一种二硫化钼芯片的制备方法及应用与流程

本发明涉及生物技术检测领域，具体涉及一种二硫化钼芯片的制备方法及应用。

背景技术：

生物芯片在分子检测领域发挥了不可或缺的功能，其融合了生物学和工程学的优点。生物芯片利用微阵列技术在固相基质上连接大量生物元件，如细胞、蛋白、dna，分为主动式和被动式两种；被动式中的生化反应是通过分子的自由扩散来完成，没有人为或物理作用干涉。其相对而言具有一定的缺陷，如合成以及检测过程中的主观因素干扰、难以控制的生化反应条件和过程、检测率及精确度低。主动芯片恰恰利用了人为或物理作用干涉，改善了这些问题，对芯片上的生化反应进行有效控制，又称为芯片型实验室（labonchip），可实现高效、快速、自动化检测，但现有芯片制备工艺复杂、成本高、其灵敏性仍需要提高，本发明结合纳米材料二硫化钼制备二硫化钼芯片在高通量检测的同时能有效提高检测的灵敏性。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种基于二硫化钼芯片检测可卡因的方法。

为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供一种二硫化钼芯片的制备方法，所述方法包括以下步骤：

（1）将浓硫酸和过氧化氢溶液混合，加入固相载体，浸泡后超纯水清洗后晾干；

（2）将步骤（1）中晾干后的固相载体放入含有2%-3%的3-氨基丙基三乙氧基硅烷（aptes）与乙醇的混合液中震荡后清洗晾干，获得氨基化的固相载体；

（3）取二硫化钼、纳米金与水混合反应30分钟，加入乙二醇，搅拌后离心洗脱，得到二硫化钼金复合材料，将二硫化钼金复合材料滴加在步骤（2）中制备得到的氨基化的固相载体上，室温下反应12小时，用pbs缓冲液缓慢清洗，去除未固定的二硫化钼金，得到固定有二硫化钼金的固相载体；

（4）在步骤（3）得到的固定有二硫化钼金的固相载体上加入含有巯基修饰的核酸适配体，培育清洗后得到二硫化钼芯片。

进一步地，步骤（1）中所述的浓硫酸和过氧化氢的体积比为7:3。

进一步地，步骤（1）中所述的固相载体为载玻片或成分为二氧化硅的玻璃片。

进一步地，步骤（3）中所述的二硫化钼、纳米金、水和乙二醇的用量关系为1g：1g：1ml:1~5ml。

步骤（3）中，所用二硫化钼金复合材料的浓度为50~150μg/ml。

步骤（3）中，所述的搅拌为90℃下搅拌5h。

步骤（4）中，所述核酸适配体的序列如seqidno：1所示，核酸适配体的浓度为1~20nm。

步骤（4）中，所述的培育清洗为4℃下过夜培育后pbs缓冲液缓慢清洗。

本发明还提供一种基于制备的二硫化钼芯片检测可卡因的方法，所述方法通过二硫化钼芯片多次测定不同可卡因浓度下的荧光强度，得到标准曲线，再根据所述标准曲线检测待测可卡因浓度。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明利用二硫化钼结合纳米金形成二硫化钼金复合材料，在氨基化的固相载体上，氨基与纳米金之间相互作用固定二硫化钼金纳米复合材料，再共价连接核酸适配体，对带荧光的dna进行淬灭，随着加入可卡因浓度的不同，荧光也有对应的恢复，得到可卡因检测标准曲线，实现对可卡因浓度的检测。本发明检测方法简单、成本低、灵敏度高且具有特异性，可同时进行多样本检测，所得的结果直观，容易辨别，为高通量检测提供了一定的理论和实验基础。

附图说明

图1是实施例3中不同浓度（0-100nm）下可卡因的荧光强度变化图；

图2是实施例3中不同浓度（0-100nm）下可卡因在二硫化钼芯片下的扫描结果图；

图3是实施例4中浓度均为10nm的可卡因、腺苷、尿苷、尿酸的荧光增长图；

图4是实施例4中浓度均为10nm的可卡因、腺苷、尿苷、尿酸的芯片扫描结果图。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

