一种水产品中吡虫啉代谢物检测方法与流程

本发明涉及农药残留测定技术领域，特别涉及一种水产品中吡虫啉代谢物检测方法。

背景技术：

吡虫啉（imidacloprid，简写为imi）是具有氯吡啶结构的第一代烟碱类杀虫剂的代表性药剂，其广泛应用于农业生产上，针对水稻、棉花、小麦等多种害虫有良好的治疗效果。在稻-渔综合养殖模式中，在选用吡虫啉为水稻除害虫时，吡虫啉药剂可能会进入到水产品体内，如稻-虾综合种养模式中的克氏原螯虾体内，稻-蟹综合种养模式中的螃蟹体内等。

目前，吡虫啉化学名称为1-(6-氯-3-吡啶甲基)-n-硝基咪唑-2-亚胺，其药效基团为硝基亚胺，研究表明，吡虫啉的代谢大多是药效基团上发生去烷基、去饱和化、羟基化及还原等代谢反应，从而生成5-羟基吡虫啉、烯式吡虫啉、吡虫啉脲和6-氯烟酸等代谢产物。吡虫啉的部分代谢产物，比如烯式吡虫啉，其毒性比母体吡虫啉的高约10~16倍,又比如吡虫啉羟基化后的代谢产物也有一定的杀虫活性等。因此，在稻-渔综合种养模式下，为了确保水产品及人类食品的安全，亟需建立吡虫啉代谢产物在水产品中的检测方法。

技术实现要素：

本发明实施例提供了一种水产品中吡虫啉代谢物检测方法，实现了检测水产品中吡虫啉代谢产物。

水产品中吡虫啉代谢物检测方法，包括：

采用含0.1%（v/v）乙酸的乙腈溶液对粉末状/肉泥状的待检测水产品萃取至少两次，合并上清液；

合并后的所述上清液顺序经过无水硫酸镁、脂肪酸类吸附剂以及中性氧化铝处理，得到待检测样品；

通过含0.1%（v/v）乙酸的甲醇-水溶液（8:2，v/v）定容所述待检测样品；

利用高效液相色谱-串联三重四极杆质谱仪，检测定容后的所述待检测样品，得到待检测样品的色谱数据，基于吡虫啉代谢物的标准工作曲线和所述待检测样品的色谱数据，得到所述待检测水产品中吡虫啉代谢物的含量。

优选地，

所述高效液相色谱-串联三重四极杆质谱仪中，

高效液相色谱的色谱条件包括：

长度为100mm、内径为2.1mm以及填料粒径为1.8μm的c18色谱柱；

柱温为35℃；

洗脱流动相为含0.1%（v/v）甲酸的甲醇以及含0.1%（v/v）乙酸水溶液；

进样量为10μl；

流速为0.3ml/min。

优选地，

所述高效液相色谱采用80%含0.1%（v/v）甲酸的甲醇以及20%含0.1%（v/v）乙酸水溶液等度洗脱。

优选地，

所述高效液相串联质谱仪中，

串联质谱条件包括：

离子源为加热大气压电喷雾源；

扫描方式为反应监测模式；

喷雾电压为3500v；

蒸发气温度为200℃；

鞘气和辅助气为高纯氮气，压力均为5bar；

碰撞气为高纯氩气，压力为1.5mtorr；

离子传输毛细管温度为350℃；

一极质谱扫描（q1）半峰宽为0.7da，三极质谱扫描（q3）半峰宽为0.7da。

优选地，

所述采用含0.1%（v/v）乙酸的乙腈溶液对粉末状/肉泥状的待检测水产品萃取至少两次，包括：

称取定量的粉末状/肉泥状的待检测水产品，向称取的所述待检测水产品中加入定量的已知浓度的吡虫啉-d4内标标准液，随后加入含0.1%（v/v）乙酸的乙腈溶液，涡旋混合1min，加入超纯水，涡旋混合，再加入无水硫酸镁，以及氯化钠，立即涡旋混合2min，并上下摇晃30s，以5000r/min离心5min，完成第一次萃取，取上清液，其中，待检测水产品的质量：含0.1%（v/v）乙酸的乙腈溶液的体积：水的体积：无水硫酸镁的质量：氯化钠质量=2：3：3：1：0.5，待检测水产品的质量为1.5~4g；

