一种基于固体核磁共振技术检测RNA结构的方法与流程

本发明涉及生物大分子结构检测领域，尤其涉及一种基于固体核磁共振技术检测rna结构的方法。

背景技术：

rna是生物体内必需的生物大分子，广泛存在于病毒、原核生物、真核生物中。rna在传递遗传信息、调控基因表达、抵御和治疗疾病等方面发挥着重要的作用(crickf,nature,1970,227，561-3；mehdizadehaghdame,etal.,gene,2016,0378111916305613；wangj,etal.,oncotargets&therapy,2016,9,681；fangy,fullwoodmj.,genomicsproteomics&bioinformatics,2016,14(1):42-54.)。rna功能的多样性与其rna复杂的空间结构密切相关(mortimersa,etal.,naturereviewsgenetics,2014,15，469-479.)。rna结构研究的实验技术主要包括x-ray晶体衍射技术、液体核磁共振技术和低温冷冻电镜技术。近年来rna结构发展迅速，但与蛋白质相比，rna结构研究的进展仍然落后于蛋白质结构的研究，已有的三维结构数据信息非常有限。据统计(http://www.rcsb.org，截止至2018年4月28日)，已知的rna结构总量仅为已知蛋白质结构总量的1％。因此发展新型的rna结构解析技术尤为重要。

固态核磁共振技术是rna研究的新技术，可以在结晶或沉淀的rna中获取rna的结构信息(riedelk,etal.,journalofbiomolecularnmr,2005,31,49-57；marchankaa,simonb,carlomagnot.angewandtechemieinternationaledition,2013,52,9996-10001.)、分析rna动态性质(olsengl,etal.,journaloftheamericanchemicalsociety,2010,132,303-308.)等；对于大分子量rna(leppert,j.nucleicacidsresearch,2004,32,1177-1183.)以及rna－蛋白相互作用等领域(carlomagno,teresa.journalofmagneticresonance,2014,241,126-136.)，也有独特的优势。因此，固体核磁研究rna的实验方法是传统rna结构解析技术的有效补充。

在rna固体核磁实验设计中，通常在魔角旋转(magicanglespinning)的条件下结合交叉极化方法(crosspolarization,cp)实现磁共振信号在不同磁性原子核之间的转移(pines,a.thejournalofchemicalphysics,1973,59,569.)；既可以实现低灵敏核的信号增强，也可以实现异核低灵敏原子核之间的磁共振极化量的转移，实现化学位移相关谱的建立。利用交叉极化脉冲序列，设计复杂的信号传递途径，将同核或异核的原子核串联起来，可以获取原子核之间的长程距离相关，得到重要的结构信息，因此多用于多维固体核磁共振实验的设计中。以n-c(或c-n)传递为例，常用的固体核磁共振实验方法，2dspecific¹⁵n-¹³ccp方法通常用于构建rna二维¹⁵n-¹³c相关谱(langea,lucas,baldusm.journaloftheamericanchemicalsociety,2002,124(33):9704-9705.)，可以实现芳香环内部n核和c核之间信号的传递，如尿嘧啶中n1-c2、n1-c6、n3-c2和n3-c4之间的传递，或构建¹³c化学位移选择性过滤的二维¹h-¹⁵n相关谱等。

在cp传递中，由于传递的效率与传递原子核之间的距离成反比，并且与传递原子核磁旋比相关，因此¹³c-¹⁵n之间的传递效率往往低于¹h-x(x＝¹³c或¹⁵n)的传递效率。此外，在魔角旋转条件下，cp传递必须满足hartmann-hahn条件(hartmanns,hahne.physrev,1962,128(5):2042-2053.)。在高转速(如40khzmas)条件下，低灵敏核之间cp的匹配条件更为苛刻。