将载玻片加入到体积比为7:3的浓硫酸和过氧化氢（30%）混合溶液中浸泡，，浸泡后超纯水清洗晾干，晾干后的载玻片放入含有2%的3-氨基丙基三乙氧基硅烷（aptes）的乙醇（95%）混合液中震荡清洗晾干，获得氨基化固相载体；取10g二硫化钼、10g纳米金和10ml水混合反应30分钟，加入10ml的乙二醇，在90℃下搅拌5h，后离心洗脱，得到二硫化钼金复合材料，取上述制备的二硫化钼金复合材料（浓度为50μg/ml）滴加在上述制备的氨基化固相载体上，室温下反应12小时，用pbs缓冲液缓慢清洗3次，去除未固定的二硫化钼金，得到固定有二硫化钼金的固相载体；在固定有二硫化钼金的固相载体上加入1nm含有巯基修饰的可卡因核酸适配体，所述的可卡因核酸适配体（购买于生工生物工程上海股份有限公司）经hplc纯化以及其他色谱和质谱验证，其序列如seqidno：1所示，即为：5’-sh-ccatagggagacaaggataaatccttcaatgaagtgggtctccc-cy5-3’；于4℃下过夜培育，pbs缓冲液缓慢清洗3次，得到二硫化钼芯片。

实施例2

将载玻片加入到体积比为7:3的浓硫酸和过氧化氢（30%）混合溶液中浸泡，，浸泡后超纯水清洗晾干，晾干后的载玻片放入含有2%的3-氨基丙基三乙氧基硅烷（aptes）的乙醇（95%）混合液中震荡清洗晾干，获得氨基化固相载体；取10g二硫化钼、10g纳米金和10ml水混合反应30分钟，加入50ml的乙二醇，在90℃下搅拌5h，后离心洗脱，得到二硫化钼金复合材料，取上述制备的二硫化钼金复合材料（浓度为150μg/ml）滴加在上述制备的氨基化固相载体上，室温下反应12小时，用pbs缓冲液缓慢清洗3次，去除未固定的二硫化钼金，得到固定有二硫化钼金的固相载体；在固定有二硫化钼金的固相载体上加入20nm含有巯基修饰的可卡因核酸适配体，所述的可卡因核酸适配体（购买于生工生物工程上海股份有限公司）经hplc纯化以及其他色谱和质谱验证，其序列如seqidno：1所示；于4℃下过夜培育，pbs缓冲液缓慢清洗3次，得到二硫化钼芯片。

实施例3

将浓度分别为0、1、2、5、10、20、50、100、200nm的可卡因标准溶液100μl滴加于实施例1中制备的二硫化钼芯片上，37℃下培育2h后测得不同浓度可卡因标准溶液引起的荧光强度值，得到标准曲线。图1是不同浓度下可卡因的荧光强度变化图；如图1可见，随着可卡因浓度的增加（0-200nm），传感器的荧光强度也逐渐增加。图2是不同浓度下可卡因在二硫化钼芯片下的扫描结果图；如图2可见，随着可卡因浓度（0-100nm）越大，扫描图颜色越深，荧光强度越强，肉眼可见的荧光强度变化，使得检测结果更为直观且容易辨别。

实施例4

分别将浓度均为10nm的可卡因、腺苷、尿苷、尿酸100μl滴加于制备的二硫化钼芯片上，37℃下培育2h后分别测可卡因、腺苷、尿苷、尿酸的荧光强度值。图3是浓度均为10nm的可卡因、腺苷、尿苷、尿酸的荧光增长图；由图3可见，10nm的可卡因引起的荧光强度变化很高，而类似物腺苷、尿苷及尿酸的变化不大，验证二硫化钼芯片具有对可卡因检测的特异性。图4是浓度均为10nm的可卡因、腺苷、尿苷、尿酸的芯片扫描结果图；由图4可见，二硫化钼芯片上可卡因与类似物腺苷、尿苷及尿酸具有明显的差别，证明二硫化钼芯片的选择性较好。

以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

序列表

<110>江苏大学

<120>一种二硫化钼芯片的制备方法及应用

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>44

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

ccatagggagacaaggataaatccttcaatgaagtgggtctccc44

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<120>一种二硫化钼芯片的制备方法及应用

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<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

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