采用含0.1%（v/v）乙酸的乙腈溶液对第一次萃取后的沉淀物重复萃取一次。

优选地，

所述加入定量的已知浓度的吡虫啉-d4内标标准液，包括：加入50μl，100μg/l吡虫啉-d4内标标准液。

优选地，上述水产品中吡虫啉代谢物检测方法，进一步包括：

向中性氧化铝柱中顺序加入0.01g脂肪酸类吸附剂以及0.1g无水硫酸镁，得到目标处理柱；

所述合并后的所述上清液顺序经过无水硫酸镁、脂肪酸类吸附剂以及中性氧化铝处理，包括：

将合并后的所述上清液过所述目标处理柱，并收集流出液；

通过氮吹得方式，吹干所述流出液。

优选地，

所述吡虫啉代谢物，包括：5-羟基吡虫啉、吡虫啉脲和6-氯烟酸。

优选地，

上述水产品中吡虫啉代谢物检测方法，进一步包括：

制备标准储备液：分别称取吡虫啉-d4、5-羟基吡虫啉、吡虫啉脲和6-氯烟酸标准品5.00mg，置于10ml棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容，配制质量浓度为500mg/l的标准储备液，于-18℃冰箱中避光保存；

制备系列标准工作液：用含0.1%（v/v）乙酸的甲醇-水溶液（8:2，v/v）稀释含有吡虫啉-d4的5-羟基吡虫啉、吡虫啉脲和6-氯烟酸标准储备液，分别配制质量浓度为0.5~200µg/l的系列标准工作液；

利用所述高效液相色谱-串联三重四极杆质谱仪，检测所述质量浓度为0.5~200µg/l的系列标准工作液，得到标准品的色谱数据；

利用所述标准品的色谱数据，拟合出所述标准工作曲线。

优选地，

所述高效液相串联质谱仪中，

串联质谱条件进一步包括：

所述5-羟基吡虫啉对应的质谱参数包括：离子化模式为正离子模式，母离子为260.0m/z，子离子为179/213m/z，碰撞能量为19/19ev；

所述吡虫啉脲对应的质谱参数包括：离子化模式为正离子模式，母离子为272.0m/z，子离子为126/128m/z，碰撞能量为24/18ev；

所述6-氯烟酸对应的质谱参数包括：离子化模式为正离子模式，母离子为156.1m/z，子离子为112/35.1m/z，碰撞能量为13/26ev。

优选地，

所述系列标准工作液中，所述5-羟基吡虫啉的浓度范围为5.0-200µg/l、所述吡虫啉脲的浓度范围为0.5-100µg/l和所述6-氯烟酸的浓度范围为2.0-100µg/l。

本发明实施例提供了一种水产品中吡虫啉代谢物检测方法，该水产品中吡虫啉代谢物检测方法包括：采用含0.1%（v/v）乙酸的乙腈溶液对粉末状/肉泥状的待检测水产品萃取至少两次，合并上清液，以尽可能完整地萃取出水产品中的吡虫啉代谢物；合并后的上清液顺序经过无水硫酸镁、脂肪酸类吸附剂以及中性氧化铝处理，得到待检测样品，能够去掉干扰物；通过含0.1%（v/v）乙酸的甲醇-水溶液（8:2，v/v）定容待检测样品；利用高效液相色谱-串联三重四极杆质谱仪，检测定容后的待检测样品，得到待检测样品的色谱数据，基于吡虫啉代谢物的标准工作曲线和待检测样品的色谱数据，得到待检测水产品中吡虫啉代谢物的含量，实现了对水产品中吡虫啉代谢物检测。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明一个实施例提供的水产品中吡虫啉代谢物检测方法的流程图；