技术实现要素：

为了获得核糖核苷酸碱基中氨基、亚氨基上的¹h原子和碱基上¹³c之间的相关信息，需要收集经过¹⁵n过滤的2d¹h-¹³c相关谱。传统的hcnh脉冲序列，通过¹h-¹³ccp实现¹³c的极化，并纪录¹³c的化学位移，然后将¹³c信号传递到相邻的¹⁵n原子，再由¹⁵n原子将信号传给直接相连的¹h原子，进行¹h化学位移记录。然而该序列传递效率较低，原因有两点：(1)cp传递的两核之间需要满足hartmann-hahn条件，即两核(i和s)的射频频率(rf)需要满足公式：ωi±ωs＝nωr，ωr代表魔角旋转的频率，n为整数，ωi、ωs代表两核的射频频率。在高速魔角旋转条件下，¹³c与¹⁵n之间传递的频率条件较难匹配，并且化学位移各向异性使得¹³c-¹⁵n传递受到激发相位的影响，实验中优化匹配条件更难。(2)cp传递的效率与原子核磁旋比相关，¹h的磁旋比是¹³c的4倍，是¹⁵n的10倍，因此¹h-x(x＝¹³c、¹⁵n)之间的传递效率高，而¹³c-¹⁵n之间的cp传递效率低。

针对上述现有技术中存在的问题与不足，本发明提供了一种基于固体核磁共振技术检测rna结构的方法，通过设定一种新型hchnh脉冲序列，不仅可以获得与hcnh相同的2d¹h-¹³c相关谱，而且大幅提高了磁化转移的效率，提高了二维谱图信号的灵敏度。hchnh序列在hcnh序列的基础上，改进传递效率低的¹³c-¹⁵ncp传递，变为连续的两个含有氢原子核的cp传递，即¹³c-¹h和¹h-¹⁵n传递。利用¹h的辅助，先将¹³c信号传递给¹h，再通过¹h将信号传给¹⁵n，实现了高效的磁共振极化率的传递，将信号灵敏度提高了60％。

本发明通过如下技术方案实现：

一种基于固体核磁共振技术检测rna结构的方法，包括以下步骤：

(1)待测rna样品的制备，所述rna样品中至少一种碱基由¹⁵n和¹³c标记；

(2)使用固体核磁共振波谱仪对rna样品进行检测；

(3)检测图谱的收集与分析；其中，

步骤(2)中在使用固体核磁共振波谱仪对rna样品进行检测之前，首先进行脉冲序列hchnh的设定(如图2所示)：首先将¹h信号全部激发，¹h-¹³ccp实现低灵敏度¹³c核的极化，以及化学位移记录，设定接触时间为1ms-10ms，；在¹³c化学位移演化过程中，采用tppm脉冲对¹h去耦；之后¹³c-¹hcp将¹³c极化量转移给¹h原子，再由¹h-¹⁵ncp传递给¹⁵n核，设定接触时间为100μs-1000μs，最后将¹⁵n信号传回与¹⁵n核直接相连的¹h原子核，记录¹h化学位移。

进一步地，步骤(1)中所述rna样品的制备包括通过体外转录法、固相合成方法或生物提取法得到的¹³c、¹⁵n同位素标记的rna样品。所述rna样品纯度在90％以上，固体样品中rna质量大于1mg。

进一步地，步骤(3)中所述检测图谱包括一维¹h-¹⁵ncp谱图，一维¹h-¹³ccp谱图，一维¹h-³¹pcp谱图，二维¹h-¹⁵nhnh谱图，二维¹h-¹³chch谱图，二维¹³c-¹⁵nhnc谱图，二维¹h-¹⁵nhcnh谱图，二维¹h-¹⁵nhcn(par)nh谱图，二维¹⁵n-¹³ctedor谱图，二维¹³c-¹³cdarr谱图。

