，所述多糖浓度可以为0.1mg/ml～10mg/ml。优选的，所述第一组合物和还包括二氧化硅。所述二氧化硅可以与所述多糖共同配合，形成一个骨架结构，降低血液在所述第一组合物中的负溶解，有利于提高检测重复性。在所述第一组合物中，所述二氧化硅的浓度可以为0.1mg/ml～10mg/ml。同理，所述第二组合物可以包括多糖。所述第二组合物可以包括二氧化硅。所述第二组合物与所述第一组合物中的多糖的种类和浓度可以形同或不同。所述第二组合物与所述第一组合物中的二氧化硅的浓度可以形同或不同。所述纤维素和所述二氧化硅可以通过震荡、搅拌、超声等方式分散在所述第一组合物或所述第二组合物中。本发明实施例还提供一种所述的谷丙转氨酶电化学检测组合物的应用，所述谷丙转氨酶电化学检测组合物可以制备用于谷丙转氨酶电化学传感器的检测材料，例如将所述谷丙转氨酶电化学检测组合物干燥形成谷丙转氨酶电化学传感器的反应试剂层。在一实施例中，所述第一组合物可以用于形成第一电化学传感器的第一反应试剂层，所述第一电化学传感器用于检测样本中的内源性丙酮酸；所述第一组合物可以用于形成第二电化学传感器的第二反应试剂层，所述第二电化学传感器用于检测样本中的内源性丙酮酸和谷丙转氨酶催化形成的丙酮酸的总和。所述第一电化学传感器和所述第二电化学传感器配合使用，得到检测样本中的谷丙转氨酶的浓度。所述第一电化学传感器和所述第二电化学传感器可以单独设置或者集成在一个电化学传感器中。优选的，所述第一电化学传感器和所述第二电化学传感器集成在一个电化学传感器中，可以通过一次加样实现谷丙转氨酶的测定，可以节约检测样本的使用量，实现微量采血。请参阅图1，本发明实施例还提供一种谷丙转氨酶电化学传感器，所述谷丙转氨酶电化学传感器包括多个连通的反应池101，所述反应池101设置有反应试剂层(图未示)，至少有一个所述反应池101的所述反应试剂层是将所述的谷丙转氨酶电化学检测组合物中的所述第一组合物经干燥形成，至少有一个所述反应池101的所述反应试剂层是将所述的谷丙转氨酶电化学检测组合物中的所述第二组合物经干燥形成。所述谷丙转氨酶电化学传感器采用多通道检测，可以实现一次进样，分别检测样本中的内源性丙酮酸和谷丙转氨酶催化形成的丙酮酸与内源性丙酮酸之和，从而得到谷丙转氨酶的浓度。实现用比较少的检测样本(血液)，准确测试出谷丙转氨酶的含量，特别是针对中老年人，扎针比较困难的人群，能够得到更好的检测体验。具体的，所述谷丙转氨酶电化学传感器可以包括进样流道，所述进样流道可以包括主流道102和分支流道103。所述分支流道103的数量与所述反应池101的数量相同并相互对应。检测样本加入所述主流道之后，可以沿各分支流道103进入各反应池101中，在所述第一组合物形成的第一反应池101中得到内源性丙酮酸的浓度，在所述第二组合物形成的第二反应池101中得到内源性丙酮酸和谷丙转氨酶催化形成的丙酮酸的浓度的总和。优选的，所述分支流道103为两个，所述反应池101为两个，从而避免检测样本流入多个反应池101，造成检测样本的浪费。各反应池101内设有电极层110和反应试剂层，且各反应池12内的反应试剂层位于电极层110之上。优选的，所述谷丙转氨酶电化学传感器包括间隔层200和亲水层300，所述亲水层300、间隔层200和所述绝缘性基板100自上而下叠加设置。所述亲水层300、间隔层200和所述绝缘性基板100之间可以围成凹陷的反应池101，所述反应试剂膜可以设置于所述反应池101内的所述绝缘性基板100的表面。所述间隔层200可以为双面胶层。优选的，所述亲水层300设有与所述反应池101连通的第一通气孔310。在一个实施例中，所述亲水层300上还设有标签层400。所述标签层400设有与所述第一通气孔310连通的第二通气孔410。所述第一通气孔310和所述第二通气孔410对应设在所述反应池101的上方，且与所述反应池101连通，从而在所述主流道102与所述反应池101之间形成了虹吸通道，在加样端加样时，利用虹吸效应，可以将样本溶液从加样端直接吸入至所述反应池101中，原主流道102、分支流道103和反应池101中的气体可以经由所述第一通气孔310和所述第二通气孔410排出。本发明实施例还提供一种谷丙转氨酶的检测方法，采用所述的谷丙转氨酶电化学传感器，并包括以下步骤：测定已知谷丙转氨酶浓度的样本在所述第一组合物形成的第一所述反应试剂层中的第一电流值以及在所述第二组合物形成的第二所述反应试剂层中的第二电流值，将所述第二电流值减去所述第一电流值得到相对电流值；按照一定谷丙转氨酶浓度梯度测定所述相对电流值，得到谷丙转氨酶浓度和所述相对电流值的标准曲线；测定待测样本的所述相对电流值；以及将所述待测样本的所述相对电流值代入所述标准曲线，得到所述待测样本中的谷丙转氨酶的浓度。实施例按照表1和表2配置第一组合物和第二组合物：表1第一组合物组分表2第二组合物组分组分含量水1000mlph为5-8的tris-hcl1.5g氯化钠1gpeg80001g纤维素1g二氧化硅1gtritonx-1002.5gα-酮戊二酸1gl-丙氨酸1g丙酮酸氧化酶1g铁氰化钾2.5g提供设置有电极的绝缘基板100。绝缘基板100上设置双分支流道103和两个反应池，采用丝网印刷的方式在反应区形成工作电极和参比电极。将配置好的第一组合物和第二组合物分别点在不同反应区内，将工作电极覆盖。将设置有第一组合物和第二组合物的绝缘基板100在50℃下烘干，使分别形成第一反应试剂层和第二反应试剂层。将设置有烘干后的反应试剂层的电极用双面胶和亲水膜粘结好，钢滚压实后形成谷丙转氨酶电化学传感器试纸。将谷丙转氨酶电化学传感器试纸用滚刀切割，或者冲床冲成每个电化学传感器试纸尺寸为35mm×6mm。将谷丙转氨酶电化学传感器试纸插到测试的仪器上自动开机，分别在虹吸的吸倒处加入谷丙转氨酶的含量为20g/l；100g/l；500g/l；1000g/l的全血标准品。选用300mv电压，而且是工作电极相对于参比电极的电压为正300mv，并在室温条件下测量样本中谷丙转氨酶的含量。每个浓度的全血标准品分别进行50次重复性实验，测试出的电流值cv(变异系数)均为1％-5％范围内，每个浓度的测试平均值如下表3所示。表3各浓度谷丙转氨酶的电流值请参阅图2，根据表3测定的谷丙转氨酶浓度和电流差值的关系，得到标准曲线。标准曲线方程为：y＝0.9897x-0.2662，其中，x代表第二电流值和第一电流值的电流差值，y代表谷丙转氨酶的浓度。得到的标准曲线中，电流值转化为的浓度和谷丙转氨酶的真实浓度的偏差很小，说明本实施例的测试方法能够准确测试出谷丙胺酶的含量，并有效消除了丙酮酸的干扰。以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。当前第1页12