图2是本发明一个实施例提供的不同流动相下获得的5-羟基吡虫啉色谱图；

图3是本发明另一个实施例提供的不同流动相下获得的吡虫啉脲色谱图；

图4是本发明一个实施例提供的不同流动相下获得的6-氯烟酸色谱图；

图5是本发明一个实施例提供的不同萃取剂下克氏原螯虾中吡虫啉及其代谢物的提取效果图；

图6是本发明一个实施例提供的不同净化条件对克氏原螯虾中吡虫啉及其代谢物的影响效果图；

图7是本发明一个实施例提供的5-羟基吡虫啉加标样品的色谱图；

图8是本发明一个实施例提供的吡虫啉脲加标样品的色谱图；

图9是本发明一个实施例提供的6-氯烟酸加标样品的色谱图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明实施例所提及的水产品是指稻-渔混养模式养殖出的水产品如克氏原螯虾、稻蟹、泥鳅、黄鳝、甲鱼等。粉末状/肉泥状的待检测水产品可以为水产品所有组织的混合物，比较优选地，粉末状/肉泥状的待检测水产品为去除头、尾以及壳后的水产品的肌肉部分。

如图1所示，本发明一个实施例提供的水产品中吡虫啉代谢物检测方法，该方法可包括如下步骤：

步骤101：采用含0.1%（v/v）乙酸的乙腈溶液对粉末状/肉泥状的待检测水产品萃取至少两次，合并上清液；

步骤102：合并后的上清液顺序经过无水硫酸镁、脂肪酸类吸附剂以及中性氧化铝处理，得到待检测样品；

步骤103：通过含0.1%（v/v）乙酸的甲醇-水溶液（8:2，v/v）定容待检测样品；

步骤104：利用高效液相色谱-串联三重四极杆质谱仪，检测定容后的待检测样品，得到待检测样品的色谱数据，基于吡虫啉代谢物的标准工作曲线和待检测样品的色谱数据，得到待检测水产品中吡虫啉代谢物的含量。

可以理解地，v/v表征体积比，比如含0.1%（v/v）乙酸的乙腈溶液即为乙酸与乙腈的体积比为0.1%：1。含0.1%（v/v）乙酸的甲醇-水溶液（8:2，v/v）即为乙酸与甲醇-水溶液体积比为0.1%：1，且甲醇-水溶液中甲醇与水的体积比为8：2。另外，上述含0.1%（v/v）乙酸的乙腈溶液以及含0.1%（v/v）乙酸的甲醇-水溶液（8:2，v/v）在配置过程中选用色谱纯级别的乙酸、乙腈以及甲醇。

本发明实施例提供的检测方法中使用的高效液相色谱-串联三重四极杆质谱仪检测过程可为，可基于标准曲线标准溶液中标准目标物的出峰面积与标准目标物浓度之间的关系构建出，标准目标物的出峰面积与标准目标物浓度之间的标准工作曲线，将待检测样品中目标物的峰面积代入标准工作曲线中即可计算得到待检测样品中目标物的浓度。

但是，由于待检测样品处理过程以及检测误差，使得上述基于标准目标物的出峰面积与标准目标物浓度构建出的标准工作曲线存在一定的偏差，那么，基于该标准工作曲线计算出的待检测样品中目标物的浓度也会存在偏差。较优选地，检测方法中使用的高效液相色谱-串联三重四极杆质谱仪检测过程还可为，通过添加目标物对应的内标物，以内标物的峰面积/峰高和内标物的量与标准目标物的峰面积/峰高和标准目标物的量计算校正因子，利用校正因子、待测样品内的内标物的峰面积/峰高和内标物的量以及待测样品内的目标物的峰面积/峰高，计算待测样品内的目标物的量。