相较于现有技术，本发明的有益效果如下：

本发明提供了一种基于固体核磁共振技术检测rna结构的方法，通过一种新型二维固体核磁脉冲序列hchnh，实现了¹h-¹³c相关谱的建立，并建立了rna碱基内部原子的长程相关。hchnh脉冲序列利用两个高传递效率的¹³c-¹h和¹h-¹⁵ncp传递，代替传统的低传递效率的¹³c-¹⁵n传递，实现长程¹³c-¹h相关谱的建立，并用于经典和非经典配对信息的获取。以尿嘧啶(uracil,记做u)为例，信号传递过程如图1所示，第一个¹h-¹³ccp首先实现低灵敏度¹³c核的激发，随后进行化学位移记录，随后将¹³c信号传递给¹h原子核，再由¹h原子将信号传递给临近的¹⁵n原子核；最后传递回¹h原子，进行¹h化学位移纪录。hchnh脉冲序列中，所有的信号传递均通过交叉极化脉冲序列完成。与常用的hcnh序列不同，hchnh利用两个高效率的包含氢原子核的cp传递方法代替¹³c-¹⁵ncp传递，在高转速固体核磁的条件下，灵敏度提高60％以上。基于hchnh脉冲序列的rna结构固体核磁共振技术检测还可以实现区分rna中沃森-克里克碱基配对和非沃森-克里克碱基配对，例如：u-u和g-u配对等，拓展了固体核磁共振技术在解析rna结构方面的应用。

附图说明

图1为以尿嘧啶为例hchnh脉冲序列的信号传递方式；

图2为hchnh脉冲序列示意图；

图中：φ2＝y,y,y,y,-y,-y,-y,-y；φrec＝y,-y,-y,y,-y,y,y,-y；t1:演化期；t2:采集期；

图3为本发明一实施例humantrna^sec(pdb:3a3a)结构模型；

图4为本发明一实施例u-labeledtrna的二维hchnh谱(4a)和hnch谱(4b)；(4c)一维hchnh¹h谱与一维hcnh¹h谱的比较；(4d)一维hcnh¹h谱与一维hnh¹h谱的比较。

具体实施方式

以下将结合实施例对本发明做进一步说明，所举实施例并不用于限制本发明。对于本领域技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原理之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的权利要求范围之内。

实施例1

1.rna样品的制备：

本实施例以人源的硒代半胱氨酸转运rna(humantrna^sec)为模型进行脉冲序列的测试。该rna由92个核糖核苷酸构成，结构如图3所示。为了简化谱图信息，在体外转录时，本实施例仅使用了¹⁵n,¹³c标记的三磷酸尿苷(utp)，其余三种核苷三磷酸(atp、ctp、utp)均为天然丰度。合成的rna记作u-labeledtrna。

(1)dna模板的构建

本实施例通过体外转录方法得到u-labeledtrna，首先需要根据目标rna设计相应的dna模板。dna模板由两条互补的dna单链组成，分别为正向链(r链)和反向链(f链)，序列如下：

r链：5’-tggcgcccgaaaggtggaattgaaccactctgtcgctagacagctacaggtttgaagcctgcaccccagaccactgaggatcatccgggccctatagtgagtcgtattaa-3’

f链：5’-ttaatacgactcactatagggcccggatgatcctcagtggtctggggtgcaggcttcaaacctgtagctgtctagcgacagagtggttcaattccacctttcgggcgcca-3’

两条dna单链经过离心、溶解、升温退火等过程，形成线性化的双链dna模板(终浓度为25μm)。

(2)体外转录制备rna样品

本实施例通过10ml的体外转录体系得到rna样品：在50ml离心管中依次加入5.3mldepc处理水，500μl100mm¹³c,¹⁵n同位素标记的utp，100mm天然丰度的atp、gtp、ctp各500μl，1mltrisbuffer(含400mmtris/hcl,ph8.0,10mmspermidine,0.1％tritonx-100)，100μl1m二硫苏糖醇(dtt)，350μl1mmgcl2，180μl25μmdna模板，1ml2mg/mlt7rna聚合酶。37℃水浴中孵育24小时以保证原料完全反应。