但是利用校正因子计算相对比较复杂，更优选地，检测方法中使用的高效液相色谱-串联三重四极杆质谱仪检测过程还可为，通过添加目标物对应的内标物，检测至少三种标准目标物的浓度以及内标物的固定浓度对应的峰高/峰面积，以标准目标物的浓度与内标物的固定浓度的比值为一个自变量，标准目标物的浓度对应的峰面积/峰高与内标物对应的峰面积/峰高的比值为另一自变量，通过至少三组（一个自变量，另一自变量）进行线性回归拟合标准工作曲线，待测样品内的内标物的峰面积/峰高与待测样品内的目标物的峰面积/峰高的比值代入上述标准工作曲线，得到待测样品内的内标物的已知浓度与待测样品内的目标物的浓度的比值，根据待测样品内的内标物的已知浓度与待测样品内的目标物的浓度的比值和待测样品内的内标物的已知浓度，即可得到待测样品内的目标物的浓度。

即：优选地，吡虫啉代谢物的标准工作曲线中的两个变量分别为：吡虫啉代谢物的色谱峰面积与内标物的色谱峰面积的比值以及吡虫啉代谢物与内标物浓度的比值。

在本发明实施例中，检测的吡虫啉代谢物，包括：5-羟基吡虫啉、吡虫啉脲和6-氯烟酸。因此，针对本发明实施例来说，上述标准目标物是为5-羟基吡虫啉标准品、吡虫啉脲标准品和6-氯烟酸标准品，上述待检测样品中目标物是指待检测样品中的5-羟基吡虫啉、吡虫啉脲和6-氯烟酸。

另外，通过采用含0.1%（v/v）乙酸的乙腈溶液对粉末状/肉泥状的待检测水产品萃取至少两次，合并上清液；合并后的上清液顺序经过无水硫酸镁、脂肪酸类吸附剂以及中性氧化铝处理，得到待检测样品，能够使吡虫啉代谢物萃取比较完全，同时比较好的去除吡虫啉代谢物掺杂的脂肪酸等杂质，尽可能的降低了杂质对检测的干扰，从而保证了吡虫啉代谢物检测的准确性。

在本发明实施例中，选择的内标物为吡虫啉-d4，即吡虫啉中的四个h原子被四个氘原子取代。

针对检测水产品中吡虫啉代谢物所使用的高效液相色谱-串联三重四极杆质谱仪来说，高效液相色谱的色谱条件包括：长度为100mm、内径为2.1mm以及填料粒径为1.8μm的c18色谱柱；柱温为35℃；洗脱流动相为含0.1%（v/v）甲酸的甲醇以及含0.1%（v/v）乙酸水溶液；进样量为10μl；流速为0.3ml/min。更加优选地，上述c18色谱柱为hsst3c18柱(100*2.1mm1.8μm)。

更加优选地，高效液相色谱采用80%含0.1%（v/v）甲酸的甲醇以及20%含0.1%（v/v）乙酸水溶液等度洗脱。

另外，针对检测水产品中吡虫啉代谢物所使用的高效液相色谱-串联三重四极杆质谱仪来说，串联质谱条件包括：离子源为加热大气压电喷雾源；扫描方式为反应监测模式；喷雾电压为3500v；蒸发气温度为200℃；鞘气和辅助气为高纯氮气，压力均为5bar；碰撞气为高纯氩气，压力为1.5mtorr；离子传输毛细管温度为350℃；一极质谱扫描（q1）半峰宽为0.da，三极质谱扫描（q3）半峰宽为0.7da。

进一步地，串联质谱条件中的质谱参数可进一步如下表1所示：

表1

为了以内标物标定待检测水产品中吡虫啉代谢物的量，需要保证在待检测水产品处理过程中，内标物的损失与待检测水产品中吡虫啉代谢物基本一致，上述步骤101的具体实施方式可为，称取定量的粉末状/肉泥状的待检测水产品，向称取的所述待检测水产品中加入定量的已知浓度的吡虫啉-d4内标标准液，随后加入含0.1%（v/v）乙酸的乙腈溶液，涡旋混合1min，加入超纯水（该超纯水是指电阻率不大于18.2mω·cm的水），涡旋混合，再加入无水硫酸镁，以及氯化钠，立即涡旋混合2min，并上下摇晃30s，以5000r/min离心5min，完成第一次萃取，取上清液，其中，待检测水产品的质量：含0.1%（v/v）乙酸的乙腈溶液的体积：水的体积：无水硫酸镁的质量：氯化钠质量=2：3：3：1：0.5，待检测水产品的质量为1.5~4g；采用含0.1%（v/v）乙酸的乙腈溶液对第一次萃取后的沉淀物重复萃取一次。

上述加入定量的已知浓度的吡虫啉-d4内标标准液优选地为：加入50μl，100μg/l吡虫啉-d4内标标准液。

上述合并后的上清液顺序经过无水硫酸镁、脂肪酸类吸附剂以及中性氧化铝处理，可以有两种方式：

方式一：上清液先与无水硫酸镁混匀（优选旋涡混匀），离心取上清液，将离心后的上清液与脂肪酸类吸附剂混匀（优选旋涡混匀），再次离心取上清液，再次离心后的上清液过中性氧化铝柱，收集流出液。

方式二：向中性氧化铝柱中顺序加入0.01g脂肪酸类吸附剂以及0.1g无水硫酸镁，得到目标处理柱；将合并后的上清液过所述目标处理柱，并收集流出液；通过氮吹得方式，吹干所述流出液。

上述方式二能够减少待检测样品的损失，因此上述方式二为本发明实施例中优选地处理方式。

一般来说，系列标准工作液的配置方式将直接影响检测的准确性，本发明实施例所选用的系列标准工作液的配置方式能够保证检测结果的准确性。该系列标准工作液的配置方式包括：制备标准储备液以及制备系列标准工作液，其中，

制备标准储备液：分别称取吡虫啉-d4、5-羟基吡虫啉、吡虫啉脲和6-氯烟酸标准品5.00mg，置于10ml棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容，配制质量浓度为500mg/l的标准储备液，于-18℃冰箱中避光保存；

制备系列标准工作液：用含0.1%（v/v）乙酸的甲醇-水溶液（8:2，v/v）稀释含有吡虫啉-d4的5-羟基吡虫啉、吡虫啉脲和6-氯烟酸标准储备液，分别配制质量浓度为浓度范围为5.0-200µg/l的5-羟基吡虫啉、浓度范围为0.5-100µg/l的吡虫啉脲和浓度范围为2.0-100µg/l的6-氯烟酸的系列标准工作液。

利用高效液相色谱-串联三重四极杆质谱仪，检测质量浓度为0.5~200µg/l的系列标准工作液，得到标准品的色谱数据；利用标准品的色谱数据，拟合出标准工作曲线。

下面以几个实施例对水产品中吡虫啉代谢物检测方法进行详细说明。

实施例1：针对高效液相色谱-串联三重四极杆质谱仪的色谱条件的优化

首选，色谱柱采用behc18（100mm×2.1mm，3.5μm，美国waters公司），比较了甲醇-水溶液（8:2，v/v）和含0.1%（v/v）乙酸的甲醇-水溶液（8:2，v/v）分别作为流动相，对5-羟基吡虫啉、吡虫啉脲和6-氯烟酸峰形以及灵敏度的影响，如图2至图4所示的不同流动相对比色谱图。从图2至图4的对比色谱图中可以看出，含0.1%（v/v）乙酸的甲醇-水溶液（8:2，v/v）作为流动相，能够得到比较好的峰形。