(3)rna的纯化

转录反应完成后通过含7m尿素的8％变性聚丙烯酰胺(page)凝胶电泳进行纯化，电泳结束后在紫外灯下切胶得到目标条带。将含有目标rna的条带浸泡于提取缓冲液中(20mmtris-hcl,300mmsodiumacetate,1mmedta,ph7.4)约12小时，收集溶液，通过超滤的方法将rna样品溶解于含10mmmgcl2，10mmtris–hcl，ph8.0，75％氘代的溶液中。65℃下加热5分钟，冰浴30分钟，使trna正确折叠。

(4)rna固体样品的制备

向一定浓度的u-labeledtrna纯品溶液中先加入1/10体积的2mnacl溶液，再加入2-3倍体积的-20℃预冷的75％氘代无水乙醇，将整个体系放置在-20℃的洁净环境中过夜，以9600g离心5min后，弃去上清，用少量70％的预冷乙醇清洗底部沉淀，即可得到rna沉淀。通过上述方法制备大约5mg含¹³c,¹⁵n同位素标记的u碱基的rna纯品，装进1.9mm固体核磁转子中。

2.脉冲序列的设置

2dhchnhssnmr实验在40khz的魔角转速下完成。直接维(f1:1h)，间接维(f2:13c)，在t1演化期和t2采集期分别取了574个点和100个点。¹h的π/2脉冲为2.5μs，¹³c的π/2脉冲为3.5μs，¹⁵n的π/2脉冲为4.5μs。循环等待时间为2s。在¹h-¹³c交叉极化传递和¹³c-¹h交叉极化传递过程中，¹³c的连续锁场功率均为60khz，¹h的锁场功率为100khz，接触时间为2ms。在¹³c化学位移演化期，采用tppm脉冲对¹h去耦，去耦功率10khz。实验中利用missisippi脉冲序列对水的信号进行压制。¹h-¹⁵n交叉极化传递和¹⁵n-¹h交叉极化传递中，cp接触时间设为300μs。¹h-¹⁵n和¹⁵n-¹h传递时¹⁵n的连续锁场功率设为50khz，¹h的锁场功率为90khz。采样叠加200次。

3.谱图收集与结果分析

请参照图4。为了简化谱图信息，本实施例收集了尿嘧啶核糖核苷酸被标记的humantrna^sec(u-labeledtrna)的二维hchnh谱图，结果如图4a所示。在图中既观察到了沃森-克里克碱基配对信息，又观察到了非沃森-克里克碱基配对信息，其中包括参与u-a碱基互补配对时尿嘧啶中h3与c4的交叉峰和h3与c2的交叉峰，以及参与非沃森-克里克碱基配对时尿嘧啶中h3与c4的交叉峰和h3与c2的交叉峰。

此外，本实施例还收集了该rna的2dhcnh谱进行对比(图4b),t1演化期和t2采集期也分别取了574和100个点。在谱图中也可以观察到参与沃森-克里克碱基配对的尿嘧啶中h3和c4的交叉峰、参与沃森-克里克碱基配对的尿嘧啶中h3和c2的交叉峰、参与非沃森-克里克碱基配对的尿嘧啶中h3和c4的交叉峰，但与2dhchnh谱对比发现谱峰强度大幅度降低。非沃森-克里克碱基配对的尿嘧啶中h3和c2的交叉峰由于信号强度很弱未能在谱图中观察到。

为了进一步对比hchnh和hcnh两脉冲的传递效率，收集该rna的1dhchnh¹h谱和1dhcnh¹h谱，并且分别与1dhnh¹h谱进行比较。图4c对比了hchnh¹h谱和1dhnh¹h谱的信号强度，其中hchnh¹h谱的信号强度大约为1dhnh¹h谱的50％。而图4d中1dhcnh¹h谱信号强度仅为1dhnh¹h谱的30％。由此可见，hchnh脉冲序列的设计，大幅度提高了长程¹³c-¹h相关谱的灵敏度。