另外，试验比较了behc18（100mm×2.1mm，3.5μm，美国waters公司）和hsst3（100mm×2.1mm，1.8μm，美国waters公司）两种色谱柱。以5-羟基吡虫啉为例，采用behc18色谱柱，其在1.0min左右出峰，该柱子对5-羟基吡虫啉保留效果较差，其他化合物情况类似。而hsst3色谱柱对这几种化合物的保留要强一些，相同流动相条件下，5-羟基吡虫啉、吡虫啉脲和6-氯烟酸在4.0-6.0min之间出峰，且有出峰时间有差，有利于这几种物质的分离，且灵敏度较高，峰形较好，因此试验选择hsst3色谱柱作为分离柱。

实施例2：提取溶剂的选择

本试验采用了乙腈、含0.1%（v/v）乙酸的乙腈、乙酸乙酯和含0.1%（v/v）乙酸的乙酸乙酯分别作为萃取剂，比较了克氏原螯虾中吡虫啉及其代谢物的提取效果如图5所示。结果表明，采用乙酸乙酯和含0.1%（v/v）乙酸的乙酸乙酯作为萃取剂，5-羟基吡虫啉、吡虫啉脲和6-氯烟酸回收率较低，均不能满足回收的要求。乙腈与含0.1%（v/v）乙酸的乙腈分别作为萃取剂，5-羟基吡虫啉、吡虫啉脲和6-氯烟酸在含0.1%（v/v）乙酸的乙腈作为萃取剂时回收率高，均在80%以上，因此，采用含0.1%（v/v）乙酸的乙腈对5-羟基吡虫啉、吡虫啉脲和6-氯烟酸进行萃取。

另外，采用含0.1%（v/v）乙酸的乙腈作为萃取剂分别萃取稻蟹、甲鱼等中的5-羟基吡虫啉、吡虫啉脲和6-氯烟酸，其萃取回收率也均不低于75%。

实施例3：净化条件的优化

使用中性氧化铝柱、psa、gcb、中性氧化铝柱+psa、中性氧化铝柱+gcb分别净化实施例2

采用含0.1%（v/v）乙酸的乙腈作为萃取剂萃取出的萃取液的浓缩物。如图6所示，采用中性氧化铝柱并且配合使用psa吸附剂净化，5-羟基吡虫啉、吡虫啉脲和6-氯烟酸回收率均在80%以上，且杂质干扰较低，效果最佳，因此试验采用中性氧化铝柱和psa一起作为净化材料。

实施例4：拟合标准工作曲线

制备标准储备液：分别称取吡虫啉-d4、5-羟基吡虫啉、吡虫啉脲和6-氯烟酸标准品5.00mg，置于10ml棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容，配制质量浓度为500mg/l的标准储备液，于-18℃冰箱中避光保存；

制备系列标准工作液：用含0.1%（v/v）乙酸的甲醇-水溶液（8:2，v/v）稀释含有吡虫啉-d4的5-羟基吡虫啉、吡虫啉脲和6-氯烟酸标准储备液，分别配制系列标准工作液，该系列标准工作液中5-羟基吡虫啉的浓度范围为5.0-200µg/l、吡虫啉脲的浓度范围为0.5-100µg/l和6-氯烟酸的浓度范围为2.0-100µg/l；

利用高效液相色谱-串联三重四极杆质谱仪，分别检测系列标准工作液，得到5-羟基吡虫啉、吡虫啉脲、6-氯烟酸以及吡虫啉-d4的色谱图；

从上述每种浓度的标准工作液的色谱图中分别得到5-羟基吡虫啉、吡虫啉脲、6-氯烟酸以及吡虫啉-d4的色谱峰面积，分别以上述五种不同浓度的标准工作液中的5-羟基吡虫啉、吡虫啉脲以及6-氯烟酸色谱峰面积与吡虫啉-d4内标物色谱峰面积的比值（即5-羟基吡虫啉色谱峰面积与吡虫啉-d4内标物色谱峰面积的比值，吡虫啉脲色谱峰面积与吡虫啉-d4内标物色谱峰面积的比值，6-氯烟酸色谱峰面积与吡虫啉-d4内标物色谱峰面积的比值）分别作为标准工作曲线的纵坐标y1、y2、y3，以上述五种不同浓度的系列标准工作液中的5-羟基吡虫啉、吡虫啉脲以及6-氯烟酸各自的浓度作为标准工作曲线的横坐标x1、x2、x3，将以上检测所得的五种不同浓度的数据进行线性回归，拟合得到5-羟基吡虫啉对应的标准工作曲线为y1=a*x1+b，吡虫啉脲对应的标准工作曲线为y2=c*x2+d，6-氯烟酸对应的标准工作曲线为y3=e*x3+f，并且得系数a、b、c、d、e、f；该标准工作曲线以及系数a、b、c、d、e、f需要每次检测之前重新测定。即该实施例4为一段时间内检测水产品中吡虫啉代谢物必须执行的步骤。该一段时间内一般是指高效液相色谱-串联三重四极杆质谱仪的一次开机到关机的时间段内。

上述高效液相色谱-串联三重四极杆质谱仪中，

高效液相色谱的色谱条件包括：长度为100mm、内径为2.1mm以及填料粒径为1.8μm的hsst3c18色谱柱；柱温为35℃；洗脱流动相为含0.1%（v/v）甲酸的甲醇以及含0.1%（v/v）乙酸水溶液；进样量为10μl；流速为0.3ml/min；其中，洗脱方式为采用80%含0.1%（v/v）甲酸的甲醇以及20%含0.1%（v/v）乙酸水溶液等度洗脱。

串联质谱条件包括：离子源为加热大气压电喷雾源；扫描方式为反应监测模式；喷雾电压为3500v；蒸发气温度为200℃；鞘气和辅助气为高纯氮气，压力均为5bar；碰撞气为高纯氩气，压力为1.5mtorr；离子传输毛细管温度为350℃；一极质谱扫描（q1）半峰宽为0.7da，三极质谱扫描（q3）半峰宽为0.7da。另外，串联质谱更详细的参数如上述表1所示。

针对实施例4给出的检测数据，以3倍信噪比作为仪器检出限，10倍信噪比作为仪器定量限。实施例4得到的回归方程、线性相关系数、仪器检出限和定量限见表2，从表2可以直观的看出，采用本方法检测，以目标物面积与内标物峰面积之比为纵坐标，对应质量浓度为横坐标进行线性拟合，绘制标准工作曲线，结果表明，5-羟基吡虫啉在5.0-200μg/l浓度范围内、吡虫啉脲在0.5-100μg/l浓度范围内和6-氯烟酸在2.0~100μg/l浓度范围内，线性关系良好，相关系数r＞0.9900。

表2

实施例5：基于实施例4给出的标准工作曲线，检测克氏原螯虾中吡虫啉代谢物（5-羟基吡虫啉、吡虫啉脲以及6-氯烟酸）

克氏原螯虾去头、去壳、去虾线，取可食肌肉部分，处理成不大于0.5cm×0.5cm×0.5cm的小块后，混匀，用高速搅碎机充分搅匀，密封，标记，于-18℃冷冻保存，备用；

称取(2.00±0.01)g肉泥状的待检测克氏原螯虾样品，移取50μl，100μg/l吡虫啉-d4内标标准液加入待检测克氏原螯虾样品中，随后加入3ml含0.1%（v/v）乙酸的乙腈溶液，涡旋混合1min，加入超纯水，涡旋混合，再加入1.0g无水硫酸镁，以及0.5g氯化钠，立即涡旋混合2min，并上下摇晃30s，以5000r/min离心5min，完成第一次萃取，取上清液采用含0.1%（v/v）乙酸的乙腈溶液对第一次萃取后的沉淀物重复萃取一次；

向中性氧化铝柱中顺序加入0.01g脂肪酸类吸附剂以及0.1g无水硫酸镁，得到目标处理柱；将合并后的上清液过所述目标处理柱，并收集流出液；通过氮吹得方式，吹干流出液，得到待检测样品；通过含0.1%（v/v）乙酸的甲醇-水溶液（8:2，v/v）定容所述待检测样品；

利用高效液相色谱-串联三重四极杆质谱仪，检测定容后的待检测样品，得到待检测样品的色谱数据，基于吡虫啉代谢物的标准工作曲线和待检测样品的色谱数据，得到待检测水产品中吡虫啉代谢物的含量；

在该实施例中，高效液相色谱-串联三重四极杆质谱仪的高效液相色谱的色谱条件和串联质谱条件与上述实施例4给出的一致，在此不再赘述。

针对实施例5，考察了基质效应，该基质效应采用公式基质效应（me）=（基质匹配标准曲线的斜率/标准工作曲线斜率）×100%考察方法的基质效应，结果如表3所示。该值在80-120%范围内基质效应不明显，5-羟基吡虫啉、吡虫啉脲和6-氯烟酸在克氏原螯虾基质中的基质效应为84.6-93.5%。另外，在最低添加水平下，以3倍和10倍信噪比结合浓度外推法确定方法检出限和定量限，5-羟基吡虫啉、吡虫啉脲和6-氯烟酸的方法检出限(mod)和方法定量限(moq)见表3。

表3

实施例6：基于实施例5给出的克氏原螯虾样品的检测方法，检测该检测方法的回收率及重现性

在克氏原螯虾样品中添加高、中、低三种浓度，每个添加水平同时做7个平行样品，按照实施例5个出的处理方法进行处理，并以实施例4给出的分析条件进行检测，5-羟基吡虫啉加标样品的色谱图如图7所示、吡虫啉脲加标样品的色谱图如图8所示和6-氯烟酸加标样品的色谱图如图9所示。从图7、图8以及图9可以看出，该检测方法能够比较好的5-羟基吡虫啉、吡虫啉脲和6-氯烟酸的获得色谱峰。另外，加标检测结果如表4所示。表4的结果表明，5-羟基吡虫啉、吡虫啉脲和6-氯烟酸的平均回收率为69.5％-109.5％，相对标准偏差为6.38％-14.82％，该方法具有较好的回收率和重现性，从而提高检测结果的准确度，消除系统误差。

表4（n=7）

上述各个实施例，至少能够达到如下有益效果：

1.在本发明实施例中，采用含0.1%（v/v）乙酸的乙腈溶液对粉末状/肉泥状的待检测水产品萃取至少两次，合并上清液，以尽可能完整地萃取出水产品中的吡虫啉代谢物；合并后的上清液顺序经过无水硫酸镁、脂肪酸类吸附剂以及中性氧化铝处理，得到待检测样品，能够去掉干扰物；通过含0.1%（v/v）乙酸的甲醇-水溶液（8:2，v/v）定容待检测样品；利用高效液相色谱-串联三重四极杆质谱仪，检测定容后的待检测样品，得到待检测样品的色谱数据，基于吡虫啉代谢物的标准工作曲线和待检测样品的色谱数据，得到待检测水产品中吡虫啉代谢物的含量，实现了对水产品中吡虫啉代谢物检测。

2.在本发明实施例中，对待检测水产品的处理方法以及内标物的选择，使得5-羟基吡虫啉、吡虫啉脲和6-氯烟酸的识别更为准确，分析时间短、干扰小，内标定量适宜特异性强、准确度和灵敏度高，同时，回收率，检测限和精密度等各项技术指标均符合要求，同时，该检测水产品中5-羟基吡虫啉、吡虫啉脲和6-氯烟酸的方法，重现性良好，且加样回收率良好，从而提高检测结果的准确度，消除系统误差。

需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个······”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同因素。

还需要说明的是，以上所述仅为本发明的较佳实施例，仅用于说明本发明的技术方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换、改进等，均包含在本发明的保护范围内。